使用多光谱成像流细胞测定法执行体外微核测定的自动化方法

基于图像流的微核测定可以克服自动化显微镜和常规流式细胞学等方法的一些局限性，包括低吞吐量和缺乏事件的视觉确认。该技术的主要优点是，确定基因毒性和细胞毒性的所有所需事件都可以自动成像、识别和评分，而无需创建显微镜幻灯片。对于接触克拉斯特根和/或脑细胞的细胞，在T25烧瓶中适当的细胞培养基的9毫升中，将一毫米感兴趣的化学物质加入到7至8倍至10，以9毫升的适当细胞培养基和1毫升水添加到控制培养物中。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育烧瓶3小时，然后将细胞转移到每瓶15毫升聚丙烯管中。通过离心收集细胞，并在每管10毫升新鲜培养中重新供应颗粒，以播种于新的T25培养瓶中。然后在每个烧瓶中加入150微升的细胞链素B的库存浓度，以达到每毫升3微克的最终浓度。

按照经济合作与发展组织准则的建议，将烧瓶返回孵化器，回收时间等于1.5至2倍。在回收期结束时，将培养物转移到单独的 15 毫升聚丙烯管中进行离心，并在 5 毫升的 75 毫摩尔氯化钾中重新入库。通过反转轻轻混合三次，在四摄氏度下孵育样品七分钟。

在孵育结束时，在每个样品中加入两毫升4%的甲醛，并轻轻地与三个反转混合。将样品返回4摄氏度10分钟，然后通过离心收集细胞。将颗粒重新用 100 微升新鲜 4% 的甲醛中重新暂停 20 分钟。

在孵育结束时，通过离心将固定细胞洗涤到每管5毫升的洗涤缓冲液中，并在每管100微升洗涤缓冲液中重新填充颗粒。接下来，将样品转移到单个1.5毫升微离心管，以计算血细胞计。每毫升 Hoechst 33342 每 1.0 x 10 的 5 微升添加到每毫升 6 个细胞中，每 100 微升每管 100 微升 RNase 添加 10 微升 500 微克。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育30分钟后，将样品在微离心机中离心，并每管取出除30微升的超量液。然后小心地重新暂停样品，注意不要诱发气泡的形成。如果气泡在重新暂停时确实出现，请轻轻轻拂管子以将其清除。

要通过多光谱成像流式细胞仪运行样品，首先打开 405 纳米激光器，将激光功率设置为 10 毫瓦。禁用所有其他激光器，包括侧散射激光器，并设置光场通道 1 和 9。确认放大滑块设置为 60 倍，选择高灵敏度模式，并且图像库中仅显示通道 1、7 和 9。

单击散点图并选择 X 轴上的所有总体和面积 M01。选择 Y 轴上的纵横比 M01，然后单击方形区域以绘制单个单元格周围的区域。命名此区域单个单元格，右键单击绘图以选择区域。

突出显示单个单元格区域，将 X 坐标更改为 100 和 900，将 Y 坐标更改为 0.75 和 1。设置采集参数并指定文件名和目标文件夹。然后将事件数更改为 20，000，选择 DNA 阳性总体，然后运行第一个样本。

若要在 IDEAS 中打开数据文件，请单击"开始分析"以启动打开文件向导，然后浏览以选择所需的原始图像文件。然后单击"下一步"，在图像库中浏览双装单元格。要创建蒙版，请单击以选择感兴趣的图像并打开分析选项卡。

单击"蒙版、新"和"函数"以选择"级别集"。在"蒙版"下，选择 M07 和中层蒙版，将轮廓细节比例设置为三。然后单击"确定"两次。

要发现计数双化单元格特征，请打开"分析"选项卡并选择"特征"和"新"。对于要素类型，选择"点计数"。对于掩码，选择最终的二进制蒙版，将连接性设置为四，然后将名称更改为"点数 BNC"，然后单击"确定"并关闭以计算要素值。

