利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞
2019年8月20日
本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。
本方案有助于人们分析在不同流体剪切应力下内皮细胞的形态以及区域分子的表达。该技术的主要优势在于能够直接评估不同流体剪切应力下的血管内皮细胞。在执行该操作时，关键步骤是使用 freshly prepared 多聚甲醛并进行良好的灌注。
按照文本方案所述，首先对一只12周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。通过轻轻夹捏尾巴确认麻醉效果。使用胶带将小鼠的四肢固定在一堆纸巾上。
用镊子提起小鼠的皮肤，用剪刀从腹部剪至胸腔顶部。用锋利的剪刀在肋骨下方切开腹腔。用镊子提起胸骨，并剪断膈肌。
然后剪除肋骨以暴露胸腔。用剪刀在肝脏上方剪断腔静脉。通过左心室，用含有每毫升40单位肝素的预冷生理盐水对动脉系统进行压力灌注5分钟，直至肺和肝脏变为苍白。
然后用预冷的含4%多聚甲醛的PBS灌注4分钟。去除所有肌肉、器官和脂肪，直至暴露主动脉。将小鼠置于解剖显微镜下。
使用精细镊子和精细剪刀在解剖显微镜下清晰暴露主动脉，并尽可能干净地去除主动脉周围的结缔组织。用精细剪刀从心脏至腹腔干处分离胸主动脉。将主动脉置于含磷酸盐缓冲液（PBS）的6厘米细胞培养皿中。
沿小弯侧纵向切开主动脉，然后使用显微剪沿大弯侧切开主动脉弓的三个分支，包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，直至到达直部段。用含1%聚氧乙烯辛基苯基醚的PBS溶液对主动脉进行10分钟的通透处理。随后，在12孔细胞培养板中，用含2.5%吐温20的Tris缓冲盐水配制的10%正常山羊血清于室温下封闭主动脉1小时。
接下来，将主动脉置于封闭缓冲液中孵育，缓冲液中含有5克/毫升的兔抗VCAM1和5克/毫升的大鼠抗VE-钙黏蛋白，在4摄氏度下孵育过夜。用洗涤液将样本冲洗三次后，在室温下避光孵育荧光标记的二抗一小时。再用洗涤液冲洗三次。
将主动脉用 DAPI 复染 10 分钟，并置于避光处。然后用洗涤液冲洗染色后的主动脉三次。将主动脉放置在盖玻片上，腔面朝下，缓慢移入先前已滴加在盖玻片上的抗荧光淬灭封片液中。
轻轻拉伸主动脉，以保持样本平整。将盖玻片翻转后置于玻片上，注意避免样本与玻片之间产生气泡。
使用激光扫描共聚焦显微镜观察主动脉。利用Image-Pro Plus软件分析面视图图像中目标区域不同通道的颜色强度。图中显示了小鼠主动脉血管内皮细胞的面视免疫荧光染色图像。
显示了小鼠主动脉不同区域在不同血流模式下血管细胞粘附蛋白1的正面免疫荧光染色，以及与内皮细胞标志物VE-钙黏蛋白的共表达情况。同时使用DAPI复染以显示细胞核，便于更好地观察。在显微镜下观察Z轴层扫图像时，可通过细胞核形态轻松区分内皮细胞与平滑肌细胞。
内皮细胞的细胞核呈椭圆形，比呈梭形的平滑肌细胞核更大。与主动脉弓外侧曲以及胸主动脉等稳态血流区域相比，主动脉弓内侧曲等扰动血流区域的VCAM-1表达更为丰富。此处小鼠主动脉的内侧曲区域被标记为扰动血流（d-flow）区域，而外侧曲及胸主动脉区域则为稳态血流区域。
经过适当的改进，该技术还可用于分析血管通透性以及大分子在内皮细胞内膜中的位置。
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概述
本研究介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术可用于分析在不同流体剪切应力条件下这些细胞的细胞和分子表型，尤其适用于与动脉粥样硬化发展相关的研究。
关键研究组成部分
研究领域
- 内皮细胞生物学
- 动脉粥样硬化研究
- 免疫荧光技术
背景
- 内皮细胞在血管生物学中的重要性
- 剪切应力在内皮细胞功能中的作用
- 血流模式与动脉粥样硬化发展的关联
使用的方法
- 免疫荧光染色方案
- 小鼠模型（C57BL/6）
