Name: 使用多光谱成像流细胞测定法执行体外微核测定的自动化方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 学习使用多光谱成像流细胞测定法进行体外微核测定的自动化方法，用于评估遗传毒性和细胞毒性。该技术可提高检测通量并减少评分主观性，适用于药物开发中的高通量筛选。

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作者感谢Christine Probst（Luminex Corporation）在开发早期版本数据分析模板过程中所做的工作，同时感谢Haley Pugsley博士（Luminex Corporation）和Phil Morrissey博士（Luminex Corporation）对稿件的审阅与编辑。

<ol><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Fundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphocyte+Cytokinesis-Block+Micronucleus+Cytome+Assay+and+its+Application+in+Radiation+Biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry.</a> Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).</li>
<li>Hintzsche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+micronuclei+and+micronucleated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Fate of micronuclei and micronucleated cells.</a> Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+disadvantages+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method.</a> Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HUman+MicroNucleus+Project+-+An+international+collaborative+study+on+the+use+of+the+micronucleus+technique+for+measuring+DNA+damage+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Fundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans.</a> Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).</li>
<li>Kirsch-Volders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+working+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Report from the in vitro micronucleus assay working group.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).</li>
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<li>Aardema, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+III.+Using+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).</li>
<li>Clare, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+II.+Using+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).</li>
<li>Lorge, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+I.+General+conditions+and+overall+conclusions+of+the+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).</li>
<li>Oliver, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+V.+Using+L5178Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).</li>
<li>Wakata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+IV.+Using+CHL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes%3A+Results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li>
<li>Decordier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+cytokinesis-blocked+micronuclei%3A+an+adapted+protocol+and+a+validated+scoring+procedure+for+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring.</a> Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).</li>
<li>Decordier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+micronuclei+by+IMSTAR+for+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring.</a> Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).</li>
<li>Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+automated+cytogenetic+imaging%3A+unattended+scoring+of+dicentric+chromosomes%2C+micronuclei%2C+single+cell+gel+electrophoresis%2C+and+fluorescence+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals.</a> Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).</li>
<li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li>
<li>Nüsse, M., Marx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+micronuclei+in+cell+cultures+and+human+lymphocytes%3A+Advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).</li>
<li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry%3A+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li>
<li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).</li>
<li>Bryce, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+96-well+microplate-based+in+vitro+micronucleus+assay+with+human+TK6+cells%3A+Protocol+optimization+and+transferability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test%3A+to+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).</li>
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<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+radiation+biodosimetry+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parameter+dose+estimations+in+radiation+biodosimetry+using+the+automated+cytokinesis-block+micronucleus+assay+with+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+for+high+throughput+radiation+biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry.</a> Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+automated+data+analysis+for+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+for+high+throughput+radiation+biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry.</a> Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+an+optimized+imaging+flow+cytometry+analysis+template+on+sample+throughput+in+the+reduced+culture+cytokinesis-block+micronucleus+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Protection+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay.</a> Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Triage+Radiation+Biodosimetry%3A+Integrating+Imaging+Flow+Cytometry+with+High-Throughput+Robotics+to+Perform+the+Cytokinesis-Block+Micronucleus+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay.</a> Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+Of+The+In+vitro+Micronucleus+Assay+Using+The+ImageStream%C2%AE+Imaging+Flow+Cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer.</a> Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+complete+automated+scoring+of+the+cytokinesis+block+micronucleus+cytome+assay+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project%3A+Detailed+description+of+the+scoring+criteria+for+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+isolated+human+lymphocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+automated+MicroFlow%C2%AE+and+Metafer%E2%84%A2+platforms+for+high-throughput+micronucleus+scoring+and+dose+response+analysis+in+human+lymphoblastoid+TK6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells.</a> Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project+initiative+and+review+of+validation%2C+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hygiene+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li>
<li>Kirkland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+recommended+lists+of+genotoxic+and+non-genotoxic+chemicals+for+assessment+of+the+performance+of+new+or+improved+genotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+FlowSight%C2%AE+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li>
</ol>

