Name: 利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 了解利用PiggyBac转座子系统将人诱导多能干细胞快速分化为功能性脊柱和颅内运动神经元的方法。该技术可简化肌萎缩侧索硬化症等运动神经元疾病的药物筛选流程，无需纯化步骤即可获得高纯度细胞群体，为神经科学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢意大利技术研究院生命纳米科学中心成像平台提供的支持与技术指导。我们感谢生命纳米科学中心成员的有益讨论。本研究部分得到了AriSLA基金会（2016年试点项目资助）的资助。 &#34;StressFUS&#34;) 至 AR。

1. 人iPSC的维持
<ol>
	<li>基质包被培养板的制备
	<ol>
		<li>将一管5 mL的基质（见材料表）在4 °C下过夜解冻。原始基质库存浓度各不相同，需根据每批次数据表上标明的稀释倍数进行分装。为防止基质提前凝胶化，操作过程中必须始终保持管子和离心管处于冰上低温状态。在预冷的冻存管中于冰上分装基质。未使用的分装样品应于-20 °C冷冻保存。</li>
		<li>取一份分装样品置于冰上约2小时，使其缓慢解冻。</li>
		<li>在50 mL锥形离心管中，用20 mL冷的DMEM/F12稀释该份基质。</li>
		<li>充分混匀后，将1 mL稀释后的基质加入35 mm培养皿中（其他规格培养皿按相同表面积比例加入相应体积）。</li>
		<li>将含有稀释基质的培养皿在室温放置1小时，以完成包被。 
		注意：用封口膜密封的培养皿可在4 °C保存最多2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>温和细胞解离试剂的储存液（20 mL）及1x工作液分装的制备（见材料表）。
	<ol>
		<li>将粉末溶于PBS（无Ca2+/Mg2+）中，配制成10 mg/mL的溶液。</li>
		<li>使用0.22 μm滤膜过滤除菌。</li>
		<li>分装成20份（每份1 mL），于-20 °C保存。</li>
		<li>使用前，取一份分装样品用PBS（无Ca2+/Mg2+）稀释至1 mg/mL（即1x工作液）。 
		注意：1x工作液可在4 °C保存最多2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人iPSC的传代。
	<ol>
		<li>开始前准备：若基质包被培养板储存在4 °C，需将其在37 °C培养箱中预热20–30分钟。将所需量的人iPSC培养基（见材料表）在室温预热。同时预热DMEM/F12。</li>
		<li>吸除培养基。</li>
		<li>用PBS（无Ca2+/Mg2+）冲洗iPSC。</li>
		<li>加入1x温和解离溶液（35 mm培养皿加0.5 mL），在37 °C孵育，直至克隆边缘开始从培养皿脱离，通常为3–5分钟。</li>
		<li>小心吸除温和解离溶液，注意避免将iPSC克隆完全脱离。</li>
		<li>用DMEM/F12（35 mm培养皿加2 mL）洗涤细胞一次，并小心吸除，避免细胞脱落。重复此步骤一次。</li>
		<li>加入人iPSC培养基（35 mm培养皿加1 mL）。</li>
		<li>用细胞刮轻轻将克隆刮下，并转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>用P1000移液器轻柔吹打3–4次，使细胞团块分散。</li>
		<li>吸除基质包被培养板中的上清液。</li>
		<li>将细胞以适当体积的人iPSC培养基重新接种。传代比例因细胞系而异，通常为1:4至1:8。每日更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生成可诱导的NIL和NIP iPSC细胞系
<ol>
	<li>细胞转染。
	<ol>
		<li>用PBS（无Ca2+/Mg2+）清洗细胞。</li>
		<li>加入细胞解离试剂（见材料表）（35 mm培养皿加0.35 mL），在37 °C孵育至细胞完全分散为单细胞（5–10分钟）。</li>
		<li>用P1000移液器轻轻吹打3–4次，完成细胞的彻底分离。</li>
		<li>将细胞收集至15 mL离心管中，加入PBS（无Ca2+/Mg2+）至10 mL，计数细胞。</li>
		<li>离心收集106个细胞，重悬于100 μL缓冲液R中（包含在细胞电穿孔试剂盒中，见材料表）。</li>
