使用前 Vivo 共聚焦显微镜可视化淋巴节点结构和细胞定位

这种可重复且易于执行的协议使用前维生淋巴结成像策略来跟踪体内施用荧光标记抗体对局部二级淋巴器官的排出。演示此技术允许过程的特定可视化，从而促进协议的成功执行。这是一个非常简单和直接的技术，任何人都可以执行。

唯一具有挑战性的方面是鼠标处理，这需要一些培训。与传统的荧光染色方法相比，该技术具有改进速度组织作用保存和细胞生存能力的益处。培训程序将是布鲁娜·泰特松，一个从实验室的技术人员。

稀释感兴趣的抗体，结合到适当的荧光团，在100微升PBS内淋巴结成像，或50微升PBS的波普莱特淋巴结成像。对于内淋巴结成像，将100微升的抗体鸡尾酒装入一毫升胰岛素注射器，配备30分半英寸针，皮下将抗体注射到实验小鼠的大腿内侧。对于波光淋巴结成像，将50微升的抗体鸡尾酒皮下注射到实验动物的一个爪垫中。

然后把动物还到家里的箱子里。对于内皮排出淋巴结的收获，在注射后至少等待三个小时后，用胶带将鼠标固定在丙烯酸舞台上，并在腹部皮肤上涂抹矿物油。使用标准的显微外科剪刀和显微外科弯曲钳子，使腹部的中线皮肤切口从到双磷化过程，并分离腹部肌肉与皮肤。

在垂直切口线的顶部和底部进行水平皮肤切口，在注射侧创建皮肤皮瓣，并收回皮肤以可视化淋巴结。将皮肤皮瓣固定到丙烯酸板上，并使用钳子去除半透明，通常是球形内皮排干淋巴结。对于波莱特排水淋巴结收获，注射后至少12小时，将鼠标固定在丙烯酸舞台上的易发位置。

将矿物油涂抹在动物注射侧的小腿和膝盖上。接下来，在小腿从脚跟到膝盖进行中线切口，将小腿肌肉与皮肤分离。暴露流行小马。

波莱特淋巴结将显示为 fossa 内的半透明球体。然后，用显微外科弯曲钳子切除淋巴结。要准备淋巴结进行成像，请将整个器官放在一个35至10毫米的培养盘中，并用钳子去除组织周围的任何脂肪。

将器官放在盘子中间，用一块盐水浸泡的细腻任务雨刷器盖住组织。对于外体成像，将培养皿置于倒置共聚焦显微镜槽中，并使用共聚焦显微镜的传统光和 4-10 倍目标获得正确的对焦。从光功能更改为激光模式，并使用同位素染色、非染色或非荧光样品调整激光功率、偏移和增益，以消除自动荧光和任何未指定的染色。

在 4、10 和 20X 目标下获取图像，重点是淋巴结结构和细胞分布，并使用 1024 x 1024 像素定义。然后，使用适当的成像分析软件程序来分离通道，添加感兴趣的比例和颜色，并重建 3D 视图。淋巴结细胞的免疫标记与抗CD4和抗CD19抗体和共体成像分析的强大组合允许T和B细胞在内淋巴结内的定位。

在流行细胞淋巴结中，如在内结组织中，B细胞卵泡被T细胞群包围，这是淋巴结结构的标志。正如在这些图像中观察到的，噬菌体不会内化注射的抗体，表明B和T细胞染色是特异性的。此外，重新重建标签表明T和B细胞染色不重叠，进一步确认了染色的特异性。

单细胞细胞在整个内结淋巴结中观察到，包括亚帽鼻窦。大多数单核细胞表示CX3XR1，其次是CCR2和CXCR31CCR2双阳性细胞。在波莱特淋巴结中观察到细胞分布和细胞表型的相同模式。

两个淋巴结也表现出没有单核细胞受体表达的暗区，这些暗区被淋巴细胞占据。此外，单核细胞在淋巴结的内侧区域是稀缺的，仍然集中在组织的外侧区域，表明这些细胞主要占据淋巴结亚帽鼻窦。抗体混合物需要精确注射到淋巴系统的皮下组织，以适当排出淋巴结的抗体。

该方法可应用于荧光标记药物的生物分布，以及荧光标记纳米粒子的细胞靶向研究。