- 共聚焦显微镜成像
主要结果
- 使用荧光标记物对内皮细胞进行直接评估
- 在血流紊乱区域，VCAM-1 表达升高
- 内皮细胞与平滑肌细胞核形态之间具有清晰区别
结论
- 本研究提供了一种可靠的检测内皮细胞对血流动力学力响应的方法。
- 研究结果对于理解血管生物学及动脉粥样硬化发生机制具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
在生理剪切应力下直接观察完整的内皮单层细胞，可为动脉粥样硬化研究中血管靶点的机制性风险评估提供支持。该方法通过将血流动力学力与原位分子表型关联，提高靶点验证的预测可信度。该体系可在无需基因操作或药物干预的情况下，为早期病理生理学研究提供与疾病相关的研究平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将紊乱的血流模式与作为早期炎症标志物的 VCAM-1 上调相关联，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供一种可靠且可重复的方法，利用内源性内皮标志物（如 VE-Cadherin）进行功能靶点验证。
- 预测价值：通过识别在临床前动脉粥样硬化模型中病变形成前出现的分子反应，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成标准化的定量免疫荧光输出结果，适用于内皮表型的高内涵分析。
- 可扩展性：可在定义的流动条件下同时评估多个主动脉区域，实现比较性筛选。
- 检测标准化：采用一致的灌注、封闭和染色方案，以最大限度减少不同实验和实验室之间的变异。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过检测易发生斑块形成的区域中内皮细胞的反应，直接模拟早期动脉粥样硬化的易感性。
- 转化连续性：将血流动力学介导的机械生物学效应与人类血管病理相关的分子检测结果相联系。
- 风险校正的进展：在进行体内有效性测试之前，通过验证靶点在病理生理剪切应力条件下的调控作用，实现对靶点的机制性风险评估与降低。
流程与工作流整合
该技术适用于从靶点假设验证到表型筛选，再到临床前验证的整个发现流程，尤其适用于以血管系统为靶向的研究项目。
- 发现生物学：通过在受控剪切应力下直接观察内皮细胞的激活状态，支持假设验证。
- 筛选：提供可定量、可多重检测的读数（例如 VCAM-1、VE-钙黏蛋白、细胞核形态），用于比较化合物或基因对内皮表型的影响。
- 分析：提供空间分辨的基于强度的测量方法，可对主动脉不同区域的分子表达水平进行统计学比较。
- 转化研究：将体外流动模型与类似体内内皮反应相连接，提高临床前研究的预测价值。
- 企业级复用：建立可重复使用的血管表型分析平台，适用于多种动脉粥样硬化、高血压或血管炎症研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将血流动力学力与完整组织中的特定内皮分子表型联系起来，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过定义明确的灌注、固定和染色步骤，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：在病理生理学相关的力学信号条件下验证靶点结合，从而优化“进行/不进行”的决策。
- 项目组合影响：基于靶点在早期动脉粥样硬化内皮表型中的调控情况，实现对靶点的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备小鼠血管解剖、灌注技术及共聚焦显微镜操作的专业知识。
- 依赖于灌注设备、解剖显微镜以及具备光谱拆分功能的激光扫描共聚焦系统的可及性。
- 需在不同操作人员和实验场所之间对灌注压力、固定剂温度及抗体滴定条件进行标准化。
- 应用于其他血管床（如颈动脉、冠状动脉）时，可能需要优化解剖和通透步骤。
- 仅限于终点分析，无法支持在流动条件下对内皮细胞反应的实时动态成像。