		<li>加入用于转染的质粒DNA：4.5 μg转座载体（epB-Bsd-TT-NIL或epB-Bsd-TT-NIP12）和0.5 μg piggyBac转座酶质粒13。</li>
		<li>使用细胞电穿孔系统（见材料表）进行转染，按照制造商说明书及先前描述的方法3设置以下参数：电压1,200 V，脉冲宽度30 ms，单次脉冲。将细胞接种于添加了10 μM Y-27632（ROCK抑制剂，见材料表）的人iPSC培养基中，培养皿为6 mm基质包被皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗生素筛选。
	<ol>
		<li>转染后两天，向培养基中加入5 μg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）。</li>
		<li>大多数未转染的细胞将在杀稻瘟菌素筛选48小时内死亡。持续使用杀稻瘟菌素至少7–10天，以淘汰未将转基因整合入基因组的细胞。</li>
		<li>将稳定转染的细胞作为混合群体维持培养（包含不同数量转基因及不同整合位点的细胞），或分离单克隆细胞株。</li>
		<li>准备额外的培养皿，通过RT-PCR检测转基因在1 μg/mL多西环素诱导下的有效表达情况，使用针对Ngn2的特异性引物（正向：TATGCACCTCACCTCCCCATAG；反向：GAAGGGAGGAGGGCTCGACT），方法如前所述12。</li>
		<li>在此阶段，将新构建的NIL-iPSC和NIP-iPSC细胞系使用人iPSC冻存液（见材料表）冻存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 运动神经元分化
<ol>
	<li>按照前述方法（步骤 2.1.1.–2.1.3.）使用细胞解离试剂解离细胞。将解离后的细胞收集至 15 mL 离心管中，并用 5 倍体积的 DMEM/F12 稀释。离心收集细胞，重悬于添加了 10 μM ROCK 抑制剂的人源 iPSC 培养基中。计数细胞后，以 62,500 个细胞/cm2 的密度接种于基质包被的培养皿中。</li>
	<li>次日，更换为 DMEM/F12 培养基，其中添加 1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× 非必需氨基酸（NEAA）细胞培养添加剂和 0.5× 青霉素/链霉素，并含有 1 μg/mL 多西环素。此日记为分化第 0 天。在第 1 天更换培养基和多西环素。</li>
	<li>第 2 天，更换为 Neurobasal/B27 培养基（Neurobasal 培养基添加 1× B27、1× 稳定型 L-谷氨酰胺类似物、1× NEAA 和 0.5× 青霉素/链霉素），并加入 5 μM DAPT、4 μM SU5402 和 1 μg/mL 多西环素（见材料表）。此后每天更换培养基和多西环素，直至第 5 天。</li>
	<li>第 5 天：使用细胞解离试剂进行细胞解离（见材料表）。
	<ol>
		<li>用不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>加入细胞解离试剂（35 mm 培养皿加 0.35 mL），于 37 °C 孵育，直至整个细胞单层从培养皿脱离。注意：孵育过程中不会形成单细胞悬液。</li>
		<li>加入 1 mL DMEM/F12，将细胞收集至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>使用 P1000 移液器轻柔吹打 10–15 次，完成细胞的进一步解离。</li>
		<li>加入 4 mL DMEM/F12，计数细胞。</li>
		<li>此阶段可根据制造商说明，将运动神经元前体细胞冻存于细胞冻存液中（见材料表）。</li>
		<li>离心收集细胞，重悬于神经元培养基（Neurobasal/B27 培养基添加 20&#8239;ng/mL BDNF、10&#8239;ng/mL GDNF 和 200&#8239;ng/mL L-抗坏血酸，见材料表）中，并补充 10 μM ROCK 抑制剂。</li>
		<li>以 100,000 个细胞/cm2 的密度将细胞接种于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被或替代性基质包被的培养表面。如需进行免疫染色分析，建议使用带有聚合物盖玻片的 µ-Slide 塑料培养载片（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 6 天，更换为新鲜的不含 ROCK 抑制剂的神经元培养基。此后每 3 天更换一半培养基。更换培养基时必须格外小心，以防止细胞从培养表面脱落。</li>