作者受雇于Luminex Corporation，该公司是本研究所使用的ImageStream多光谱成像流式细胞仪的制造商。

在最近的一项研究中，Verma 等人强调了开发一种将流式细胞术的高通量优势与图像分析的数据和图像存储优势相结合的系统的重要性35。本文所述的体外 MIFC 微核（MN）检测方法满足了这一要求，有望克服显微镜和流式细胞术方法中存在的诸多前述挑战。此处描述的&#160;方案表明，可利用 MIFC 同时评估细胞毒性和遗传毒性。样品制备、细胞染色和数据采集过程简便，但方案中存在若干关键步骤必须始终严格执行。向细胞中加入氯化钾（KCl）至关重要，其作用是使细胞膨胀，从而在主核之间产生分离。这确保了掩膜算法能够识别双核细胞（BNCs）和多核细胞（POLY cells）中的所有单个细胞核，这是准确计数这些细胞所必需的。此外，KCl 还能实现细胞核与微核（MN）之间的分离，这对于微核的精确掩膜和定量至关重要。另外，在加入 KCl 后使用甲醛可防止细胞在离心过程中发生裂解。加入细胞松弛素 B 会导致经历了一次以上核分裂的 TK6 细胞体积显著增大。因此，细胞质变得脆弱，若在加入 KCl 后立即进行离心，可能导致细胞裂解。此外，非常重要的一点是，应根据样品中的细胞数量而非终浓度来加入 Hoechst 染料。例如，10 µg/mL 的终浓度可均匀染色 1 × 106 个细胞的样品，但可能无法充分染色含有 5 × 106 个细胞的样品，导致大量细胞核染色过浅，从而增加分析难度。还需注意的是，如果 MIFC 配备了 405 nm 激发激光，Hoechst 可替换为另一种 DNA 染料如 DAPI；若 MIFC 配备了 488 nm 和/或 642 nm 激发激光，则可替换为 DRAQ5。若更换细胞核染料，必须对染料进行滴定，以确定在所需/期望激光功率下的合适浓度。
在MIFC上采集数据时，确定梯度RMS特征的最佳区域边界至关重要。由于不同MIFC仪器之间可能存在细微差异，本方案中提供的边界可能需要进行调整。在数据采集过程中应用该特征对于确保捕获高度聚焦的图像十分关键。如果数据文件中包含大量模糊或失焦图像，分析软件中的掩膜算法很可能会错误地将模糊区域中的染色伪影突出显示，导致大量假阳性伪影被计为微核（MN）。尽管此处描述的图像处理技术可能具有一定难度，但一旦在MIFC软件中建立分析模板，即可通过批量处理自动分析数据文件，无需人工干预，从而避免评分者偏差。此外，若使用TK6细胞以外的其他细胞系进行该检测，则需要调整掩膜和区域边界，因为不同细胞的形态学特性（如大小）与TK6细胞存在差异。
本文展示的结果（图5）表明，在将TK6细胞暴露于不同剂量的丝裂霉素C和秋水仙素时，微核诱导率呈现具有统计学意义的升高。与溶剂对照组相比，这两种化学物质的多个剂量组均观察到微核频率的统计学显著增加。此外，如预期所示，甘露醇的任何剂量均未引起超过30%的细胞毒性，也未导致微核频率相对于溶剂对照组出现统计学显著升高。本文所述利用MIFC进行体外微核试验的方案，对阳性与阴性对照化学物质均获得了预期的结果。开展多项实验，使用溶剂对照和阴性对照化学物质建立微核频率以及细胞分裂阻滞增殖指数（CBPI）的基础值基准，是非常重要的。对于遗传毒性评估，微核频率的统计学显著升高是通过与已知的、针对所用细胞类型的基础微核频率进行比较来确定的。此外，所有细胞毒性计算均基于对照样本的CBPI，因此必须在对照组中准确量化单核细胞、双核细胞和多核细胞的基础比率。
先前的研究已描述了在微核（MN）检测中使用MIFC的一些局限性和优势29,32。主要局限性在于，与显微镜技术相比，MIFC检测到的微核频率较低，这可能源于分析软件中评分标准灵活性不足，以及MIFC景深有限。虽然可以创建轮廓清晰的掩模以准确识别主核，但与主核接触（或非常接近）的微核可能被包含在BNC掩模内而被误判。此外，显微镜下较易识别的非常小的微核，由于MIFC中微核掩模面积参数存在下限设置（以避免将微小伪影误判为微核），很可能被错误地遗漏。除了图像数据分析本身存在的困难外，由于MIFC的设计原理，其获取的是三维细胞结构的二维投影图像。这可能导致部分微核处于与两个主核不同的焦平面，使其成像非常暗淡而无法评分。此外，少量微核可能位于两个主核之一的后方，导致无法被观察和评分。因此，考虑到这些技术困难，在解释低剂量下微核频率显著增加的结果时应保持谨慎。
尽管存在这些不足，本文所述的MIFC方法相较于其他技术仍具有多项优势。Fenech等人提出了在开发用于微核（MN）检测的自动化系统和方法时应考虑的标准和指南36，包括但不限于：能够直接可视化主核和细胞质，确定受试化学物质或试剂在不同剂量下诱导的微核频率，以及能够定量分析细胞形态并确定所有主核和微核的位置，以确保其位于细胞质内。本文表明，所开发的用于体外微核试验的MIFC方法满足（或具备满足）上述标准的潜力。具体而言，可通过荧光激光捕获细胞核和微核的图像，而细胞质图像则可通过明场（BF）LED获得。利用先进的掩模和特征组合，可自动区分具有正常核形态的细胞与具有异常形态的细胞。Colchicine和Mitomycin C的实验结果（图5）显示，与溶剂对照组相比，可在多个剂量下同时评估遗传毒性和细胞毒性，并在预期情况下观察到具有统计学意义的微核频率。此外，OECD试验指南487建议，为评估遗传毒性，每个测试浓度应计数2,000个双核细胞（BNCs）；为评估细胞毒性，每个测试浓度至少应计数500个细胞9；而采用人工显微镜计数通常耗时超过1小时。本文所述方案及结果表明，在约20分钟内，每个测试浓度平均可捕获并分析约6,000个双核细胞、16,000个单核细胞（MONO）和800个多核细胞（POLY）。在如此短时间内实现高速数据采集和大量候选细胞的分析，凸显了采用MIFC进行体外微核试验的另一项重要优势。
尽管本文所展示的结果令人鼓舞，但其仅代表一种早期概念验证方法。后续应开展更系统的研究，采用更大、更多样化的化合物集，涵盖多种遗传毒性和细胞毒性类别及作用机制，例如Kirkland等人37&#160;所建议的化合物集。此类研究耗时较长且劳动强度大，超出了本文的范围，但更大规模的研究将有助于深入评估该方法可靠识别弱遗传毒性物质的能力。本文所提出的方法尚未微型化为微孔板格式，而微型化将有助于在更宽剂量范围内实现更快速、高效的筛选。因此，目前基于MIFC的体外微核试验可能更适用于劳动密集型的后续研究或良好实验室规范的相关研究。然而，该方法将持续优化和验证，并具备进一步提升检测化学物质特异性形态学事件灵活性的潜力，例如检测暴露于非整倍体诱导剂后，仍可计分但核形态非圆形的细胞比例增加的现象38。最后，MIFC方法还为微核试验引入额外的生物标志物（如着丝粒染色）提供了可能，从而更全面地揭示微核诱导的机制。

