Name: 在微RNA的Vivo抑制下，降低小鼠的肿瘤生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 了解利用原位异种移植小鼠模型评估微RNA抑制剂对甲状腺癌治疗效果的方法。该技术通过系统性给药验证新型非编码RNA靶向疗法，为癌症治疗研究提供可靠平台。

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我们感谢Raquel Arocha Riesco在小鼠处理与护理方面的协助。感谢西班牙巴塞罗那加泰罗尼亚高等化学研究所-西班牙国家研究委员会（Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC）的J. Blanco博士和圣十字圣保罗医院研究所（Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau）的E. Mato博士，分别惠赠CMV-Firefly luc-IRES-EGFP和Cal62-Luc细胞。&#160;基金支持：&#160;SAF2016-75531-R（MICIU）、欧洲区域发展基金FEDER、B2017/BMD-3724（马德里自治区）、GCB14142311CRES（西班牙抗癌基金会，AECC）。

动物实验遵循欧洲共同体法律（86/609/EEC）和西班牙法律（R.D. 1201/2005），并获得西班牙国家科学研究委员会（CSIC，西班牙）伦理委员会的批准。
1. 细胞侧腹接种及瘤内antagomiR治疗
<ol>
	<li>细胞制备
	<ol>
		<li>构建 Cal62 人甲状腺癌细胞系（KRASG12R 和 p53A161D 突变）以过表达一种组成型表达GFP和荧光素酶的转基因构建体（CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP）。通过抗生素抗性筛选或流式细胞术分选GFP阳性细胞来获得转基因细胞。</li>
		<li>在添加青霉素、链霉素和10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2.</li>
		<li>重悬 1 × 10⁶ 细胞于 100 μL 缓冲液中6 50 μL 磷酸盐缓冲液（PBS）中的细胞，置于 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至小鼠 flank 部位 
	<ol>
		<li>将细胞与等量的基底膜基质混合。例如，加入 1 x 106 50 μL PBS中的细胞与50 μL基底膜基质混合（参见 材料表）并轻轻混匀。 
		注意：</li>
		<li>将100 μL样品（含PBS和基底膜基质的细胞）皮下注射至6周龄免疫缺陷型BALB/c小鼠左侧 flank nu/nu 使用1 mL胰岛素注射器和27G 1/2''（0.4×13 mm）针头的小鼠</li>
	</ol>
	</li>
	<li>瘤内抗微小RNA治疗 
	<ol>
		<li>悬浮antagomiR（参见 材料表）或500 µL无RN酶的蒸馏水中的阴性对照。</li>
		<li>注射前，将2 nmol的antagomiR或对照物与体内递送试剂一起配制（参见 材料表每次注射的剂量。
		<ol>
			<li>首先混合antagomiR溶液（参见 材料表）以及复合缓冲液（参见 材料表) 按1:1比例混合。例如，将80 μL miRNA抑制剂溶液（16 nmol）加入80 μL复合缓冲液中（包含在体内递送试剂盒中，参见 材料表).</li>
			<li>将体内递送试剂恢复至室温。取160 μL加入1.5 mL离心管中，立即加入160 μL稀释后的antagomiR溶液。将剩余试剂放回-20 °C保存。如有需要，解冻后的试剂可在4 °C保存最多一周。</li>
			<li>立即涡旋混合（10 秒），以确保体内递送试剂与antagomiR充分形成复合物。</li>
			<li>将体内递送试剂与antagomiR混合物在50 °C孵育30分钟。短暂离心试管以回收样品。</li>
			<li>将复合物加入1360 µL pH 7.4的PBS中稀释6倍，并充分混匀。</li>
			<li>继续进行体内递送试剂-antagomiR复合物（每组8只小鼠），或在注射前将复合物于4 °C保存不超过一周。每瘤注射200 μL，注射剂量为2 nmol antagomiR，注射方式为瘤内注射。 
			注意：antagomiR 的体积和用量与肿瘤体积无关。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每周一、周三和周五进行治疗，共持续2周，每次治疗重复3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤生长分析
	<ol>
		<li>注射 50 μL 浓度为 40 mg/mL 的 D-荧光素底物溶液（参见 材料表使用1 mL注射器配27G 1/2″（0.4 mm × 13 mm）针头，在每个时间点进行皮下注射。
		<ol>
			<li>注射后8分钟，使用3%异氟烷与氧气混合对小鼠进行麻醉。通过足底反射（用力捏压脚趾）评估麻醉深度，并根据需要调整麻醉剂输送以维持手术麻醉水平。</li>
			<li>双眼涂抹眼膏以防止干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用活体成像软件对生物发光信号进行成像（参见 材料表). 
		注意：游标卡尺也可用于测量肿瘤体积和肿瘤生长情况.</li>
		<li>获得生物发光信号后，通过t检验比较两种治疗方案下的肿瘤生长情况并确定其显著性差异。使用标准误（SEM）分析组内变异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤切除
	<ol>
		<li>在结束antagomiR处理后的第7天处死小鼠，切除肿瘤，并提取蛋白质和/或RNA以供后续分析。或者，将肿瘤组织切片并固定，用于免疫组织化学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞甲状腺原位接种及全身性antagomiR治疗
