Name: 肌源性祖细胞衍生外质细胞的纯化与移植, 改善杜氏肌营养不良性小鼠的心功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解肌源性祖细胞外泌体纯化与心肌内移植技术，用于改善杜氏肌营养不良小鼠心功能并恢复肌营养不良蛋白表达。该方法为DMD心脏病治疗提供新策略。

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Tang 的研究部分得到了美国心脏协会的支持：GRNT31430008、NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354。

动物的处理遵循奥古斯塔大学佐治亚医学院机构动物照护与使用委员会批准的方案及动物福利法规。
1. MPC 来源外泌体的分离与纯化
<ol>
	<li>在15 cm细胞培养皿中接种5 × 106个C2C12细胞，加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的完全杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>使用摆动转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心FBS 18小时，制备无外泌体培养基。弃去沉淀。</li>
	<li>当培养皿中单层细胞达到80%融合度时，将完全DMEM更换为无外泌体培养基。</li>
	<li>使用移液管每48小时收集一次细胞培养皿中的上清液，共收集三次。将上清液收集至50 mL离心管中，并在150 × g条件下离心10分钟，以去除残留细胞。</li>
	<li>通过0.22 μm滤膜过滤上清液以清除细胞碎片。将过滤后的培养基加入超透明离心管中，使用摆动转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心120分钟，使外泌体沉淀。</li>
	<li>将含有外泌体的沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用PBS充满整个超透明离心管。在4 °C条件下以100,000 × g再次超速离心120分钟，以去除污染蛋白。</li>
	<li>弃去上清液，将外泌体沉淀重悬于100 µL PBS中。于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>进行透射电子显微镜分析时，取3 µL外泌体悬液滴加于200目甲醛膜包被的铜网上，室温静置5分钟。随后按标准醋酸铀染色步骤进行染色23。用透射电子显微镜观察半干燥状态的载网。</li>
</ol>
2. 心肌内外泌体递送
注意： 每组使用六只小鼠。
<ol>
	<li>使用腹腔注射（i.p.）100 mg/kg 体重的氯胺酮联合 10 mg/kg 体重的赛拉嗪对 DBA/2J-DMDMDX 小鼠（雄性；年龄 &#62; 10 个月；体重 (BW) &#62; 18 g）进行麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度。</li>
	<li>用胶带将每只小鼠仰卧固定在手术平台上，固定四肢，并在上齿下方水平放置一根 3-0 缝线，以固定上颌。</li>
	<li>将脱毛膏涂抹于小鼠胸部左侧，以去除皮肤上的毛发。</li>
	<li>经口腔使用 24 G 导管进行气管插管，并通过啮齿类动物呼吸机（见材料表）以每分钟 195 次呼吸的频率通入室内空气进行通气。</li>
	<li>使用 75% 酒精和 10% 聚维酮碘对皮肤进行消毒。</li>
	<li>从左侧胸骨边缘至左腋窝做一条 10‒15 mm 的斜切口，用剪刀剪开胸大肌和胸小肌，然后经第四肋间行左侧开胸术。轻柔插入牵开器带，将胸腔撑开至 10 mm 宽度，注意避免损伤左肺。</li>
	<li>使用两把直镊子去除心包膜，将其分开并向后置于牵开器尖端后方，以暴露心脏。使用 31 G 胰岛素针头在左心室前壁的一个位点进行心肌内注射 MPC-Exo（50 μg 溶于 30 µL PBS 中）或 30 µL PBS（作为对照）。</li>
	<li>依次使用 6-0 尼龙缝线缝合胸腔、胸肌和皮肤。</li>
	<li>使小鼠恢复。当出现节律性自主呼吸后，将小鼠从呼吸机上移除并拔管。观察并记录术后小鼠的状态。</li>
</ol>
3. 超声心动图
注意：由一名对实验分组不知情的单一观察者进行超声心动图检查及数据分析。
<ol>
	<li>在 PBS/外泌体移植后两天，使用 1‒2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>用胶带将小鼠固定于仰卧位，并在左侧胸部区域涂抹预热的超声耦合剂。</li>
	<li>按照先前所述方法通过超声心动图评估左心室功能16,24。
	<ol>
		<li>获取左心室（LV）的胸骨旁长轴二维（B 模式）图像，然后将超声探头旋转 90°，在乳头肌水平获取左心室短轴图像。</li>
		<li>记录 M 型超声心动图图像，并测量左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）。 
		注意：缩短分数（FS%）= [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] × 100，左心室射血分数（LVEF%）= [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] ×&#160;100。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫组织化学
<ol>
	<li>在PBS/外泌体移植两天后，麻醉小鼠（参见步骤2.1），切开胸骨以暴露胸腔。解剖下腔静脉，并使用连接5 mL注射器的25 G针头蝴蝶导管，从左心室心尖部先灌注3 mL PBS，随后灌注3 mL 4%多聚甲醛，室温下进行。</li>
	<li>将固定后的心脏组织包埋于石蜡中，并切成5 μm厚的切片。</li>
	<li>在二甲苯中脱蜡，并按以下顺序在乙醇溶液中逐级水化：100%二甲苯（3分钟）、100%二甲苯（3分钟）、100%乙醇（1分钟）、100%乙醇（1分钟）、95%乙醇（1分钟）、80%乙醇（1分钟）、H2O（1分钟）。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在室温下固定组织切片8分钟。</li>
	<li>将切片浸入柠檬酸钠缓冲液（0.01 M，pH 6.0）中，使用抗原修复仪进行抗原修复。</li>
	<li>用含1%聚乙二醇叔辛基苯基醚的PBS溶液在室温下透化处理切片1小时。</li>
	<li>用含5%山羊血清的PBS溶液在室温下封闭切片1小时。</li>
	<li>将切片与稀释的一抗（抗dystrophin抗体）在PBS中（1:100）于4 °C孵育过夜，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>将切片与稀释的二抗（Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG）在PBS中（1:400）于室温孵育45分钟。</li>
	<li>使用自发荧光淬灭试剂盒（见材料表）消除自发荧光。</li>
	<li>使用含DAPI的封片剂（见材料表）封片。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下观察切片。</li>
</ol>