体外微核（MN）试验是一种常用的检测方法，广泛用于评估细胞毒性和遗传毒性，在化学物质和药物研发以及暴露于各种环境、职业或生活方式因素人群的人体生物监测等多个研究领域中作为筛选工具1,2,3。MN&#160;由细胞分裂过程中产生的染色体片段或完整染色体组成，这些物质未能整合到两个主要子代细胞核中的任何一个。在分裂后期（telophase）之后，这些染色体物质在细胞质内形成一个独立的、圆形结构，与任一主核分离2。因此，MN&#160;可代表DNA损伤，并已被用作遗传毒性检测中多年来的终点指标4。测量MN最适宜的方法是细胞质分裂阻断微核（CBMN）试验。通过CBMN试验，可在样本中加入细胞松弛素B（Cytochalasin B, Cyt-B），从而对双核细胞（BNCs）中的MN发生频率进行计数。Cyt-B允许核分裂但阻止细胞质分裂，因此可将MN的计数限定于仅完成一次分裂的双核细胞5。
已开发并验证了结合显微镜和流式细胞术的实验方案，并常规用于体外微核试验6,7,8,9,10,11,12,13,14显微镜技术的优势在于能够直观地确认微核（MN）&#160;是有效的，但耗时且不同评分者之间容易产生差异15为了解决这一问题，开发了自动显微成像技术用于扫描载玻片并捕获细胞核和微核的图像16,17,18,19，但无法观察到细胞质，因此难以确定微核是否真正与特定细胞相关联。此外，这些方法在识别多核细胞（POLY细胞，包括三核和四核细胞）方面存在困难，而使用Cyt-B进行细胞毒性计算时必须识别此类细胞9采用流式细胞术进行微核（MN）检测的方法利用荧光信号以及前向散射和侧向散射光强度，来识别细胞裂解后释放出的细胞核和微核群体。20,21,22这使得在几分钟内即可从数千个细胞中获取数据，并可进行自动化分析23然而，由于无法直接观察细胞，难以确认所计数的事件是否真实存在。此外，裂解细胞膜会抑制细胞松弛素B（Cyt-B）的使用，同时产生含有其他碎片（如染色体聚集体或凋亡小体）的悬液，且无法将这些碎片与微核（MN）区分开来。24.
鉴于这些局限性，多光谱成像流式细胞术（MIFC）是进行微核试验的理想系统，因为它结合了显微镜的高分辨率荧光成像能力以及传统流式细胞术的统计稳健性和高速度。在MIFC中，所有细胞被引入流体系统，随后通过流体动力聚焦集中于流动池比色皿的中心。所有细胞的正交照明通过明场（BF）发光二极管（LED）、侧向散射激光以及至少一个荧光激光实现。荧光光子由三个高数值孔径物镜（20x、40x或60x）之一捕获，随后通过光谱分解元件。光子最终聚焦到电荷耦合器件（CCD）相机上，从而获得流经流动池的所有细胞的高分辨率图像。为避免图像模糊或拖尾，CCD工作在时间延迟积分（TDI）模式，该模式通过在CCD上逐行转移像素信息，使其与流动中细胞的速度同步，从而追踪目标。像素信息最终从最后一行像素中采集。TDI成像结合光谱分解技术，可同时获取流经流动池的所有细胞的最多12幅图像（2幅明场图像，10幅荧光图像）。所有采集的图像均存储在特定样本的数据文件中，允许随时使用MIFC数据分析软件进行分析。最后，数据文件保留了细胞图像与所有双变量图上数据点之间的关联。这意味着，传统双变量图上的任意一个数据点均可被高亮显示，其对应的明场和荧光图像也将随之呈现25。
近年来，基于MIFC的方法已被开发用于开展辐射生物剂量快速分类的微核（MN）检测以及遗传毒理学检测26,27,28,29,30,31&#160;32,33&#160;。研究表明，与其它方法相比，MIFC能够以更高的通量对主核、微核（MN）及细胞质进行成像26。在MIFC数据分析软件中，可自动识别分析所需的所有细胞类型，包括单核细胞（MONO细胞）、双核细胞（BNCs，含或不含MN）以及多核细胞（POLY细胞），并通过多种数学算法实现Fenech等人提出的评分标准6,34。生物剂量学研究结果显示，在量化每BNC中MN发生率时，所获得的剂量-反应校准曲线的幅度与文献中其他自动化方法得到的结果相似29。此外，近期毒理学研究证明，利用MIFC可自动捕获、识别、分类并计数MONO细胞、BNCs（含或不含MN）和POLY细胞的图像。该实验方案及数据分析方法使得在TK6细胞暴露于多种致断裂剂和致非整倍体剂后，能够计算其细胞毒性和基因毒性32。
本文所述方案介绍了一种利用成像流式细胞术（MIFC）进行体外微核（MN）检测的方法。本研究所采用的样品处理技术处理单个样本所需时间少于2小时，与其他方法相比操作相对简便。MIFC分析软件中的数据分析过程较为复杂，但按照本文所述步骤，可在数小时内完成分析模板的创建。此外，一旦模板建立完成，即可自动应用于所有采集的数据，无需进一步人工干预。该方案详细阐述了将TK6细胞暴露于致断裂剂和致非整倍体剂的全部步骤，描述了细胞培养、处理和染色的方法，并演示了如何利用MIFC获取高分辨率图像。此外，本文还展示了当前在MIFC软件中分析数据的最佳实践，以自动识别并计数单核细胞（MONO）、双核细胞（BNC）和多核细胞（POLY），用于评估细胞毒性和遗传毒性。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>清洁剂 - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>向容器中加入200 mL清洁剂。&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>秋水仙碱</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-86-8</td><td></td></tr><tr><td>康宁瓶顶式真空过滤器&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430769</td><td>0.22 微米滤器，500 毫升瓶</td></tr><tr><td>细胞松弛素B</td><td>MilliporeSigma</td><td>14930-96-2</td><td>5 mg 瓶装</td></tr><tr><td>除泡器 - 70% 异丙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td>向容器中加入200 mL除泡剂。&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-丙醇-70%（V/V）-0.1-µm过滤,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>MilliporeSigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 1X</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS 无钙镁&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，10%，无甲醇，超纯</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>此溶液用于配制4%和1%的福尔马林。注意：福尔马林/甲醛吸入或吞咽后有毒。&amp;nbsp; 对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。&amp;nbsp; 吸入或皮肤接触可能引起过敏反应。对眼睛有严重损伤风险。&amp;nbsp; 潜在致癌风险。&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H3570</td><td>10 mg/mL 溶液</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>MilliporeSigma</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸 100X</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>采用配备405 nm、488 nm和642 nm激光器的两相机ImageStreamX Mark II系统。http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC 分析软件 - IDEAS</td><td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>MIFC（ImageStreamX MKII）的配套软件</td></tr><tr><td>MIFC 软件 - INSPIRE</td><td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>这是运行MIFC（ImageStreamX MKII）的软件</td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>MilliporeSigma</td><td>50-07-7</td><td></td></tr><tr><td>NEAA混合液 100X</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100X</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>冲洗——超纯水或去离子水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>可使用任何超纯水或去离子水。&amp;nbsp; 向容器中加入 900 mL 冲洗液。</td></tr><tr><td>RNase</td><td>MilliporeSigma</td><td>9001-99-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基 1X</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>鞘液 - PBS</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td>这与1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液相同&amp;nbsp; 无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺&amp;nbsp; 向容器中加入 900 mL 鞘液。</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>HyClone</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>灭菌器 - 0.4-0.7% 次氯酸盐</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>这实际上是通过将 Clorox 漂白剂与水混合稀释制成的 10% Clorox 漂白液。&amp;nbsp; 向容器中加入200 mL的Sterilzer。</td></tr><tr><td>系统校准试剂 - SpeedBead</td><td>EMD Millipore</td><td>400041</td><td>每支试管可容纳约 10 mL。&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TK6细胞</td><td>MilliporeSigma</td><td>95111735</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