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>构建Cal62人甲状腺癌细胞系，使其过表达一种组成型表达GFP和荧光素酶的转基因载体。通过抗生素抗性筛选或流式细胞术分选GFP阳性细胞，获得转基因细胞。</li>
		<li>将这些细胞培养于添加抗生素（青霉素和链霉素）及10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>将1 × 105个细胞悬浮于5 μL PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至小鼠甲状腺内
	<ol>
		<li>向7周龄的BALB/c nu/nu小鼠皮下注射100 μL镇痛剂（丁丙诺啡）和100 μL抗生素（头孢菌素）。&#160;用酒精对注射部位进行消毒。</li>
		<li>将5 μL细胞悬液注射至小鼠甲状腺内。
		<ol>
			<li>使用3%异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉，并将其置于无菌通风柜内的体视显微镜下。通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉深度，并根据需要调节麻醉气体流量以维持手术麻醉水平。</li>
			<li>在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。&#160;</li>
			<li>对每只小鼠，使用碘伏消毒颈部皮肤，用剪刀做约2 cm长的切口。切开后，移开唾液腺以暴露颈部组织。</li>
			<li>使用解剖镊和/或剪刀分离带状肌，暴露气管和甲状腺。使用10 μL微量注射器将5 μL细胞悬液注射至位于环状软骨侧方的右侧甲状腺叶。</li>
			<li>复位唾液腺，并使用编织涂层不可吸收缝线（丝线）缝合切口。</li>
			<li>在伤口处涂抹碘伏，并将小鼠置于加热毯上直至其从麻醉中恢复。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>术后次日，皮下注射镇痛剂（丁丙诺啡），并在250 mL饮用水中加入3 mL液体布洛芬（40 mg/mL），持续1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>全身性antagomiR治疗 
	注意：在细胞接种后2-3周、生物发光信号可检测时进行此步骤。
	<ol>
		<li>将antagomiR或阴性对照物悬浮于无RNase的蒸馏水中。</li>
		<li>注射前，为每次注射准备7 nmol的antagomiR或对照物，并与体内递送试剂混合。
		<ol>
			<li>antagomiR与体内递送试剂溶液的配制方法参见步骤1.3，但每只小鼠添加7 nmol的miRNA抑制剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过小鼠眶后静脉窦注射将溶液静脉注射给药。使用异氟烷诱导麻醉。 
		注意：通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉深度。</li>
		<li>每周给药3次（周一、周三和周五），持续2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤生长分析
	<ol>
		<li>每周两次检测肿瘤的生物发光信号，用于计算肿瘤生长情况。
		<ol>
			<li>在每个时间点，通过皮下注射给予50 μL浓度为40 mg/mL的D-荧光素底物溶液。</li>
			<li>注射后8分钟，使用3%异氟烷与氧气混合气体麻醉小鼠，并利用活体成像软件采集生物发光信号图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>获得生物发光信号后，比较不同处理组的肿瘤生长情况，并采用t检验确定差异显著性。组内变异分析使用标准误（SEM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤切除
	<ol>
		<li>在antagomiR治疗结束后7天，处死小鼠，切除肿瘤，并提取蛋白质和/或RNA用于后续分析。或者，将肿瘤组织切片并固定，用于免疫组织化学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , In press (2019).</li>
<li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本文介绍了一种研究miRNA在体内功能的方法，旨在更深入地理解其在甲状腺癌发生和进展中的作用，以及作为治疗靶点的潜力。文中所述的肿瘤异种移植模型基于可利用生物发光信号进行追踪的细胞，从而能够在治疗干预下在活体内测量肿瘤的生长情况。此外，我们还描述了一种基于miRNA的甲状腺癌治疗方法，目前该方法尚处于早期研究阶段。
我们首先使用皮下异种移植模型验证了miRNA作为治疗靶点的可行性，该模型将甲状腺肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠的侧 flank 部位。随后，我们对肿瘤内注射了antagomiR。该模型可用于多种癌症类型，以在体内评估特定miRNA或癌相关miRNA（oncomiR）在人类癌细胞中的作用。该技术的优点在于操作相对简单、快速，且动物所受痛苦最小。然而，该技术的主要缺点是不能很好地模拟人类疾病状态，因为细胞被注射到皮下而非原发器官内。为了克服这一局限性，我们采用了一种更为严谨的模型，即通过手术将生物发光的甲状腺肿瘤细胞正位植入小鼠甲状腺内。尽管该技术操作更复杂且耗时较长，但它允许在肿瘤的“原生”环境——甲状腺中研究肿瘤生长。该方法的一个优势在于，可利用活体成像软件检测肿瘤细胞扩散...

