一种在中低通量条件下鉴定影响培养哺乳动物细胞生长与存活化合物的策略

本方案提供了一种快速且高效的策略，可同时使用两种检测方法对数百种化合物进行细胞生长效应的筛选。这两种检测方法能够告诉我们特定化合物是否具有细胞毒性、抑制细胞生长或促进细胞生长。通过联合使用这两种检测方法，我们能够提高检测准确性，并识别出具有细胞毒性的化合物。

当两种检测结果出现分歧时，该策略可能有助于我们鉴定出对细胞功能具有独特作用的化合物，并可通过其他方法进一步研究。该策略的主要优点是快速、经济且无需大量人力。一旦掌握，研究人员可在一周内轻松完成多达 200 种化合物的初步筛选，随后在另一周内对 10 至 15 种化合物进行详尽的剂量反应曲线分析。

演示该实验步骤的是我本人以及来自实验室的科研人员兼本科后研究员 Rohini Manickam。首先，在生物安全柜中，使用 NSC 培养基将细胞接种于 T75 培养瓶中，使其在开始检测时融合度至少达到 80%。然后将培养瓶置于设定为 37°C 和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中。

当细胞达到80%融合度时，从培养箱中取出培养瓶，吸除神经干细胞培养基。加入3毫升细胞解离试剂，放回培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，在培养瓶中加入7毫升神经干细胞培养基，用力吹打以确保所有细胞完全脱落。

将解离后的细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用10毫升NSC培养基重悬细胞。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并向管中加入NSC培养基，将细胞浓度调整至每毫升20万个细胞。

然后，使用八通道多通道移液器的八个通道中的六个，将细胞混合物逐列加入已包被细胞外基质的三块96孔板的60个内部孔中，每孔100 µL。向所有未接种细胞的孔中加入100 µL基础培养基或NSC培养基，以尽量减少含细胞的最外层孔的潜在蒸发。在细胞培养显微镜下，目视检查每块96孔板至少10个孔，确认细胞密度符合预期。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。细胞传代后16至24小时，从培养箱中取出细胞培养板，使用八通道多通道移液器（仅使用八个通道中的六个）逐列吸除NSC培养基。向三个重复培养板的每孔中加入95 µL新鲜NSC培养基，然后将培养板放回培养箱中继续孵育。

使用八通道多孔移液器，向一个空的U型底、V型底或圆底96孔板的内部60个孔中每孔加入49微升NSC培养基。打开已准备好的母板化合物板的密封。从母板中吸取1微升化合物，加入含有NSC培养基的内部60个孔中，然后使用台式移液器将稀释后的化合物上下吹打混匀三次。

接下来，从培养箱中取出三块含有神经干细胞（NSCs）的96孔板，向每块板的每个孔中加入5 µL稀释后的化合物，使化合物终浓度为10 µmol/L（1:1000稀释），DMSO终浓度为0.1%。将细胞与化合物共同孵育72小时，随后进行细胞毒性检测。为开展剂量反应实验，准备一块96孔板，在第二列设置6个DMSO对照重复孔，并对最多三种不同化合物进行测试，每种化合物设置三个重复孔，采用两倍梯度稀释法，共六个剂量点，起始高剂量为10 µmol/L。

在0.5或1.5毫升微量离心管中，将4微升100% DMSO或测试化合物用DMSO稀释至196微升NSC培养基中。向对照孔中加入25微升稀释后的DMSO，向相应孔中加入50微升稀释后的测试化合物。用移液器向96孔板内部剩余的空孔中各加入25微升NSC培养基。

使用多通道移液器，将25微升化合物从10微摩尔孔转移至5微摩尔孔，并至少混匀五次。更换移液器吸头，通过混匀剩余各排，为每种化合物生成六倍浓度梯度的三份重复样本，每个梯度为两倍稀释。将每种稀释液各5微升转移至另一块含有待测培养细胞的新培养板中。