体外微核（MN）试验常用于评估细胞毒性和遗传毒性，但通过人工显微镜计数该试验费时费力，且由于不同评分者之间的差异，结果存在不确定性。为解决这一问题，已引入自动载玻片扫描显微镜和常规流式细胞术方法，以消除评分者偏差并提高通量。然而，这些方法本身也存在固有局限性，例如无法观察细胞的细胞质，以及流式细胞术缺乏对微核的可视化验证或图像数据存储功能。多光谱成像流式细胞术（MIFC）有望克服这些局限性。MIFC结合了显微镜的高分辨率荧光成像能力与常规流式细胞术的统计稳健性和高速度。此外，所有采集的图像均可存储在剂量特异性的文件中。本文描述了在MIFC上执行完全自动化MN试验所开发的实验方案。采用低渗溶液（75 mM KCl）处理人淋巴母细胞样TK6细胞使其膨胀，再用4%甲醛固定，并用Hoechst 33342染色细胞核内容物。所有样品均以悬浮状态在MIFC上运行，从而能够获取试验所需全部关键事件的高分辨率图像（例如含有或不含微核的双核细胞，以及单核和多核细胞）。图像在MIFC数据分析软件中被自动识别、分类和计数，实现对细胞毒性和遗传毒性的自动化评分。结果表明，在TK6细胞暴露于丝裂霉素C和秋水仙碱后，与溶剂对照组相比，使用MIFC进行体外微核试验可在多个不同细胞毒性水平下检测到微核频率的统计学显著升高；而在暴露于甘露醇后，则未观察到微核频率的显著升高。