<ol><li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Paediatrics+and+Child+Health%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li>
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</ol>

所有作者声明不存在利益冲突。

分离纯化外泌体的方法对于研究外泌体功能至关重要。一种常见的外泌体分离技术是聚乙二醇（PEG）介导的沉淀法17,18,25。外泌体可在PEG中沉淀，并通过低速离心收集。PEG介导的纯化方法操作简便、成本低廉，且无需任何高级设备，但其外泌体纯度存在担忧，因为其他脂蛋白也可能同时沉淀且难以去除。超滤法是一种基于分子量及排阻尺寸限制的常规外泌体分离方法26。与基于超速离心的分离方法相比，超滤法速度更快，但可能导致大囊泡结构受损。外泌体膜表面存在多种表位，如CD9、CD63和CD8127，这为利用这些表位与磁珠结合的抗体之间的免疫亲和相互作用来分离外泌体提供了替代方法。尽管免疫分离法具有高特异性28，但该技术仅能分离出总外泌体群体中的一个亚群，可能扭曲实验结果。因此，超速离心法似乎更适用于本项外泌体功能研究。
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杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X连锁隐性遗传的进行性神经肌肉疾病，由DMD基因突变及功能性抗肌萎缩蛋白的缺失所致1。抗肌萎缩蛋白主要在骨骼肌和心肌中表达，在平滑肌、内分泌腺和神经元中的表达水平较低2,3。DMD是肌营养不良症中最常见的类型，全球每3,500至5,000名新生男婴中即有1例发病4,5。患者通常表现为进行性肌肉坏死，早年青春期即丧失独立行走能力，并因心力衰竭和呼吸衰竭而在生命第二至第三个十年内死亡6。
扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭是杜氏肌营养不良症（DMD）常见的心血管表现7,8。该疾病目前无法治愈，支持性治疗可能改善症状或延缓心力衰竭的进展，但极难改善心脏功能9,10。
与杜氏肌营养不良症（DMD）患者类似，X连锁肌营养不良（MDX）小鼠缺乏抗肌萎缩蛋白（dystrophin），并表现出心肌病症状11，因此被广泛用于DMD相关心肌病的研究。为了在受损肌肉中恢复抗肌萎缩蛋白的表达，同种异体干细胞治疗已被证明是治疗DMD的有效方法12,13,14。外泌体是由多种细胞类型分泌的30–150 nm膜性囊泡，可通过转运信使RNA（mRNA）和非编码RNA等遗传物质，在细胞间通讯中发挥关键作用15,16,17,18,19,20,21。
我们之前的研究表明，来源于成肌祖细胞（MPC）（如C2C12细胞系）的外泌体可通过直接心脏注射将抗肌萎缩蛋白（dystrophin）mRNA转移至宿主心肌细胞22，提示异体来源的MPC衍生外泌体（MPC-Exo）可在MDX小鼠中短暂恢复杜氏肌营养不良症（DMD）基因的表达。本文重点介绍MPC-Exo的纯化与移植技术。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤光片</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G 导管</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G 胰岛素注射针头</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>NDC Pro Advantage</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌溶液</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>抗肌营养不良蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复剂&amp;nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td>抗原修复</td></tr><tr><td>自发荧光淬灭试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip 高温电灼器</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>蔡司 780 直立共聚焦显微镜</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的封片剂&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>小鼠牵开器套装</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇叔辛基苯基醚</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物呼吸机</td><td>哈佛仪器公司</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti 转子</td><td>贝克曼</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 成像平台</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>超声系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>超清晰管</td><td>贝克曼</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（XylaMed）</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种由功能性抗肌萎缩蛋白缺失引起的X连锁隐性遗传病。该疾病目前无法治愈，随着病情进展，患者会出现扩张型心肌病、心律失常和充血性心力衰竭等症状。DMDMDX突变小鼠不表达抗肌萎缩蛋白，常被用作DMD的小鼠模型。在我们最近的研究中，观察到心肌内注射野生型（WT）肌源性前体细胞来源的外泌体（MPC-Exo）可短暂恢复DMDMDX突变小鼠心肌中抗肌萎缩蛋白的表达，并伴随心脏功能的短暂改善，提示WT-MPC-Exo可能为缓解DMD心脏症状提供一种治疗选择。本文描述了MPC-Exo的纯化及其移植至DMDMDX突变小鼠心脏的技术方法。