甲状腺癌是一种内分泌系统恶性肿瘤，其发病率呈上升趋势，尽管总体预后较好1。然而，部分患者会发展为无法治疗的侵袭性类型，其分子基础尚不明确2。
miRNA 是长约22个核苷酸的非编码RNA，通常通过与靶信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）进行碱基配对结合，从而调控多种组织中的基因表达，引发mRNA降解或翻译抑制3,4。越来越多的证据表明，microRNA表达的失调是癌症的一个重要特征，因为这些分子能够调节增殖信号、迁移、侵袭和转移过程，并可赋予细胞对凋亡的抵抗能力5,6。近年来，大量研究已将miRNA鉴定为癌症诊断与预后评估的潜在生物标志物以及治疗靶点7，为癌症的评估与治疗提供了新的视角。
miRNA 已成为人类分子肿瘤学中的核心角色，是人类甲状腺肿瘤发生发展的关键驱动因素8,9,10,11,12。在表达上调的 miRNA 中，miR-146b 在乳头状甲状腺癌（Papillary Thyroid Carcinoma, PTC）组织中高度过表达，已被证实可显著促进细胞增殖，并与肿瘤侵袭性增强及预后不良相关6,12,13,14,15。此外，miR-146b 可调控多个参与甲状腺分化的基因12，同时也调控如 PTEN16 和 DICER117 等重要的肿瘤抑制基因。尽管 miRNA 在癌症生物学中具有重要意义，基于 miRNA 的癌症治疗仍处于早期阶段，且极少有研究针对内分泌系统中最常见的肿瘤——甲状腺癌18。本文描述了一种利用两种不同的人源肿瘤小鼠模型的实验方案，通过给予一种可特异性抑制细胞内 miRNA 的合成型 miRNA 抑制剂（antagomiR），能够有效抑制肿瘤生长。我们首先采用常见的异种移植模型，通过瘤内局部注射 antagomiR，观察到肿瘤生物发光信号降低，表明肿瘤生长受到抑制16。由于建立能够真实模拟人类肿瘤进展的稳定小鼠模型对于开发独特治疗策略至关重要，相较于皮下移植模型，原位移植人源原发肿瘤更能为新药的临床前验证提供更有价值的平台。因此，为了更准确地评估该 antagomiR 的治疗潜力，我们进一步采用了原位小鼠模型并通过血液循环进行系统性给药，同样获得了抑制肿瘤生长的效果。

