Name: 使用 En 面免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 学习使用免疫荧光染色技术直接观察小鼠主动脉血管内皮细胞，分析不同流体剪切应力条件下的细胞形态与分子表型。该方法为研究动脉粥样硬化机制提供了可靠的实验手段。

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本研究由国家自然科学基金（项目编号：81670451，81770430）、上海市启明星计划（项目编号：17QA1403000）以及上海市科学技术委员会（项目编号：14441903002，15411963700）资助。

所有动物实验均按照上海交通大学动物资源委员会批准的实验方案进行。
1. 小鼠主动脉灌注
<ol>
	<li>简要而言，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg 体重）对12周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。通过轻轻夹捏尾巴确认麻醉效果。 
	注意：若未观察到任何运动反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。</li>
	<li>使用胶带将小鼠的四肢固定在一层纸巾上。</li>
	<li>用镊子提起小鼠皮肤，用剪刀从腹部开始沿中线向上剪至胸腔顶部。</li>
	<li>用锋利的剪刀在肋骨下方切开腹腔。</li>
	<li>用镊子提起胸骨，剪断膈肌，随后剪除肋骨以暴露胸腔。</li>
	<li>用剪刀在肝脏上方剪断下腔静脉。</li>
	<li>通过左心室以100 mmHg的压力灌注预冷的含肝素（40单位/mL）生理盐水5分钟，直至肺和肝脏变为苍白；随后用预冷的含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）灌注3分钟。</li>
	<li>去除所有肌肉、器官和脂肪组织，直至暴露主动脉。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下。</li>
</ol>
2. 主动脉的解剖与纵向切开
<ol>
	<li>在解剖显微镜下清晰暴露主动脉，并使用精细镊子和精细剪刀尽可能彻底清除主动脉周围的结缔组织（图1）。</li>
	<li>用精细剪刀从心脏至腹腔干处分离胸主动脉，并将主动脉置于盛有PBS的6 cm细胞培养皿中。沿主动脉小弯和大弯纵向切开，直至到达直段。使用显微剪刀切开主动脉弓的三个分支，包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，如图2所示。</li>
</ol>
3. 主动脉的预处理与免疫染色
<ol>
	<li>在12孔细胞培养板中，用含0.1%聚氧乙烯辛基苯基醚的PBS溶液对主动脉进行通透处理，持续10分钟，随后在室温下用含10%正常山羊血清和2.5%聚山梨酯20的Tris缓冲盐水（TBS）封闭1小时。</li>
	<li>接着，将主动脉置于封闭缓冲液中，加入5 µg/mL兔抗VCAM-1抗体和5 µg/mL大鼠抗VE-钙黏蛋白抗体，于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用洗涤液（含2.5%聚山梨酯20的TBS）将样本清洗3次后，加入荧光标记的二抗（1:1,000稀释，Alexa Fluor 555标记的抗兔IgG和Alexa Fluor 488标记的抗大鼠IgG），室温孵育1小时。再用洗涤液清洗3次。</li>
	<li>用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 µg/mL）对主动脉进行复染，持续10分钟，随后用洗涤液清洗3次。</li>
</ol>
4. 将主动脉固定在玻片上
<ol>
	<li>将主动脉置于盖玻片上，管腔面朝下，缓慢移至预先滴加在盖玻片上的抗荧光淬灭封片液中。轻轻拉伸主动脉，以保持样本平整。</li>
	<li>将盖玻片翻转，放置在载玻片上。操作时需注意避免样本与玻片之间残留气泡。</li>
</ol>
5. 主动脉的观察
<ol>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜观察主动脉。</li>
	<li>利用Image-Pro Plus软件分析内面图像中目标区域不同通道的颜色强度。</li>
</ol>

<ol><li>Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li>
<li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li>
<li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li>
<li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+%26%2334%3Ben+face%26%2334%3B+preparations+one+cell+in+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A method for the production of &#34;en face&#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li>
<li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).</li>
<li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12%2F15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration%3A+a+new+role+for+15%28S%29-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li>
<li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q%2FTNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li>
<li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li>
<li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li>
<li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CRP%2C+Atherogenic+LDL%2C+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li>
<li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

内皮细胞暴露于多种促动脉粥样硬化因子，包括脂质、炎症介质和流体剪切应力1,11,12。对原位内皮细胞进行直接观察，可特异性分析细胞形态、细胞间连接及分子表达模式在损伤刺激下的变化，具有独特优势。
既往研究提出了两种不同的内皮面免疫组织化学技术，用于观察动脉壁的内皮层4,5。其中一种方法是通过特殊技术将内皮层从血管壁剥离，从而获得单层内皮细胞，但该技术难以掌握，且可能导致动脉分支部位大量内皮细胞丢失4。另一种方法则是如我们所述，将整段动脉壁进行封片。整体封片法操作简便，可在兔和大鼠中完整保留整个内皮单层5,13。然而，将...