</ol>
4. 免疫染色分析
<ol>
	<li>细胞固定。用 PBS（含 Ca2+/Mg2+）清洗细胞，然后在室温下用含 Ca2+/Mg2+ 的 4% 多聚甲醛溶液孵育 15 分钟。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，且可能致癌。避免接触皮肤和眼睛，应在化学通风橱中操作。</li>
	<li>在室温下用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（含 Ca2+/Mg2+）处理 5 分钟以进行透化。</li>
	<li>在抗体封闭液（ABS：含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 中含 3% BSA）中室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>在抗体封闭液（ABS）中加入一抗，室温孵育 1 小时：抗 TUJ1 抗体（1:1000；兔源）和抗 Oct4 抗体（1:200；小鼠源）或抗 CHAT 抗体（抗胆碱乙酰转移酶；1:150；山羊源）。参见 材料表。</li>
	<li>在抗体封闭液（ABS）中加入适当的驴源二抗组合，室温孵育 45 分钟：抗小鼠 Alexa Fluor 647（1:250）、抗兔 Alexa Fluor 594（1:250）和抗山羊 Alexa Fluor 488（1:250）。参见 材料表。</li>
	<li>加入 0.4 μg/mL 的 DAPI，室温孵育 5 分钟，以标记细胞核。</li>
	<li>使用封片剂（见 材料表）封片，用于荧光显微镜成像。</li>
</ol>
5. 通过膜片钳记录进行功能表征
<ol>
	<li>配制HEPES平衡的外部溶液（NES），配方如下：140 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。将渗透压调节至290–300 mΩ之间，用1N NaOH将pH值调至7.3，并将溶液储存在4 °C。</li>
	<li>配制内部溶液：140 mM K-葡萄糖酸盐、2 mM NaCl、5 mM BAPTA、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、2 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GTP。用1M KOH将pH值调至7.3，并确认渗透压约为290 mΩ。将溶液分装后于-20 °C冷冻保存。</li>
	<li>实验开始前，将NES溶液在水浴中预热至约28–30 °C。</li>
	<li>拉制若干硼硅酸盐玻璃微电极（内径0.86 mm，外径1.5 mm），使其尖端电阻为5–6 MΩ，并在装入电极夹持器前用细胞内溶液灌注电极。 
	注意：请务必在漂白剂中对记录电极和参比电极的银丝进行氯化处理至少30分钟，以在金属丝表面形成均匀的AgCl层。</li>
	<li>将培养皿转移至记录室，并以1–2 mL/min的速度向记录室中持续灌流NES溶液。让液体流经一个设定温度为30 °C的在线加热器，以维持溶液温度。</li>
	<li>将电生理记录室置于直立显微镜下，使用膜片钳放大器记录膜电流，并通过适当的软件采集数据。</li>
	<li>打开放大器控制软件，将信号增益设为1，贝塞尔滤波器设为10 kHz。确保贝塞尔滤波器的截止频率为采样频率的2.5倍以下。</li>
	<li>在记录软件中设置电压钳和电流钳实验的实验程序。</li>
	<li>在程序设置中，选择“间歇刺激模式”，并将采样频率设为25 kHz。然后切换到波形选项卡，输入电压或电流阶跃的幅度和持续时间，如下所述。</li>
	<li>对于电压门控钠电流，使用15个电压阶跃（每个持续50 ms），从-100 mV逐步增加至+40 mV（步长10 mV）。通过放大器将被记录细胞钳制在-60 mV的保持电位后运行该程序。类似地，电压门控钾电流通过电压阶跃（每个持续250 ms）从-30 mV至+50 mV（步长10 mV）诱发，同时将记录细胞保持在-40 mV的膜电位。</li>
	<li>为研究诱导多能干细胞（iPSC）来源的颅部和脊髓运动神经元的放电特性，将细胞在电流钳模式下钳制在-70 mV的膜电位，并施加4个持续1秒、幅度递增的电流脉冲（从+20 pA至+80 pA，步长20 pA）。</li>
	<li>对每个细胞采集电压激活电流、诱发的放电活动，以及三个被动电生理特性：全细胞电容（Cm）、细胞膜电阻（Rm）和静息膜电位（RMP）。</li>
</ol>