本文所述的分析方法可实现对含有或不含微核（MN）的双核细胞（BNCs）进行自动识别与计分，以计算基因毒性。此外，单核细胞（MONO）和多核细胞（POLY）也可被自动识别与计分，用于计算细胞毒性。在对这些事件进行计分时，必须遵循已发表的计分标准6,34，这些标准已集成于MIFC数据分析软件中。本文结果表明，在人源淋巴母细胞样TK6细胞暴露于已知的微核诱导化学物（丝裂霉素C和秋水仙碱）后，随着细胞毒性的增加，微核频率的统计学显著上升可被检测到。其他化学物的类似结果已在另一篇独立发表的文章中得到验证32。此外，甘露醇的使用结果表明，非微核诱导化学物也可通过本文所述的MIFC方法被正确识别。本实验方案中用于生成所有掩模、特征及区域边界的参数，若改用不同细胞类型（例如中国仓鼠细胞）进行实验时，可能需要相应调整。
图3展示了四个选定的图版，用于识别双核细胞（BNCs）（图3A-3D）。此处显示的是一个直方图，可用于选择具有两个细胞核的细胞（图3A），以及双变量图，可用于根据相似的圆形度（图3B）、相似的面积和强度（图3C），以及具有明显分离、无重叠细胞核的BNCs（图3D）来筛选BNCs，符合评分标准6,34。图3E展示了明场（BF）和Hoechst图像，以及BNC和微核（MN）的掩模图像，表明可识别并计数含有单个或多个微核的BNCs。通过计算最终BNC群体中含微核的BNCs比例，可评估遗传毒性。图4展示了使用POLY掩模应用“斑点计数”功能以识别单核（MONO）、三核（TRI）和四核（QUAD）细胞的方法。随后可将TRI和QUAD细胞数量相加，得到最终的POLY细胞总数（表1）。通过使用本方案中提供的公式，可进一步计算细胞毒性。因此，实验中的每个剂量点均可通过遗传毒性和细胞毒性两个参数进行评估。
图5展示了有丝分裂抑制剂秋水仙碱（Colchicine）、断裂剂丝裂霉素C（Mitomycin C）以及阴性对照甘露醇（Mannitol）的遗传毒性和细胞毒性数值。对于秋水仙碱（图5A），0.02 至 0.05 μg/mL 剂量组与溶剂对照组相比，微核（MN）频率出现具有统计学意义的升高，分别达到 1.28% 和 2.44%（表1）。对于丝裂霉素C（图5B），0.4 和 0.5 μg/mL 两个较高剂量组与溶剂对照组相比，微核频率也表现出具有统计学意义的升高，分别为 0.93%（0.4 μg/mL）和 1.02%（0.5 μg/mL）（表2）。最后，对于甘露醇（图5C），所有测试剂量均未引起超过30%的细胞毒性，且与溶剂对照组相比，微核频率未出现显著升高，符合预期结果（表3）。
<img alt="用于DNA分析的流式细胞仪设置，包括照明、流体系统、明场梯度RMS与Hoechst荧光强度结果图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：MIFC仪器设置。 显示按照方案第7步所述的MIFC设置界面截图。(A) 将405 nm激光功率设为10 mW。(B) 设置明场（BF）通道1和9。(C) 选择60倍物镜。(D) 选择最慢的流速，以获得最高分辨率的图像。(E) 设定采集事件数为20,000个。(F) 点击Load按钮开始加载样品。(G) 点击Acquire按钮开始图像采集。(H) 点击Return按钮将未使用的样品返回。(I) 明场（BF）长宽比（Aspect Ratio）对明场面积（Area）的散点图，用于单细胞筛选。(J) Hoechst梯度RMS对明场梯度RMS的散点图，用于聚焦良好细胞的筛选。(K) Hoechst荧光强度直方图，用于DNA阳性细胞的筛选。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="细胞核图像处理；分割；分析；散点图；显微镜数据；细胞分类。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：分析软件的设门策略。 显示本实验方案第9节中所述设门策略的截图。图中按顺序展示用于识别双核细胞（红框）、微核（黄框）以及单核和多核细胞（蓝框）的区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞核分析示意图；长宽比、斑点计数；显微镜、强度比图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：含有或不含微核（MN）的双核细胞（BNC）的鉴定与评分。（A）选择具有两个明显细胞核的细胞。（B）利用“长宽比强度”（Aspect Ratio Intensity）功能，鉴定具有两个高度圆形细胞核的双核细胞（BNC）。（C）筛选两个细胞核面积和强度相似的双核细胞（BNC）。该过程通过计算两个细胞核的面积比值及其长宽比的比值来实现。（D）利用“形状比”（Shape Ratio）和“长宽比”（Aspect Ratio）特征，识别两个细胞核分离良好的双核细胞（BNC）。（E）使用“斑点计数”（Spot Count）功能，结合微核（MN）掩膜，显示可识别并计数含单个或多个微核的双核细胞（BNC）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多核细胞成像；荧光显微镜；荧光点计数图；细胞分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：单核与多核细胞的识别与计分。利用荧光点计数功能识别并计数单核、三核及四核细胞。组分掩模1可用于识别单核细胞（上图）。组分掩模1至3可用于识别三核细胞（中图）。组分掩模1至4可用于识别四核细胞（下图）。该图已根据Rodrigues 201832修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微核细胞与细胞毒性的比较；剂量-反应曲线；秋水仙素、丝裂霉素C、甘露醇处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：细胞毒性的定量分析。 使用细胞分裂阻断增殖指数（黑色圆圈）定量细胞毒性，使用微核百分率（空白柱状图）定量遗传毒性，处理时间为3小时，恢复时间为24小时，分别针对（A）秋水仙素、（B）丝裂霉素C和（C）甘露醇。与对照组相比，微核频率具有统计学显著性增加的结果以星号表示（卡方检验；*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001）。每个剂量点的数据均为两次重复实验的平均值。本图改编自Rodrigues 201832。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="秋水仙碱对细胞培养物的细胞毒性和遗传毒性数据表，显示剂量依赖性效应。" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="表 1"> 
表 1： 计算秋水仙碱细胞毒性（单核、双核和多核细胞数量）和遗传毒性（含微核的双核细胞数量及百分比）所需的参数。所有计算值均为每个剂量点两个重复实验的平均值。
<img alt="丝裂霉素C细胞毒性、遗传毒性表；对细胞计数和微核的剂量依赖性效应" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="表2"> 
表2： T计算丝裂霉素C的细胞毒性（单核、双核及多核细胞数量）和遗传毒性（双核微核细胞的数量和百分比）所需的参数。 所有计算量均为每个剂量点两个重复样本的平均值。
<img alt="甘露醇细胞毒性、遗传毒性表格：剂量反应、细胞计数、统计学显著性（细胞毒性）" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="表 3"> 
表 3： 计算甘露醇细胞毒性（单核、双核及多核细胞数量）和遗传毒性（含微核的双核细胞数量及百分比）所需的参数。 所有计算数值均为每个剂量点两个重复样本的平均值。
补充文件 1：完整方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充资料 2：掩膜列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