对于点计数双化细胞直方图，单击直方图并选择非凋亡作为父总体。对于 X 轴要素，选择"点数 BNC"，然后单击"确定"和"线性区域"，然后在 Bim 2 上绘制一个区域并命名此区域 2N。要创建微核掩码，请从图像库中选择包含微核的二进制单元格，并在"分析"选项卡中打开掩码。

要创建点标识掩码 1，请单击"新"和"函数"，然后选择"点"。确认已选择"亮"单选按钮，并在蒙版下选择 M07。将"点到细胞背景比率"和"最小半径"设置为 2，将"最大半径"设置为 6。

单击"确定"和"确定"将蒙版添加到左侧列表中，然后单击"新"以创建另一个蒙版。单击 Spot M07 通道七亮二六二掩码，然后单击向下箭头将其添加到蒙版定义中，然后单击"和"和"和"不是运算符"。单击向下箭头可将扩张范围蒙版添加到蒙版定义中。

要创建多核总体掩码，请单击"分析、蒙版、新"和"函数"。在"函数"下，选择"范围"。在"蒙版"下，选择分水岭扩张集 M07 Channel07、中间、三、二，然后将图像设置为显示到通道 07。

将最小和最大面积值分别设置为 135 和 5000，并分别将最小和最大纵横比值设置为 0.4 和 1。单击"确定"，在名称字段中，将文本更改为"POLY"蒙版，然后单击"确定"和"关闭"。若要创建自定义视图，请单击"图像库属性"按钮，打开"合成"选项卡，然后单击"新"。

在名称下，将通道 01 输入通道 07。单击"添加图像"，在"图像"下选择"通道 01"，并将百分比设置为 100。再次单击"添加图像"，在图像下选择通道 07，并将百分比设置为 100。

单击"查看"选项卡，单击"新"，在"名称"下输入 BNC 和 MN 掩码。然后单击"添加列"，在"图像类型"下，选择"通道 01"，在"蒙版"下选择"无"。单击"添加列"，在"图像类型"下选择"通道 07"，在"蒙版"下单击"无"。

单击"添加列"，单击"复合单选按钮"，然后单击"确定"以完成自定义视图。单击"查看"下拉菜单，然后单击 BNC 和 MN 蒙版视图。单击"显示隐藏蒙版"按钮。

若要枚举关键事件，请打开"报表"选项卡，然后单击"定义统计信息报告"，然后在新窗口中单击"添加列"。若要添加双uc化单元格计数统计信息，请在"统计"下选择"计数"和"选定总体"下，选择 BNC 总体，然后单击"添加统计信息"以将统计信息添加到列表中并保存模板。将所有统计信息添加到列表中后，单击"关闭"，然后单击"确定"，然后保存数据分析模板。

要批处理实验文件，请单击"工具"菜单下"批处理数据文件"，然后单击"添加新窗口中的添加批处理"。单击"添加文件"选择要添加到批次的实验文件，然后单击"选择模板或数据分析文件"选项下的"打开文件夹"按钮。浏览到刚刚保存的模板并打开它。

单击"确定"以关闭当前窗口。然后单击"提交批次"以开始所有文件的批处理。此处显示四个用于识别双化细胞的选定面板。

这些双变量图和直方图允许选择双化细胞，以及识别具有两个核的细胞，这些细胞具有相似的圆环、面积和强度，并且彼此分离良好。这些B明场和霍奇斯特图像，以及二元细胞和微核掩码，有助于识别和枚举二元细胞和微核。点数特征的应用使用多核掩码来识别单核、三核和四核核细胞。

然后可以总结三核细胞和四核细胞的数量，以获得计算细胞毒性所需的多核细胞的最终数量。在这里，显示具有代表性的基因毒性和细胞毒性值的内源性共生素，克拉斯特根异霉素C，和负对照，曼尼托，以证明协议的有效性。标记具有适当浓度的 DNA 染色的细胞对于确保高质量图像捕获至关重要，从而可以轻松识别和评分所有关键事件。

这些技术也适用于辐射生物剂量测定的微核测定，它允许对可能接触过辐射的个体进行剂量估计。