<ol><li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+%28iPSCs%29+derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li>
<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+journal+of+rare+diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS%2Fdementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960(2016).</li>
<li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
<li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells%2C+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons%2C+Skeletal+Myocytes%2C+and+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li>
<li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

该方案通过异位表达谱系特异性转录因子，可高效地将人iPSCs转化为脊髓和颅脑运动神经元。这些转基因通过多西环素诱导，并借助基于piggyBac转座子的载体稳定整合至基因组中。在混合细胞群体中，piggyBac载体的一个或多个拷贝会随机插入单个细胞的基因组，从而增加基因组完整性受损的风险。此外，随着时间推移，可能逐渐发生iPSC亚克隆的选择性扩增，进而影响分化过程以及疾病组与对照组细胞系之间的比较分析。因此，采用本方案获得的iPSC来源的运动神经元不适合用于再生医学。然而，该方法在体外运动神经元疾病建模方面可能具有重要应用价值。本方法的主要优势包括培养条件极为简化、运动神经元转化速度快、iPSC来源的运动神经元成熟度高，以及能够同时获得脊髓和颅脑运动神经元，后者已通过特异性标记基因表达分析得到证实12该方案的稳健性通过其可重复性得到验证。迄今为止，我们已成功应用该方案超过30次，用于脊髓和/或颅脑运动神经元的生成，并通过标志物分析和/或功能分析评估了实验结果。我们已成功将运动神经元培养物维持长达两个月，未见明显活力下降。此外，一旦获得稳定转导的iPSC细胞系，每次实验均可通过多西环素诱导启动...

运动神经元（MN）的变性在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等人类疾病中起着致病作用。建立能够重现人类运动神经元复杂性的合适体外细胞模型系统，是开发新型治疗策略的重要一步。目前，已从多种运动神经元疾病患者中成功获得具有强大多向分化潜能的诱导性多能干细胞（iPSCs）1，2。此外，通过基因编辑技术，研究人员已从对照的&#34;健康"多能干细胞出发，构建了携带与运动神经元疾病相关致病突变的iPSC细胞系3。这些细胞系是体外疾病建模和药物筛选的有力工具，前提是具备合适的将iPSC定向分化为运动神经元的方法。本方法的开发旨在为关注运动神经元疾病研究的科学界提供一种快速且高效的分化方案，以获得成熟且具有功能的运动神经元。该方法的首要优势在于其较短的操作时间。另一重要优势在于无需任何细胞纯化步骤。最后，该方案可用于生成两种不同的运动神经元群体。
生成不同亚型运动神经元（MNs）的可能性对于运动神经元疾病的建模尤为重要。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）中，并非所有运动神经元亚型的易损性均相同，不同运动单位症状的起始情况极大地影响着预后。在ALS中，若症状起始于四肢（脊髓型），患者通常在约3-5&#8239;年内死亡4。相反，若为延髓起始型（起始于颅脑运动神经元的退化），其预后更差。此外，携带RNA结合蛋白FUS和TDP-43突变的患者中，延髓起始型所占比例显著高于SOD1突变个体5。几乎所有其他运动神经元定向分化方案都依赖于视黄酸（RA）的作用，该因子赋予分化中的诱导多能干细胞（iPSCs）脊髓特性6,7,8。这限制了研究某些内在保护性因素的可能性，而这些因素可能在特定运动神经元亚型中发挥保护作用9,10。
与之前在小鼠胚胎干细胞中的研究一致11，我们近期研究表明，在人诱导多能干细胞（iPSCs）中异位表达 Ngn2、Isl1 和 Lhx3（NIL）可诱导产生脊髓运动神经元（MN）特性，而 Ngn2 和 Isl1 联合 Phox2a（NIP）则可指定脑神经运动神经元12。因此，我们开发了一种高效方案，可在12天内快速生成具有功能特性的人大运动神经元。该方法的目的是在短时间内获得高度富集的、具有脊髓或颅脑特性的运动神经元细胞群，且无需进行纯化步骤（例如通过流式细胞分选术FACS）。

