Name: 使用前 Vivo 共聚焦显微镜可视化淋巴节点结构和细胞定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习使用离体共聚焦显微镜技术观察小鼠淋巴结结构，通过荧光标记抗体特异性定位T细胞和B细胞的空间分布。该方法可追踪免疫细胞在淋巴器官中的精确定位，为免疫学研究提供可靠的成像分析手段。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 AI43458，授予 H.L.W.）。

该方案已获哈佛医学院和布莱根妇女医院动物保护常设委员会批准，方案编号为2016N000230。
1. 实验所用小鼠
<ol>
	<li>使用8周龄的B6背景雄性和雌性小鼠进行抗体混合物的给药。</li>
	<li>使用CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT小鼠，以确定体外完整淋巴结成像是否也可应用于无需给予抗体混合物的报告基因小鼠，并用于研究单核细胞（包括抗原呈递细胞和吞噬细胞）的存在及其在淋巴结中的分布情况。 
	注：CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT报告基因小鼠分别在CX3CR1和CCR2启动子控制下插入了绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。报告基因小鼠可选择性地联合或不联合注射抗体混合物。关于在报告基因小鼠中注射抗体混合物的详细信息，请参见参考文献4。若不进行抗体注射，则直接进入手术步骤。</li>
</ol>
2. 抗体混合物的制备与注射
注意：对步骤 1.1 中描述的小鼠执行这些步骤。
<ol>
	<li>将BV421抗CD4（GK1.5；0.2 mg/mL）按1:10稀释，BB515抗CD19（1D3；0.2 mg/mL）按1:10稀释，PE抗F4/80（T45-2342；0.2 mg/mL）按1:20稀释，溶于PBS中，配制成适当终体积，用于注射至内侧大腿（用于成像腹股沟淋巴结）或足垫（用于成像腘窝淋巴结）。 
	注意：同型对照使用BV421小鼠IgG2b, k同型对照（R35-38；0.2 mg/mL）；PE大鼠IgG2a, κ同型对照（R35-95；0.2 mg/mL）；BB515大鼠IgG2a, κ同型对照（R35-95；0.2 mg/mL）。若更换染色抗体，应使用相应的同型对照。</li>
	<li>为成像腹股沟淋巴结，将100 µL抗体混合液经皮下注射至内侧大腿（图1A）。或者，为成像腘窝淋巴结，将50 µL抗体混合液经皮下注射至足垫（图2A）。使用精细的1 mL胰岛素注射器（胰岛素U-100），配以0.30 mm × 13 mm（30号 × ½英寸）针头。 
	注意：确保腹股沟淋巴结染色的注射为皮下注射而非肌肉注射（i.m.），因为若进行肌肉注射，抗体混合液无法被正常引流。</li>
	<li>在注射抗体混合液前，不要对动物进行麻醉。</li>
	<li>注射后至少等待3小时（腹股沟引流淋巴结）或12小时（腘窝引流淋巴结），再取出器官。</li>
	<li>若使用如BV（Brilliant Violet）或BB（Brilliant Blue）等大分子聚合物荧光染料未能完全观察到淋巴结细胞标记，可改用较小的荧光素，如异硫氰酸荧光素（FITC）、PE（phycoerythrin）和别藻蓝蛋白（APC）作为替代。</li>
</ol>
3. 切除腹股沟引流淋巴结的手术步骤
<ol>
	<li>采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，并用棉签在腹部皮肤涂抹矿物油，以防止切口周围残留毛发（图1B）。无需去除毛发。</li>
	<li>使用显微外科弯剪（11.5 cm）和显微外科弯镊（12.5 cm），从耻骨至剑突沿腹中线做纵行切口（图1C）。</li>
	<li>将腹部肌肉组织与皮肤分离（图1D）。</li>
	<li>在纵行切口线的顶端和底端做横向皮肤切口，以在目标侧（根据抗体混合物注射侧）形成皮瓣，并翻开皮肤以暴露淋巴结（图1E）。</li>
	<li>用胶带将皮瓣固定在丙烯酸板上（图1F）。</li>
	<li>使用显微外科弯镊摘除腹股沟引流淋巴结（图1F）。淋巴结在皮下呈半透明、通常为双叶状的球形结构。</li>
</ol>
4. 切除引流腘窝淋巴结的手术操作
<ol>
	<li>使用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，使其呈俯卧位，并用棉签在小腿和膝部涂抹石蜡油（图 2A-D）。</li>
	<li>从小鼠足跟至膝关节沿中线在小腿处做切口（图 2E,F）。</li>