<table><tbody><tr><td>antagomiR：mirVana miRNA抑制剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464088</td><td>适用于体内实验</td></tr><tr><td>基底膜基质：Matrigel 高浓度基底膜基质</td><td>Corning</td><td>#354248</td><td></td></tr><tr><td>DICER抗体</td><td>Abcam</td><td>ab14601</td><td>免疫组化染色：1/100</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;递送试剂：Invivofectamine 3.0 试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>IVF3005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体内&lt;/em&gt;成像软件：IVIS-Lumina II 成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阴性对照：mirVana miRNA 抑制剂，阴性对照 #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464077</td><td>适用于体内实验</td></tr><tr><td>PCNA抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92552</td><td>Western blot：1/2,000</td></tr><tr><td>PTEN抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7974</td><td>Western blot：1/1,000</td></tr><tr><td>XenoLight D-荧光素钾盐生物发光底物</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>用PBS稀释</td></tr></tbody></table>

体内抑制 microrna 以减少小鼠肿瘤生长

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

microRNA（miRNA）通过介导靶mRNA的不稳定性和翻译抑制，在基因表达调控中发挥重要作用。越来越多的研究表明，miRNA可作为癌症诊断与预后的潜在生物标志物，并可作为治疗靶点，从而为癌症的评估与治疗增添了新的维度。在甲状腺癌中，肿瘤的发生不仅源于关键基因的突变，还与多种miRNA的过表达密切相关。因此，miRNA在调控甲状腺基因表达中的作用正逐渐成为癌症机制研究的重要内容。本文介绍了一种利用人源肿瘤异种移植及原位小鼠模型，研究miRNA抑制剂递送作为甲状腺癌治疗策略的实验方案。首先构建稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶的甲状腺肿瘤细胞，将其注射至裸鼠体内以形成肿瘤，并通过生物发光成像进行动态监测。在体抑制特定miRNA可有效减缓肿瘤生长，并上调其靶基因的表达。该方法不仅可用于评估特定miRNA在体内的功能，还有助于发现新的治疗靶点。

我们使用了两种不同的小鼠模型，以确定中和一种miRNA是否能够抑制肿瘤生长。为此，将人甲状腺肿瘤Cal62-luc细胞皮下注射到裸鼠的侧 flank 部位，建立异种移植模型。两周后，肿瘤形成并可用游标卡尺测量。此时，对小鼠瘤内注射miR-146b抑制剂（miR-146b-inhibitor）或相应的对照物，并继续监测肿瘤体积达两周（图1A）。如图1B所示，与阴性对照组（n=4）或生理盐水对照组（未显示）相比，瘤内注射miR-146b抑制剂（anti-146b）的小鼠（n=8）其肿瘤生长受到显著抑制。miRNA是基因调控的重要组成部分，因其可调控多个靶mRNA。因此，oncomiR（癌相关miRNA）是肿瘤抑制基因的重要调控因子。本实验方案可用于分析经miRNA抑制剂处理后，这些基因在肿瘤内部的表达水平。此外，还可研究某些增殖标志物的表达水平，例如，经antagomiR处理的肿瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平低于对照组处理的肿瘤（图2）。同时，通过分析从...