体外微核试验是一种评估遗传毒性和细胞毒性的成熟方法，但使用手动显微镜计数该试验费时费力，且存在主观性及不同评分者之间的变异性。本文描述了一种利用多光谱成像流式细胞术实现该试验完全自动化的操作方案。

体外微核（MN）试验常用于评估细胞毒性和遗传毒性，但通过手动显微镜计数微核结果费时费力且……

基于图像流的微核检测法可克服自动显微镜和传统流式细胞术等方法的多种局限性，包括通量低以及缺乏对事件的可视化确认。该技术的主要优势在于，所有用于确定遗传毒性和细胞毒性的关键事件均可被自动成像、识别和计分，无需制备显微镜载玻片。在细胞暴露于断裂剂和/或非整倍体诱导剂时，向T25培养瓶中九毫升适宜的细胞培养基内含有七至八乘以十的五次方个实验细胞的体系中加入一毫摩尔的目标化学物质，向对照组培养物中加入一毫升水。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时，然后将细胞转移至每瓶对应的一个15毫升聚丙烯管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管10毫升新鲜培养基中，接种至新的T25培养瓶中。随后，向每瓶中加入150微升细胞松弛素B储备液，使其终浓度为每毫升3微克。将培养瓶放回培养箱中，恢复培养时间应为1.5至2个倍增时间，具体时长参照经济合作与发展组织（OECD）指南建议。恢复培养结束后，将培养物分别转移至15毫升聚丙烯离心管中进行离心，并用5毫升75毫摩尔/升氯化钾重悬沉淀。轻轻倒置混匀3次，于4摄氏度孵育7分钟。孵育结束后，向每个样品中加入2毫升4%的甲醛，轻轻颠倒混匀3次。将样品放回4°C环境中10分钟，然后通过离心收集细胞。将沉淀重悬于100微升新鲜的4%甲醛中，孵育20分钟。孵育结束后，每管加入5毫升洗涤缓冲液，通过离心洗涤固定后的细胞，并将沉淀重悬于每管100微升洗涤缓冲液中。接着，将样品转移至各自的1.5毫升微量离心管中，用于血细胞计数板计数。每管中，向每毫升含1.0 × 10⁶个细胞的样品加入5微升浓度为100微克/毫升的Hoechst 33342，以及每100微升样品加入10微升浓度为500微克/毫升的RNase。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟后，将样品在微量离心机中离心，并从每根试管中弃去上清液，仅保留30微升。然后小心地重悬样品，注意避免产生气泡。若重悬过程中出现气泡，可轻轻弹击试管以去除气泡。进行多光谱成像流式细胞术检测样品时，首先打开 405 纳米激光器，并将激光功率设置为 10 毫瓦。关闭所有其他激光器，包括侧向散射激光器，并将明场设置为通道一和通道九。确认放大倍数滑块已设置为 60 倍，已选择高灵敏度模式，并且图像库中仅显示通道一、七和九。单击散点图，选择所有群体，并将 M01 的面积设为 X 轴。将 M01 的宽高比设为 Y 轴，单击方形区域，在单个细胞周围绘制一个区域。将该区域命名为“单个细胞”，然后在图上右键单击以选择区域。圈选单细胞区域，将X坐标设置为100和900，Y坐标设置为0.75和1。设置采集参数，并指定文件名和目标文件夹。然后将采集事件数更改为20,000，选择DNA阳性细胞群，运行第一个样本。要在 IDEAS 中打开数据文件，请单击“开始分析”以启动“打开文件向导”，然后浏览并选择所需的原始图像文件。接着单击“下一步”，在图像库中查找双核细胞。要创建掩膜，请单击选择目标图像，然后打开分析选项卡。单击“Masks”（掩膜）、“New”（新建）和“Function”（功能）以选择 LevelSet。在“Mask”（掩膜）下，选择 M07 和 Middle Level Mask，并将轮廓细节尺度设置为 3。然后单击两次“OK”（确定）。为了检测双核细胞的斑点数量，打开“分析”选项卡，选择“特征”和“新建”。在“特征类型”中选择“斑点计数”；在“掩膜”中选择最终的双核细胞掩膜，并将连通性设置为四，然后将名称更改为“Spot Count BNC”，点击“确定”并关闭以计算特征值。