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&amp;nbsp;</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>抗-CHAT</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>AB144P</td><td>抗胆碱乙酰转移酶。免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_2079751；批号：2971003</td></tr><tr><td>抗山羊 Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>A11055</td><td>用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_2534102；批号：1915848</td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa Fluor 647</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>A31571</td><td>用于免疫荧光检测的二抗。RRID: AB_162542；批号：1757130</td></tr><tr><td>抗Oct4&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>611202</td><td>免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_398736；批号：5233722</td></tr><tr><td>抗-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>免疫染色实验中使用的一抗。批号：E0117</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa Fluor 594&amp;nbsp;</td><td>免疫学科学</td><td>IS-20152-1</td><td>用于免疫荧光检测的二抗</td></tr><tr><td>抗-TUJ1&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T2200</td><td>免疫染色实验中使用的一抗。RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>用于神经元细胞维持的无血清添加剂</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>用于运动神经元前体细胞的细胞冻存液</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>脑源性神经营养因子</td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>抑制原核生物和真核生物蛋白质合成的核苷类抗生素</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>牛血清白蛋白。用于免疫染色实验中防止抗体非特异性结合的封闭剂</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>Clampex 10 软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10</td><td>膜电流记录系统</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-合格基质</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中重建的基底膜基质。用于诱导多能干细胞（iPSC）在塑料和玻璃载体上的黏附</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF 冻存培养基</td><td>生物工业公司</td><td>05-710-1E</td><td>人诱导多能干细胞冻存培养基</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>DAPI 粉末</td><td>罗氏</td><td>10236276001</td><td>4&amp;prime;，6-二脒基-2-苯基吲哚。一种可与腺嘌呤结合的荧光染料&amp;ndash;DNA中富含胸腺嘧啶的区域，用于免疫荧光检测中的细胞核染色</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>γ-分泌酶抑制剂</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>用于温和解离人iPSC的试剂</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>细胞培养基础培养基</td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G&amp;nbsp;</td><td>用于诱导 epB-Bsd-TT-NIL 和 epB-Bsd-TT-NIP 载体中转基因的表达</td></tr><tr><td>DS2U&amp;nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>商用人类iPSC细胞系</td></tr><tr><td>E.Z.N.A 总RNA试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>用于培养的真核细胞总RNA提取的试剂盒</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>胶质细胞源性神经营养因子</td></tr><tr><td>Gibco 附加体质粒 hiPSC 细胞系</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A18945</td><td>商用人类iPSC细胞系</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050038</td><td>一种比L-谷氨酰胺更稳定的替代物，可改善细胞健康。</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>用于RT-qPCR的iScript反转录超级混合液&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1708841</td><td>用于实时定量 PCR 的基因表达分析试剂盒</td></tr><tr><td>iTaq™ Universal SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&amp;nbsp;</td><td>即用型反应预混液，专为基于染料的定量PCR（qPCR）优化，适用于任何实时PCR仪器</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>在细胞培养中用作抗氧化剂</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>促进神经细胞在体外的贴附和生长</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;iX83 FluoView1200</td><td>用于免疫染色图像采集的共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>封片剂&amp;nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>用于共聚焦显微镜和免疫荧光实验的封片液</td></tr><tr><td>多钳制膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>700B</td><td>膜电流记录系统</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>电生理溶液用化学品</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140035</td><td>非必需氨基酸。用作细胞培养基的补充剂，以促进细胞生长并提高细胞存活率。</td></tr><tr><td>Neon 100 &amp;mu;L 型试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK10096</td><td>细胞电穿孔试剂盒</td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK5000</td><td>细胞电穿孔系统</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td>专为长期维持和成熟神经元细胞群体而设计的基础培养基，无需使用星形胶质细胞饲养层</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&amp;nbsp;</td><td>生物工业公司</td><td>05-100-1A</td><td>人iPSC培养基</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>157-8</td><td>用于免疫染色实验中的细胞固定</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>含钙、含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 自由</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>不含钙、不含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>用于防止细胞培养中细菌污染的青霉素/链霉素溶液。</td></tr><tr><td>多聚鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>促进神经细胞在体外的贴附和生长</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）选择性抑制剂</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，&amp;nbsp;辛基苯基聚乙二醇，聚乙二醇&amp;nbsp;叔辛基苯基醚。用于免疫染色实验中的细胞通透化</td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>用于电生理记录的显微镜，配备 CoolSnap Myo 相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp; （ROCK抑制剂）</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-333-M005&amp;nbsp;</td><td>细胞通透性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）选择性抑制剂。可提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率</td></tr><tr><td>&amp;mu;-第8孔&amp;nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>高支持&amp;ndash;固定细胞的显微分析</td></tr></tbody></table>

利用piggybac载体将人诱导性多能干细胞（ipscs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

