通过Rev免疫共沉淀与质谱技术鉴定HIV-1复制过程中的核仁因子

本方案提供了用于鉴定和表征维持 HIV-1 感染周期的病毒、核仁及非核仁宿主因子的替代方法。该方法所采用的概念可应用于其他需要对尚未充分研究的通路进行表征的病毒和疾病模型。文中还描述了针对其他蛋白质模型进行优化的故障排除技术。

进行该实验操作的人员为希望之城贝克曼研究所分子与细胞生物学系的科学家 Haitang Li 和 Pritsana Chomchan，以及希望之城蛋白质组学核心设施和分子免疫学系成员 Roger Moore。首先，在三个 100 毫米培养皿中培养 HLfB 稳定表达的 HeLa 细胞系，使其密度达到每毫升 2×10⁶ 个细胞。当细胞达到适当浓度后，在一个 15 毫升离心管中将 20 微克含有目标 Rev 核仁定位信号 3' Flag 突变的质粒与 1.76 毫升 TE 79/10 混合，随后加入 240 微升 2 摩尔/升的氯化钙，并充分混匀。

接下来，将离心管中的内容物逐滴转移至含有 2 毫升 2x HBS 的新 15 毫升离心管中，随后在涡旋振荡器上混匀。室温静置 30 分钟后，涡旋振荡沉淀物。将一毫升悬浮液逐滴加入三个 100 毫米 HLfB 培养皿中，同时轻轻旋转培养皿使培养基混匀。

在细胞培养箱中孵育六小时后，将转染混合物更换为10毫升新鲜培养基，并将细胞放回培养箱继续孵育42小时。转染48小时后，将每块培养板置于生物安全二级组织培养罩内的冰床上。移除细胞培养基，并用10毫升预冷的PBS轻轻冲洗细胞，注意不要破坏细胞层。

清洗细胞后弃去 PBS。随后，每孔加入含蛋白酶抑制剂混合液的 1 毫升裂解缓冲液处理细胞。倾斜培养板使细胞聚集于一侧，用细胞刮棒手动刮取细胞层。

使用1,000微升移液器，将每块培养板的裂解液汇集至预冷的15毫升离心管中，在冰上孵育15分钟，每隔5分钟涡旋混匀一次。孵育结束后，将裂解液分装至三个1.5毫升微量离心管中，通过离心收集裂解液。将上清液转移至新的15毫升离心管中，并按照文稿所述方法测定病毒蛋白裂解液的浓度。

为了对 Rev 核仁定位信号三端 Flag 进行共免疫沉淀，用 500 微升新鲜裂解缓冲液（每轮洗涤均添加蛋白酶抑制剂混合物）在低温环境或冰上将 25 微升 M2 亲和凝胶珠洗涤三次。每次洗涤均需在低温环境或冰上操作。最后一次洗涤后，在 5 毫升裂解缓冲液的终体积中，向洗涤后的凝胶珠中加入浓度为 1 毫克/毫升的病毒蛋白裂解液。

将反应液在 4°C 条件下旋转孵育三小时。孵育结束后，通过离心沉淀与病毒蛋白裂解液偶联的磁珠。收集上清液，用于测定免疫沉淀后裂解液的蛋白浓度。

有关样本储存说明，请参见原文。向病毒蛋白裂解液偶联的磁珠沉淀中加入 750 微升裂解缓冲液，将磁珠转移至 1.5 毫升微量离心管中，在 4 摄氏度下于旋转仪上洗涤 5 分钟。通过离心收集磁珠，并如上所述在旋转仪上再进行两次洗涤。

最后一次洗涤后，使用夹紧的长型加样枪头从珠子-共免疫沉淀复合物中去除裂解缓冲液的任何残留。将珠子重悬于55微升2x上样缓冲液中。然后，于95摄氏度煮沸样品10分钟。

将25微升洗脱液分别上样至一块Western印迹凝胶和一块考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE凝胶电泳完成后，用25毫升超纯水冲洗凝胶三次，每次15分钟。最后一次洗涤后，向凝胶中加入100毫升考马斯亮蓝染色液。

完整的染色方案请参见原文。对于凝胶条带的消化，首先使用洁净的剃刀片将凝胶中代表每种突变的整个泳道的条带切成约五毫米见方的小块。将每一块凝胶分别放入干净的0.5毫升微量离心管中。

用体积比为1:1的乙腈-水溶液配制的100毫摩尔碳酸氢铵在室温下覆盖胶条两次，每次洗涤15分钟。然后，在真空离心浓缩仪中将胶粒干燥5分钟。为还原蛋白质，将干燥的胶粒用含10毫摩尔二硫苏糖醇的100毫摩尔碳酸氢铵溶液覆盖，在56摄氏度孵育1小时，随后在避光条件下用100毫摩尔碘乙酰胺水溶液进行烷基化处理1小时。

接着，用乙腈将胶粒收缩并再溶胀两次，每次之后用 100 毫摩尔的碳酸氢铵溶液处理，均在室温下轻轻振荡 15 分钟。第二次再溶胀后，在真空离心浓缩仪中将胶粒干燥 5 分钟。用含有 50 纳克/微升测序级修饰胰蛋白酶的 100 毫摩尔碳酸氢铵溶液浸润胶粒。

五分钟后，用 100 毫摩尔的碳酸氢铵覆盖凝胶块，并使其充分再溶胀，可补充添加 100 毫摩尔的碳酸氢铵，确保溶胀后的凝胶块完全被覆盖。然后在 37 摄氏度下孵育凝胶块过夜，次日早晨用相当于样品体积 1/10 的含 10% 甲酸的水溶液终止反应，并收集每根离心管中的上清液。在含有不同浓度氯化钠的三种不同裂解缓冲液条件下，均可检测到 Rev 核仁定位信号 3' 标签。

B23 在含有较低盐浓度的裂解缓冲液中可被检测到，在含有中等盐浓度的裂解缓冲液中 barely detectable（几乎无法检测），在含有高盐浓度的裂解缓冲液中则无法检测。B23 在含有低氯化钠浓度的裂解缓冲液中与野生型 Rev 3' flag 的结合效果最佳，而与 Rev 核仁定位信号 M1 3' flag 的结合能力下降。B23 与野生型 Rev 3' flag 的亲和力也随着盐浓度升高而降低，且在两种裂解缓冲液条件下，pcDNA 阴性对照在免疫沉淀后均未出现非特异性免疫检测信号。

通过在2x上样缓冲液中煮沸洗脱后，Rev核仁定位信号三联FLAG标签的检测信号最为明显，而B23在37℃和95℃的上样缓冲液孵育条件下均可检测到。免疫沉淀并经银染后，如图所示，野生型Rev以及Rev核仁定位信号M2、M6和M9均在18千道尔顿处可见条带。在37千道尔顿标记处也观察到对应于B23蛋白的条带。

使用考马斯亮蓝试剂染色进一步证明了在存在和不存在突变的情况下，均可检测到位于18千道尔顿的Rev核仁定位信号三磷酸标志物。在排查和筛选潜在结合因子的过程中，应使用尽可能多的阳性和阴性对照，以便与您的疾病模型相关的参考结果进行比对。所有缺失突变和单点突变均可通过与野生型Rev多聚化来检测其显性负性活性，并可用于抑制HIV-1的复制。