对于微核计数双核细胞直方图，点击直方图并选择非凋亡细胞作为父代群体。X轴参数选择微核计数双核细胞（Spot Count BNC），点击确定和线性区域，然后在Bim Two区域横跨绘制一个区域，并将该区域命名为2N。要创建微核掩膜，请从图像库中选择一个含有微核的双核细胞，然后在分析选项卡中打开掩膜功能。要创建一个斑点识别掩膜，请点击“新建”和“函数”，然后选择“斑点”。确认已选中“亮”单选按钮，并在掩膜下选择 M07。将“斑点与细胞背景比值”设置为 2，最小半径设置为 2，最大半径设置为 6。单击“确定”，然后再次单击“确定”以将掩膜添加到左侧列表中，接着单击“新建”以创建另一个掩膜。单击“Spot M07 Channel seven Bright two six two”掩膜，然后单击向下箭头将其添加到掩膜定义中，并单击“And”和“Not”运算符。单击向下箭头，将扩张范围掩膜添加到掩膜定义中。要创建多核群体掩膜，请点击分析、掩膜、新建、函数。在函数下选择范围。在掩膜下选择Watershed Dilate Set M07 Channel07、中间、三、二，并将显示图像设置为Channel 07。将面积的最小值和最大值分别设置为 135 和 5000，将长宽比的最小值和最大值分别设置为 0.4 和 1。点击“确定”，在名称字段中将文本更改为 POLY mask，然后点击“确定”和“关闭”。要创建自定义视图，请点击“图像库属性”按钮，打开“复合图像”选项卡，然后点击“新建”。在“名称”下，输入通道 01 至通道 07。单击“添加图像”，在“图像”下选择通道 01，并将百分比设置为 100。再次单击“添加图像”，在“图像”下选择通道 07，并将百分比设置为 100。单击“查看”选项卡，单击“新建”，在“名称”下输入 BNC 和 MN 掩膜。然后单击“添加列”，在“图像类型”下选择通道 01，在“掩膜”下选择“无”。单击“添加列”，在“图像类型”下选择通道 07，在“掩膜”下选择“无”。单击“添加列”，然后单击“复合”单选按钮，再单击“确定”以完成自定义视图。单击“视图”下拉菜单，选择“BNC和MN掩模”视图。单击“显示/隐藏掩模”按钮。为了列举关键事件，请打开“报告”选项卡，点击“定义统计报告”，然后在新窗口中点击“添加列”。要添加双核细胞计数的统计项，在“统计”下选择“计数”，在“选定群体”下选择BNC群体，然后点击“添加统计”以将该统计项加入列表并保存模板。当所有统计项均已添加至列表后，点击“关闭”，然后点击“确定”，最后保存数据分析模板。为了批量处理实验文件，在“工具”菜单下，单击“批量数据文件”，然后在新窗口中单击“添加批量”。单击“添加文件”以选择要加入批量处理的实验文件，然后在“选择模板或数据分析文件”选项下，单击“打开文件夹”按钮。浏览至刚刚保存的模板并将其打开。单击“确定”以关闭当前窗口，然后单击“提交批次”以开始对所有文件进行批量处理。此处显示了用于识别双核细胞的四个选定面板。这些双变量图和直方图可用于选择双核细胞，并识别出具有相似圆度、面积和强度且彼此分离良好的双核细胞。明场和Hoechst图像，以及双核细胞和微核的掩膜，有助于双核细胞和微核的识别与计数。应用点计数功能时，利用多核掩膜来识别单核、三核和四核细胞。然后将三核和四核细胞的数量相加，得到用于计算细胞毒性的最终多核细胞数量。此处展示了内源性秋水仙素、断裂剂丝裂霉素C以及阴性对照甘露醇的代表性遗传毒性和细胞毒性数值，以证明该方案的有效性。使用适当浓度的DNA染料对细胞进行标记至关重要，可确保获得高质量的图像，从而便于清晰识别和计分所有关键事件。这些技术还可应用于辐射生物剂量学中的微核试验，从而对可能受到辐射暴露的个体进行剂量估算。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用多光谱成像流细胞测定法执行体外微核测定的自动化方法