本文介绍一种从人诱导性多能干细胞（iPSCs）获得功能性脊髓和颅脑运动神经元的方法。通过异位表达特定的转录因子组合模块，即可实现向运动神经元的直接转化，这些模块分别为 Ngn2、Isl1 和 Lhx3（NIL）或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a（NIP）。NIL 和 NIP 分别决定脊髓和颅脑运动神经元的身份特征。本方案首先构建经改造的 iPSC 细胞系，使 NIL 或 NIP 模块通过 piggyBac 转座子载体稳定整合至基因组中。随后通过多西环素诱导转基因表达，可在 5 天内将 iPSC 转化为运动神经元前体细胞。再经过 7 天的进一步成熟培养，即可获得高度均一的脊髓或颅脑运动神经元群体。与以往方案相比，本方法具有多项优势：操作极为快速简便；无需病毒转染或后续的运动神经元分离步骤；能够生成不同亚型的运动神经元（脊髓型与颅脑型），且成熟度显著，表现为可产生成簇的动作电位。此外，可在无需从混合细胞群中纯化的条件下获得大量运动神经元。由 iPSC 分化而来的脊髓和颅脑运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症及其他运动神经元变性疾病的体外建模研究。均一的运动神经元群体可能成为细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

分化方法的示意图见图1。将人iPSCs（WT I系3）转染epB-Bsd-TT-NIL或epB-Bsd-TT-NIP，经杀稻瘟菌素筛选后获得稳定且可诱导的细胞系12，下文分别称为iPSC-NIL和iPSC-NIP。对分化细胞进行多能性标志物OCT4和泛神经元标志物TUJ1的表达分析。免疫染色结果显示，在第0天，所有细胞均表达OCT4，而无TUJ1阳性信号（图2A）。第3天时，OCT4阳性细胞数量显著减少，同时部分正在分化的iPSCs开始表达TUJ1（图2B）。至第5天，细胞群体中已检测不到OCT4表达，而TUJ1表达一致阳性，并呈现出神经元形态（图2C）。随后将运动神经元前体细胞解离并重新接种，以进一步成熟...