从C2C12细胞中分离和纯化外泌体的流程图见图1A。为确认外泌体的存在，我们进行了透射电子显微镜分析。透射电子显微镜图像（图1B）显示了来源于C2C12细胞的外泌体呈明亮、圆形的囊泡形态。Western印迹分析证实了外泌体标志物CD63和TSG101的存在（图1C）。
在将PBS/MPC-外泌体注射到MDX小鼠左心室前壁后，我们观察到一个半透明的水肿区域（图2），表明已成功将液体注入心肌组织。
为了确定心肌祖细胞外泌体（MPC-Exo）递送是否能够恢复MDX小鼠心脏中抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，我们对抗肌萎缩蛋白进行了免疫荧光染色，并使用共聚焦显微镜成像。我们观察到部分心肌细...

本文介绍了一种通过移植来源于正常肌源性前体细胞的外泌体， transiently 改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的实验方案。

杜氏肌营养不良症（Duchene Muscular Dystrophy, DMD）是一种由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）功能缺失引起的X连锁隐性遗传病。该疾病目前无法治愈，……

本方案介绍了通过移植来源于正常成肌祖细胞的外泌体来暂时改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的方法。外泌体移植可改善DMD小鼠的心脏功能，同时伴随受体心脏中肌营养不良蛋白表达的增加。合适的外泌体分离、纯化及心肌内移植方法是实现外泌体移植并改善杜氏肌营养不良小鼠心脏功能的关键。MPC来源的外泌体疗法可能通过外泌体介导的正常抗肌萎缩蛋白mRNA转移来改善骨骼肌功能。本视频将演示外泌体纯化、心肌内注射外泌体以及移植后超声心动图检测的关键技术。超声心动图的演示将由本实验室技术员Yan Shen完成。开始此实验步骤时，将五百万个C2C12细胞接种至一个15厘米的培养皿中，加入20毫升含10% FBS和抗生素的完全DMEM培养基。在37°C、5% CO₂条件下孵育。接下来，使用摆桶转子在4°C条件下以100,000 × g离心FBS 18小时，以制备无外泌体的培养基。弃去沉淀，收集上清液。当培养皿中的单层细胞达到80%融合度时，将完全DMEM培养基更换为外泌体耗竭培养基。每48小时使用移液管从细胞培养皿中收集上清液。以150 × g离心10分钟，以去除残留的细胞。将上清液通过0.22微米滤膜过滤，以清除任何细胞碎片，并将过滤后的上清液转移至超清离心管中。接着，使用水平转子在4 °C条件下以100,000 × g超速离心120分钟，以沉淀外泌体。将含有外泌体的沉淀重悬于 PBS 中，然后用 PBS 充满整个超清离心管。在 4 摄氏度下，以 100,000 × g 离心 120 分钟，以去除污染蛋白。弃去上清液，并将外泌体沉淀重悬于 100 微升 PBS 中。置于 -80 摄氏度保存，以备后续使用。首先，将每只麻醉小鼠仰卧位固定于手术平台上，用胶带固定每只肢体。在上齿下方水平放置一根 3-0 缝线，以固定上颌位置。接下来，将脱毛膏涂抹于小鼠胸部左侧，以去除皮肤上的毛发。使用24号导管经口腔进行气管插管，并利用啮齿类动物呼吸机以每分钟195次呼吸的频率对小鼠进行常温空气通气。用70%酒精和10%聚维酮碘消毒皮肤。然后从左侧胸骨边缘向左腋窝做10至15毫米的斜切口。使用剪刀剪开胸大肌和胸小肌。经第四肋间作左侧开胸切口。轻柔插入牵开器带，将胸腔撑开至10毫米宽，注意避免损伤左肺。随后，使用两把直镊子去除心包膜。将组织拉开，并将其置于牵开器尖端后方以暴露心脏。使用31号胰岛素针头，在左心室前壁的一个部位心肌内注射MPC-Exo或PBS。随后，依次使用6-0尼龙缝线关闭胸腔、胸肌和皮肤。在 PBS 外泌体移植后的第 2 天，按照文本方案中所述方法对小鼠进行麻醉。使用胶带将小鼠固定于仰卧位，并在左侧胸部区域涂抹预热的超声耦合剂。随后，采用超声心动图评估左心室功能。获取左心室的胸骨旁长轴二维图像，然后将超声探头旋转90度，获得乳头肌水平的左心室短轴切面。