本文介绍了一种利用多光谱成像流式细胞术定量分析聚酸酐纳米颗粒或细菌被RAW...

利用多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒与细菌的细胞内化作用

本研究的主要目的是监测碳纳米管（CNTs）的细胞摄取及其最终的胞吐过程。基于这一视角，我们提出了一种独特的方法，利用多光谱成像流式细胞术，能够在数量具有统计学意义的细胞中对碳纳米管进行定量和定位分析。...

利用多光谱成像流式细胞术对细胞内碳纳米管的定位与相对定量分析

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。...

通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

采用多孔微孔板的自动化检测方法具有显著优势，可通过单次实验评估多种条件，从而有效鉴定信号通路调控因子。本文中，我们将已建立的大胞饮囊泡成像与定量检测方案优化为适用于96孔微孔板的格式，并提供了利用多功能酶标仪进行自动化操作的全面流程说明。...

用于荧光标记巨胞饮体定量的自动化成像与分析

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

微核（MN）试验是一种用于量化DNA损伤的成熟检测方法。然而，使用传统技术（如人工显微镜检查或基于特征的图像分析）对试验结果进行计分十分耗时且具有挑战性。本文描述了利用成像流式细胞术数据开发人工智能模型以实现MN试验自动计分的方法学。...

利用成像流式细胞术与人工智能实现微核试验的自动化

本方案描述了一种利用成像流式细胞术定量测定微生物自聚集的方法。...

利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

学习使用多光谱成像流细胞测定法进行体外微核测定的自动化方法，用于评估遗传毒性和细胞毒性。该技术可提高检测通量并减少评分主观性，适用于药物开发中的高通量筛选。

一种利用多光谱成像流式细胞术进行体外微核试验的自动化方法

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