纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

本方案介绍了通过移植来源于正常成肌祖细胞的外泌体来暂时改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的方法。外泌体移植可改善DMD小鼠的心脏功能，同时伴随受体心脏中肌营养不良蛋白表达的增加。合适的外泌体分离、纯化及心肌内移植方法是实现外泌体移植并改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的关键。

MPC来源的外泌体疗法可能通过外泌体介导的正常抗肌萎缩蛋白mRNA转移来改善骨骼肌功能。本视频将演示外泌体纯化、心肌内注射外泌体以及移植后超声心动图检测的关键技术。超声心动图的演示将由本实验室技术员Yan Shen完成。

开始此实验步骤时，将五百万个C2C12细胞接种至一个15厘米的培养皿中，加入20毫升含10% FBS和抗生素的完全DMEM培养基。在37°C、5% CO₂条件下孵育。接下来，使用摆桶转子在4°C条件下以100,000 × g离心FBS 18小时，以制备无外泌体的培养基。

弃去沉淀，收集上清液。当培养皿中的单层细胞达到80%融合度时，将完全DMEM培养基更换为外泌体耗竭培养基。每48小时使用移液管从细胞培养皿中收集上清液。

以150 × g离心10分钟，以去除残留的细胞。将上清液通过0.22微米滤膜过滤，以清除任何细胞碎片，并将过滤后的上清液转移至超清离心管中。接着，使用水平转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心120分钟，以沉淀外泌体。

将含有外泌体的沉淀重悬于 PBS 中，然后用 PBS 充满整个超清离心管。在 4 摄氏度下，以 100,000 × g 离心 120 分钟，以去除污染蛋白。弃去上清液，并将外泌体沉淀重悬于 100 微升 PBS 中。

置于 -80 摄氏度保存，以备后续使用。首先，将每只麻醉小鼠仰卧位固定于手术平台上，用胶带固定每只肢体。在上齿下方水平放置一根 3-0 缝线，以固定上颌位置。

接下来，将脱毛膏涂抹于小鼠胸部左侧，以去除皮肤上的毛发。使用24号导管经口腔进行气管插管，并利用啮齿类动物呼吸机以每分钟195次呼吸的频率对小鼠进行常温空气通气。

用70%酒精和10%聚维酮碘消毒皮肤。然后从左侧胸骨边缘向左腋窝做10至15毫米的斜切口。使用剪刀剪开胸大肌和胸小肌。

经第四肋间作左侧开胸切口。轻柔插入牵开器带，将胸腔撑开至10毫米宽，注意避免损伤左肺。随后，使用两把直镊子去除心包膜。

将组织拉开，并将其置于牵开器尖端后方以暴露心脏。使用31号胰岛素针头，在左心室前壁的一个部位心肌内注射MPC-Exo或PBS。随后，依次使用6-0尼龙缝线关闭胸腔、胸肌和皮肤。

在 PBS 外泌体移植后的第 2 天，按照文本方案中所述方法对小鼠进行麻醉。使用胶带将小鼠固定于仰卧位，并在左侧胸部区域涂抹预热的超声耦合剂。随后，采用超声心动图评估左心室功能。

获取左心室的胸骨旁长轴二维图像，然后将超声探头旋转90度，获得乳头肌水平的左心室短轴切面。随后，记录M型超声心动图图像，并测量左心室舒张末期内径、左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积以及左心室收缩末期容积。小鼠的心率在心脏功能测量期间应至少维持在400次/分钟。

从C2C12细胞中分离并纯化外泌体后，通过透射电子显微镜分析确认其存在。透射电子显微镜图像显示了来源于C2C12细胞的外泌体呈明亮且圆形的囊泡形态。Western印迹分析证实了外泌体标志物CD63和Tsg101的存在。

在将mdx小鼠左心室前壁进行心肌内注射后，可观察到半透明的水肿区域，表明注射已成功进入心肌组织。随后进行抗肌萎缩蛋白免疫荧光染色，以检测心脏MPC-Exo递送是否能够恢复mdx小鼠心脏中抗肌萎缩蛋白的表达。结果显示部分心肌细胞中抗肌萎缩蛋白表达得到恢复，并在细胞膜上呈现定位分布。

通过超声心动图在心肌内递送两天后测量心脏功能，以确定MPC-Exo移植是否改善了mdx小鼠的心脏功能。与PBS组相比，MPC-Exo治疗显示出改善的心内壁运动，提示MPC-Exo移植改善了mdx小鼠的心脏功能。使用31号胰岛素注射针，针尖角度约为20度，对于将大多数外泌体成功递送至心肌并最大化注射的外泌体与宿主心肌细胞的接触至关重要。

按照该操作步骤，通过免疫荧光染色可检测到肌营养不良蛋白在MPC来源的外泌体注射后的表达，表明心脏MPC来源的外泌体递送能够恢复肌营养不良蛋白的表达。该技术将为携带治疗性遗传物质（包括DNA、mRNA、lncRNA或microRNA）的外泌体治疗心肌病开辟新途径。