随后，记录M型超声心动图图像，并测量左心室舒张末期内径、左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积以及左心室收缩末期容积。小鼠的心率在心脏功能测量期间应至少维持在400次/分钟。从C2C12细胞中分离并纯化外泌体后，通过透射电子显微镜分析确认其存在。透射电子显微镜图像显示了来源于C2C12细胞的外泌体呈明亮且圆形的囊泡形态。Western印迹分析证实了外泌体标志物CD63和Tsg101的存在。在将mdx小鼠左心室前壁进行心肌内注射后，可观察到半透明的水肿区域，表明注射已成功进入心肌组织。随后进行抗肌萎缩蛋白免疫荧光染色，以检测心脏MPC-Exo递送是否能够恢复mdx小鼠心脏中抗肌萎缩蛋白的表达。结果显示部分心肌细胞中抗肌萎缩蛋白表达得到恢复，并在细胞膜上呈现定位分布。通过超声心动图在心肌内递送两天后测量心脏功能，以确定MPC-Exo移植是否改善了mdx小鼠的心脏功能。与PBS组相比，MPC-Exo治疗显示出改善的心内壁运动，提示MPC-Exo移植改善了mdx小鼠的心脏功能。使用31号胰岛素注射针，针尖角度约为20度，对于将大多数外泌体成功递送至心肌并最大化注射的外泌体与宿主心肌细胞的接触至关重要。按照该操作步骤，通过免疫荧光染色可检测到肌营养不良蛋白在MPC来源的外泌体注射后的表达，表明心脏MPC来源的外泌体递送能够恢复肌营养不良蛋白的表达。该技术将为携带治疗性遗传物质（包括DNA、mRNA、lncRNA或microRNA）的外泌体治疗心肌病开辟新途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

肌源性祖细胞衍生外质细胞的纯化与移植, 改善杜氏肌营养不良性小鼠的心功能

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。...

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。...

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

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腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

本文介绍了一种基于Cas9的外显子23缺失方案，用于在源自Dmdmdx小鼠皮肤成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPSC）中恢复抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的表达，并利用Tet-on...

利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

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在免疫缺陷小鼠中进行人骨骼肌异种移植

本文介绍了一种利用MYOD1转分化的尿液来源细胞高效构建杜氏肌营养不良症肌肉模型的详细方案，用于评估外显子跳跃后抗肌萎缩蛋白mRNA和蛋白水平的恢复情况。...

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本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

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超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

了解肌源性祖细胞外泌体纯化与心肌内移植技术，用于改善杜氏肌营养不良小鼠心功能并恢复肌营养不良蛋白表达。该方法为DMD心脏病治疗提供新策略。

纯化并移植源自成肌祖细胞的外泌体以改善杜氏肌营养不良小鼠的心脏功能

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