本方案描述了人甲状腺肿瘤发生的异种移植和原位小鼠模型，可作为测试基于微小RNA抑制剂治疗的平台。该方法适用于研究非编码RNA的功能及其作为新型治疗靶点的潜力。

体内抑制 microRNA 以减少小鼠肿瘤生长

MicroRNAs（miRNAs）通过使mRNA不稳定并抑制靶mRNA的翻译，在基因表达调控中发挥重要作用。

我们在甲状腺癌模型中实施了首个基于微小RNA抑制剂的治疗。这些正在开发的疗法为该疾病的治疗展现了良好的前景。这种采用全身给药途径的原位模型，有助于验证新型基于微小RNA的药物。尽管我们采用原位模型将人甲状腺癌细胞植入小鼠甲状腺，但这些模型也可用于其他癌症类型的全身性研究。Julia Ramirez-Moya 和 Adrian Acuna 将与 Raquel Arocha Riesco 一起演示该操作流程。Raquel Arocha Riesco 是我们研究所的一名技术人员。在制备CAL-62人甲状腺癌细胞系不完全培养基后，将1×10⁶个细胞分装于50微升PBS中，于4摄氏度下悬浮，并与等体积的基底膜基质混合。将细胞悬液加入配有27号半英寸针头的1毫升注射器中，于6周龄免疫缺陷裸鼠左侧 flank 皮下注射100微升样品。注射两周后，在1.5毫升离心管中，将antagomiR或对照处理缓冲液加入160微升室温下的体内递送试剂中。立即涡旋振荡溶液10秒，以确保混合物充分形成复合物。将处理液在50摄氏度下孵育30分钟，随后在微量离心机中短暂离心。然后，用新鲜的PBS将沉淀的处理复合物稀释六倍，并充分混匀。将200 µL的治疗剂直接全部注入肿瘤内。每周对每只实验动物皮下注射2次，每次50 µL浓度为40 mg/L的D-荧光素底物溶液。确保在异氟烷麻醉后通过脚趾夹捏确认无反应。将动物放入活体生物发光成像系统的成像室中，根据标准操作流程，使用活体成像软件采集生物发光信号。随后分析肿瘤生长情况，并通过T检验比较两种治疗方案，确定其显著性差异及生长差异。进行原位甲状腺肿瘤细胞接种时，将一份CAL-62细胞悬浮于5 µL PBS中，并向一只7周龄的裸鼠皮下注射100 µL镇痛剂和100 µL抗生素。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将其置于解剖显微镜下，并用碘伏消毒颈部。接着，在皮肤上做一个约2厘米的切口，移开唾液腺以暴露颈部。使用解剖镊和/或剪刀解剖带状肌，暴露气管和甲状腺，然后用10 µL注射器将5 µL肿瘤细胞悬液注射至位于环状软骨侧方的右叶甲状腺。待所有细胞注射完毕后，复位唾液腺，并使用丝线编织、涂层、不可吸收缝线关闭切口。随后在伤口区域涂抹碘伏，将小鼠置于加热毯上并持续监测，直至完全恢复。在甲状腺内细胞注射后两到三周，按所示方法制备处理溶液，并通过眼后静脉窦注射，将溶液静脉注射至麻醉的荷瘤动物体内。在此代表性实验中，与阴性对照组相比，未注射miR-146B抑制剂的肿瘤经瘤内注射后，其生长受到显著抑制。与对照肿瘤相比，在antagomiR处理的肿瘤中，一些增殖标志物的瘤内表达水平也明显降低。此外，可通过分析肿瘤中提取的RNA或蛋白质来研究微小RNA靶标的回收情况。综合结果表明，体内抑制特定微小RNA是有效的，并可能被开发用于甲状腺癌的治疗。如在小鼠中建立的甲状腺肿瘤所展示的组织学分析，可对肿瘤周围上皮细胞进行染色，从而揭示肿瘤组织中甲状腺滤泡的结构特征。值得注意的是，对已形成肿瘤的小鼠静脉注射 microRNA 146B 抑制剂后，与对照组处理的动物相比，肿瘤体积显著减小。此外，在原发性肿瘤中，新发现的 microRNA 146B 靶基因 DICER1 的表达在抗 microRNA 146B 治疗后增加，进一步强调了抑制内源性 microRNA 表达、从而恢复其靶基因功能作为甲状腺癌治疗策略的潜力。该技术及其后续关于脂滴蛋白（lipin）的研究结果，为探索基于非编码 RNA 的新型甲状腺癌治疗方法提供了可能。

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