将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。细胞培养72小时后，从培养箱中取出培养板，放入酶标仪中。打开成像软件，为研究设置实验方案和实验文件。

在任务管理器中进入成像仪手动模式，然后点击立即捕获。选择96孔板作为容器类型。放大倍数选择10倍，成像tdTomato时选择531和593的红色荧光蛋白。

单击一个孔。然后单击自动对焦以调整图像清晰度，再单击自动曝光以设置合适的曝光时间。如有需要，可手动调节对焦和曝光。

点击相机图标以拍摄图片。然后点击上方图像的“处理分析”以继续构建实验方案，并选择“分析”选项卡。

在图像右侧，点击“添加分析步骤”中的“细胞分析”，然后点击“开始”。图像中高亮显示的细胞用于标识每一个单独的细胞。点击“选项”以调整参数，根据荧光阈值或细胞大小更准确地选择细胞。

如果成像仪已正确计数细胞，则点击屏幕底部的“添加步骤”。点击屏幕顶部的图标，以从图像集创建实验。在打开的窗口中，点击“方案”选项卡下的“操作步骤”。

然后，在打开的新窗口中选择“读取”。点击“全板”以仅选择包含细胞的 60 个孔。点击“确定”以保存更改。

然后在“操作”窗口中单击“确定”。单击播放图标以运行微孔板。在提示框中保存文件，然后在“加载微孔板”提示框中单击“确定”。成像完成后，将成像仪软件程序中的细胞计数数据下载到电子表格中进行分析。

完成 tdTomato 成像后的两小时内，开始进行 MTT 检测。称取 25 毫克 MTT，溶于 5 毫升 NSC 培养基中，配制成浓度为 5 毫克/毫升的 MTT 储存液。涡旋振荡溶液数分钟，直至 MTT 无可见沉淀。

从培养箱中取出细胞培养板，吸除细胞培养基。用新鲜的NSC培养基将MTT按1:10稀释，每孔加入100 µL稀释后的MTT溶液。于37 °C孵育细胞2小时。

紫色沉淀物的量大致与孔中细胞数量成正比。吸去培养板中的 MTT 溶液，每孔加入 50 µL 100% DMSO。将培养板置于摇床，在室温下以 400 ×g 振荡 10 分钟。

随后，将培养板转移至酶标仪中。在预设的595纳米波长下读取每孔的吸光度，并将数据导出至电子表格进行分析，操作方式与细胞计数数据相同。对tdTomato荧光图像的观察显示，在MTT法与细胞计数法之间，有两个孔在毒性检测结果上存在不一致。

对于一个孔，细胞计数数据表明无毒性，但MTT数据却显示有毒性。另一个孔中，MTT法相对于tdTomato计数高估了细胞数量，且细胞看起来较大；而在MTT法相对于tdTomato计数低估细胞数量的孔中，细胞则显得较小。

综上所述，tdTomato 检测将 11 种化合物归类为有毒，11 种为抑制生长，1 种为促进生长，34 种对细胞生长无明显影响。MTT 检测将 13 种化合物归类为有毒，2 种为抑制生长，1 种为促进生长，41 种对细胞生长无明显影响。化合物 WP1066 的活细胞数曲线显示，在四个最低浓度下无毒性，曲线相对平坦。

在5微摩尔剂量下，曲线迅速下降，并在10微摩尔时降至接近完全毒性水平，这导致tdTomato检测和MTT检测的半数致死剂量（LD50）分别为4.4和6.0微摩尔。在剂量反应筛选中，化合物必须被正确稀释，以确保生成准确的剂量反应曲线。通过该方法鉴定出的影响细胞生长的化合物，可进一步通过功能检测进行表征，以鉴定可能调控细胞生长的新型信号通路。

已测试对神经干细胞具有毒性的化合物作为脑癌（如胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤）的潜在治疗药物。处理哺乳动物细胞、DMSO 和 MTT 时，务必佩戴手套和实验服。DMSO 和 MTT 应根据您所在机构的化学废弃物处理指南进行处置。