本方案通过可诱导的piggyBac载体异位表达转录因子，可快速高效地将诱导性多能干细胞转化为具有脊髓或颅脑特征的运动神经元。

利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

本文介绍了一种从人诱导性多能干细胞（iPSCs）获得功能性脊髓和颅脑运动神经元的方法。通过直接转化……

生成不同亚型运动神经元的可能性对于模拟现代运动神经元疾病（如肌萎缩侧索硬化症）具有重要意义。该方法可在短时间内获得具有脊髓或颅脑特征、高度特异性的运动神经元细胞群体，且无需进行纯化步骤。在简化的培养条件下，由诱导性多能干细胞（iPSC）生成人类运动神经元，可能有助于推动针对运动神经元疾病的药物筛选。 通过诱导表达编程性转录因子，可从诱导性多能干细胞（iPSC）库中生成其他细胞类型，例如神经元、骨骼肌细胞和胶质细胞。在生成NIL和NIP iPSC细胞系时，先用不含钙和镁的PBS冲洗人iPSC培养物，然后在37摄氏度下用细胞解离试剂处理细胞5至10分钟。当细胞开始从培养容器上脱离时，使用P1000移液器轻轻手动吹打细胞3至4次，以实现解离。将细胞转移至15毫升离心管中，加入不含钙和镁的新鲜PBS，调节终体积至10毫升，用于细胞计数。通过离心收集1×10⁶个细胞，并将细胞沉淀重悬于电穿孔试剂盒的缓冲液R中，体积为100微升。加入4.5微克转座子载体质粒DNA和0.5微克piggyBac转座酶质粒DNA进行转染。根据制造商的说明，使用指定参数通过细胞电穿孔系统进行转染。随后，将细胞接种于添加了10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632的人iPSC培养基中，培养皿为6毫米基质包被皿。转染后两天，向培养基中加入5微克/毫升杀稻瘟菌素，使细胞持续暴露于该抗生素中至少7至10天，以消除未整合外源基因的细胞。孵育结束后，将稳定转染的细胞作为混合群体进行维持，该群体由含有不同数量转基因和不同整合位点的细胞组成，或分离单克隆。另准备一培养皿，通过每微克/毫升多西环素诱导，以评估转基因的有效表达，并使用针对神经原性基因-2的转基因特异性引物通过RT-PCR进行检测，方法如前所述。在此阶段，还应将新型NIL和NIP诱导多能干细胞（iPSC）系的储备样本使用人iPSC冻存液进行冻存。对于运动神经元分化，使用解离试剂将稳定转染的细胞培养物进行解离，以便将细胞收集至含有五倍体积DMEM/F12培养基的15毫升离心管中。离心后，将细胞重悬于添加了微摩尔浓度ROCK抑制剂的人iPSC培养基中进行计数。将细胞以每平方厘米6.25×10⁴个细胞的密度接种于基质包被的培养皿中。接下来两天，将上清液更换为添加了多西环素的新鲜分化培养基。第二天，将培养基更换为添加了γ-分泌酶抑制剂、血管内皮生长因子受体抑制剂和多西环素的Neurobasal B27培养基。第五天，按所示方法消化细胞，并将脱落的细胞重悬于4 mL DMEM/F12培养基中进行计数。移液对于细胞的完全解离至关重要。根据制造商说明书，使用细胞冻存液将一份等量的运动神经元前体细胞冻存，并通过离心收集其余细胞。将沉淀重悬于添加了10 µM ROCK抑制剂的神经元培养基中。将细胞以每平方厘米1×10⁵个细胞的密度接种于多聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的微型载玻片支持物上，并加盖聚合物盖玻片。第6天时，小心更换为新鲜的神经元培养基，不添加抑制剂，继续培养至后续分析，期间避免细胞从支持物表面脱落。在第0天的分化细胞培养物中，可观察到多能性标志物八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）呈均匀表达，而泛神经元标志物神经元特异性Ⅲ类β-微管蛋白（neuron-specific class Ⅲ β-tubulin，TUJ1）呈阴性。第3天时，OCT4阳性细胞数量显著减少，这一现象在部分正在分化的iPSC中表现为TUJ1的表达。到第5天，细胞群体中已无OCT4表达，同时TUJ1表达持续存在，并呈现出神经元样形态。运动神经元前体细胞重铺后七天的免疫染色分析显示，TUJ1和成熟运动神经元标志物胆碱乙酰转移酶均呈均匀表达。由iPSC NIL衍生的神经元成功表现出电压依赖性钠电流和电压依赖性钾电流。在电流钳模式下，80%的iPSC NIL来源的运动神经元在注入+60皮安或更强的电流脉冲时能够产生动作电位串。在记录的细胞中，引发超过50%细胞产生重复性放电所需的最小电流为+40皮安，峰电位阈值约为-38毫伏，在+40皮安电流下的平均放电频率约为8赫兹，表明由iPSC NIL衍生的脊髓运动神经元具有成熟神经元典型的功能特性。脊髓和颅脑运动神经元可由受控的iPSC或携带致病性突变的iPSC衍生获得，这些细胞可用于构建疾病模型或进行药物筛选。我们的方法有助于理解为何ALS（肌萎缩侧索硬化症）对不同的运动神经元单元产生差异性影响。

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。...

利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

PiggyBac 转座子介导的人类iPSC基因编辑：利用PiggyBac转座子系统在人类iPSC中整合目的基因的实验方案

本视频展示了将人iPSCs分化为运动神经元的过程。其原理是利用经过基因改造、可表达特定转录因子的iPSCs。当在含有多西环素的培养基中培养时，该抗生素会诱导转录因子的表达，从而促进iPSCs向运动神经元前体细胞分化。最终，将这些前体细胞在神经元培养基中培养，以获得成熟且具有功能的运动神经元。...

将基因编辑的人诱导多能干细胞分化为功能性运动神经元

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本文介绍了一种在台式3D悬浮生物反应器中生成人诱导性多能干细胞来源神经元的实验方案。...

在三维悬浮生物反应器中生成人源神经原性因子2可诱导神经元

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

了解利用PiggyBac转座子系统将人诱导多能干细胞快速分化为功能性脊柱和颅内运动神经元的方法。该技术可简化肌萎缩侧索硬化症等运动神经元疾病的药物筛选流程，无需纯化步骤即可获得高纯度细胞群体，为神经科学研究提供重要工具。

利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

探索更多视频