血管结构的早期变化主要起始于内皮层，内皮层通过其细胞间的紧密连接复合物，在血液与血管壁之间发挥选择性屏障作用1。大量证据表明，血流的机械效应在调节内皮功能中具有关键作用2。由血流产生的流体剪切应力是一种摩擦力，可根据不同血管部位的特定血流模式，差异性地塑造内皮细胞的形态和功能2,3。与血流稳定的区域（如动脉的直线段）相比，动脉粥样硬化病变更倾向于发生在血流紊乱（d-flow）的部位，例如血管弯曲处、分流处和分支点。因此，直接观察内皮细胞的形态及其分子表达模式，将有助于深入理解在不同血流条件下内皮细胞的结构与功能表型。
培养的内皮细胞可能无法完全表达其在体内的真实表型，部分原因在于缺乏流体剪切应力、周围细胞因子以及细胞间或细胞与细胞外基质相互作用的影响。为克服这一问题，可通过传统的免疫组织化学方法在横切面上研究完整的内皮细胞单层。然而，由于内皮单层极为纤薄且脆弱，通常难以清晰观察。已有研究采用表面免疫组织化学技术来观察内皮内表面，但该方法操作复杂，结果不稳定，因为内皮容易从下方组织剥离；或者仅能使用大鼠或兔的部分动脉壁进行制片，而这些动物的血管壁较厚4,5。
在诸多方面，小鼠模型相较于其他动物具有显著优势。本文中，我们采用一种改良的内皮面免疫荧光技术，用于分析C57BL/6小鼠主动脉弓和胸主动脉的内皮细胞。该技术已被广泛应用于研究不同血流模式下以及动脉粥样硬化发展过程中内皮细胞的病理生理学特征6,7,8,9,10。该方法可使科研人员清晰地观察内皮层的整个表面，并比较特定蛋白在不同流体剪切应力区域中的表达模式。

<table><tbody><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>RWD Life Science</td><td>F11001-11</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>RWD Life Science</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>RWD Life Science</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>微型弹簧剪刀</td><td>RWD Life Science</td><td>S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯辛基苯基醚（Triton X-100）</td><td>Amresco</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯20（Tween 20）</td><td>Amresco</td><td>0777</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab134047</td><td></td></tr><tr><td>VE-钙黏蛋白抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的抗兔 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的抗大鼠 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-21208</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

内皮细胞表型和形态的异常改变被认为是动脉粥样硬化发病过程中的初始事件。对完整内皮层进行直接观察，将为理解功能失调的内皮细胞中发生的细胞和分子事件提供有价值的信息。本文介绍一种改良的内皮面免疫荧光染色技术，该技术可使科研人员获得清晰的完整内皮表面图像，并原位分析分子表达模式。该方法简便可靠，适用于观察主动脉不同部位的完整内皮单层细胞。该技术可能是研究动脉粥样硬化病理生理机制，尤其是早期阶段的有力工具。

一只12周龄的C57BL/6小鼠被实施安乐死，并用含有40单位/毫升肝素的生理盐水灌注，随后用预冷的4%多聚甲醛灌注。在解剖显微镜下暴露小鼠主动脉（图1），进行解剖并纵向切开（图2）。如图3和表1所示，对血管内皮细胞进行表面免疫荧光染色。以VE-钙黏蛋白作为内皮细胞标记物，检测不同血流模式下小鼠主动脉不同区域血管细胞黏附蛋白-1（VCAM-1）的表达情况。同时用DAPI复染细胞核，以增强可视化效果。通过显微镜观察z-轴层扫图像时，可根据细胞核形态轻松区分内皮细胞和平滑肌细胞，因为内皮细胞核呈椭圆形且较纺锤形的平滑肌细胞核更大。典型的表面成像结果如图4所示。使用LSM 710激光扫描共聚焦显微镜（材料表）配备FLUAR 40x/1.3油镜对主动脉进行观察...

本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。

内皮细胞表型和形态的异常改变被认为是动脉粥样硬化发病机制中的初始事件。直接观察……

本方案有助于人们分析在不同流体剪切应力下内皮细胞的形态以及区域分子的表达。该技术的主要优势在于能够直接评估不同流体剪切应力下的血管内皮细胞。在执行该操作时，关键步骤是使用 freshly prepared 多聚甲醛并进行良好的灌注。按照文本方案所述，首先对一只12周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。通过轻轻夹捏尾巴确认麻醉效果。使用胶带将小鼠的四肢固定在一堆纸巾上。用镊子提起小鼠的皮肤，用剪刀从腹部剪至胸腔顶部。用锋利的剪刀在肋骨下方切开腹腔。用镊子提起胸骨，并剪断膈肌。然后剪除肋骨以暴露胸腔。用剪刀在肝脏上方剪断腔静脉。通过左心室，用含有每毫升40单位肝素的预冷生理盐水对动脉系统进行压力灌注5分钟，直至肺和肝脏变为苍白。然后用预冷的含4%多聚甲醛的PBS灌注4分钟。去除所有肌肉、器官和脂肪，直至暴露主动脉。将小鼠置于解剖显微镜下。使用精细镊子和精细剪刀在解剖显微镜下清晰暴露主动脉，并尽可能干净地去除主动脉周围的结缔组织。用精细剪刀从心脏至腹腔干处分离胸主动脉。将主动脉置于含磷酸盐缓冲液（PBS）的6厘米细胞培养皿中。沿小弯侧纵向切开主动脉，然后使用显微剪沿大弯侧切开主动脉弓的三个分支，包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，直至到达直部段。用含1%聚氧乙烯辛基苯基醚的PBS溶液对主动脉进行10分钟的通透处理。随后，在12孔细胞培养板中，用含2.5%吐温20的Tris缓冲盐水配制的10%正常山羊血清于室温下封闭主动脉1小时。接下来，将主动脉置于封闭缓冲液中孵育，缓冲液中含有5克/毫升的兔抗VCAM1和5克/毫升的大鼠抗VE-钙黏蛋白，在4摄氏度下孵育过夜。用洗涤液将样本冲洗三次后，在室温下避光孵育荧光标记的二抗一小时。再用洗涤液冲洗三次。将主动脉用 DAPI 复染 10 分钟，并置于避光处。然后用洗涤液冲洗染色后的主动脉三次。将主动脉放置在盖玻片上，腔面朝下，缓慢移入先前已滴加在盖玻片上的抗荧光淬灭封片液中。轻轻拉伸主动脉，以保持样本平整。将盖玻片翻转后置于玻片上，注意避免样本与玻片之间产生气泡。使用激光扫描共聚焦显微镜观察主动脉。利用Image-Pro Plus软件分析面视图图像中目标区域不同通道的颜色强度。图中显示了小鼠主动脉血管内皮细胞的面视免疫荧光染色图像。显示了小鼠主动脉不同区域在不同血流模式下血管细胞粘附蛋白1的正面免疫荧光染色，以及与内皮细胞标志物VE-钙黏蛋白的共表达情况。同时使用DAPI复染以显示细胞核，便于更好地观察。在显微镜下观察Z轴层扫图像时，可通过细胞核形态轻松区分内皮细胞与平滑肌细胞。内皮细胞的细胞核呈椭圆形，比呈梭形的平滑肌细胞核更大。与主动脉弓外侧曲以及胸主动脉等稳态血流区域相比，主动脉弓内侧曲等扰动血流区域的VCAM-1表达更为丰富。此处小鼠主动脉的内侧曲区域被标记为扰动血流（d-flow）区域，而外侧曲及胸主动脉区域则为稳态血流区域。经过适当的改进，该技术还可用于分析血管通透性以及大分子在内皮细胞内膜中的位置。

using-en-face-immunofluorescence-staining-to-observe-vascular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用 En 面免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞的显微成像可用来表征细胞骨架结构的动态变化。与使用固定样本的技术不同，该方法可在同一细胞中详细评估在不同物理、药物或炎症刺激之前、期间和之后肌动蛋白细胞骨架随时间发生的变化。...

表达GFP-肌动蛋白的活内皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的研究

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。...

通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

来源：Gucciardo, E., 等.，增生性糖尿病视网膜病变中纤维血管并发症的离体组织培养模型。J. Vis. Exp.

凝胶包埋的患者来源病变纤维血管组织的免疫荧光染色

来源：Alluri, H.，等．利用氧糖剥夺与再复氧建立体外缺血-再灌注损伤模型以研究血脑屏障功能障碍．J. Vis. Exp.

内皮细胞中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位

本报告描述了一种在生理流动条件下可视化和分析前列腺癌中循环肿瘤细胞/内皮细胞相互作用的独特方法。...

体外 观察前列腺癌患者来源的循环肿瘤细胞与人血管内皮细胞之间E-选择素介导相互作用的方法

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。...

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

本文介绍了一种改良的相对简便的方法，利用荧光染料二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE），对肥胖小鼠模型新鲜分离的完整主动脉进行内皮表面（en...

En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

我们介绍了一种利用基质凝胶栓塞血管生成实验的改良方法，在小鼠体内研究人源内皮细胞与周细胞相互作用的实验方案。...

体内小鼠基质凝胶栓塞实验研究人源内皮细胞-周细胞相互作用

本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

本文描述了一种制备小鼠颈动脉和主动脉内皮面标本的方法。此类标本经特异性抗体免疫荧光染色后，可通过共聚焦显微镜观察整个血管壁内蛋白质的定位以及细胞类型的鉴定。...

En Face 小鼠血管制备

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