	<li>将小腿肌肉组织与皮肤分离（图 2F,G）。</li>
	<li>暴露腘窝（图 2G）。腘淋巴结呈透明球状，位于腘窝内。</li>
	<li>使用显微外科弯镊摘除腘淋巴结（图 2G）。</li>
	<li>或者，将小鼠翻转为仰卧位，于股二头肌与半腱肌之间进入腘窝，通过从小腿足跟至膝关节做中线切口并分离小腿肌肉与皮肤，以摘除腘淋巴结。 
	注意：腘窝是位于膝关节后方的浅凹区域。需小心切开，以便观察腘淋巴结。</li>
</ol>
5. 淋巴结制备
<ol>
	<li>将整个器官置于带玻璃底的培养皿（35 mm × 10 mm）中，使用显微外科弯头镊子去除器官周围附着的脂肪组织（图1G-I 和 图2H）。</li>
	<li>将器官居中放置于培养皿中央（图1J 和 图2H）。</li>
	<li>用一片精细擦拭纸覆盖器官，并用室温的0.9%生理盐水或磷酸盐缓冲液保持湿润（图1K-M 和 图2H）。 
	注意：淋巴结取出后无需清洗，且无需在生物安全柜内进行淋巴结分离操作。</li>
</ol>
6. 离体共聚焦显微镜（成像）
<ol>
	<li>将培养皿置于倒置共聚焦显微镜的插槽中（图1N 和 图2H）。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下对淋巴结（LNs）进行成像（图1O 和 图2H）。</li>
	<li>首先使用共聚焦显微镜的常规透射光，配合4x或10x物镜获取正确的焦平面，然后从透射光模式切换至激光模式。 
	注意：如果共聚焦显微镜无4x物镜，也可使用10x物镜准确完成对焦。</li>
	<li>使用同型对照染色、未染色或无荧光样本（表1）调节激光功率、偏移（offset）和增益，以消除自发荧光及抗体非特异性染色背景；本研究中所用荧光标记抗体包括BV-421标记的抗CD4、BB515标记的抗CD19以及PE标记的抗F4/80。</li>
	<li>使用微调旋钮和载物台移动装置，分别调节 Z 轴和 XY 轴位置，以定位至淋巴结中感兴趣的区域。</li>
	<li>在4x、10x和20x物镜下采集图像，重点关注淋巴结结构和细胞分布情况，图像分辨率设为1024 × 1024像素。 
	注意：每只动物每个物镜下至少在五个不同视野采集图像。</li>
	<li>使用图像分析软件对图像进行处理，分离荧光通道，添加比例尺和所需颜色，并重建三维视图。</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
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<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将成像技术与其他方法（包括分子生物学和高维免疫表型分析）相结合，显著提升了我们在原生环境中研究免疫细胞的能力。事实上，与其他可能需要组织消化和细胞分离（可能导致组织完整性丧失）的方法相比，在体或离体成像技术在以空间地理方式研究不同细胞亚群方面具有显著优势3,16。目前，能够特异性靶向细胞表达不同荧光蛋白的转基因小鼠品系正迅速增加，这并不令人意外。尤为重要的是，报告基因小鼠与抗体混合物注射相结合，成为在同一个器官内对不同细胞群体进行在体标记的有力工具4。此外，随着CRISPR/Cas9等基因编辑工具的普及，不同研究团队现已能够定制化构建小鼠模型，使得几乎任何类型的细胞都可在其真实位置被成像17。利用该方法，可深入细致地评估不同类型细胞之间的空间关系与功能联系。然而，如果并非必须进行在体细胞运动或动态事件的成像，则可采用较为简单的实验方案。在此情况下，抗体和探针在体内递送后，可直接在显微镜下观察器官（或组织样本）。
<p ...

淋巴结（LNs）是呈卵圆形的器官，广泛分布于全身，其关键功能是连接先天性免疫应答与适应性免疫应答。淋巴结可过滤淋巴液，以识别外来颗粒和癌细胞，并启动相应的免疫应答1。抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞协同作用，产生针对特异性抗原的抗体（体液免疫）以及细胞毒性淋巴细胞（细胞免疫），从而清除外来颗粒和癌细胞2。因此，深入了解淋巴系统中免疫细胞的动态变化，对于疫苗研发和癌症免疫治疗具有重要意义。
强大显微镜技术的出现——包括新型共聚焦显微镜和超分辨率显微镜——极大地推动了人们对不同免疫细胞群体在其原生环境中行为方式的理解3。如今，通过结合使用特异性靶点调控下表达荧光蛋白的转基因小鼠与多种探针，已可实现对多种细胞亚群的同时成像4,5。事实上，高维技术（包括质谱流式细胞术和多参数流式分析）在拓展我们对健康与疾病状态下不同免疫细胞区室化分布及功能认知方面发挥了关键作用6,7。然而，为准备适用于这些技术的样本，组织需经过消化处理，细胞也被从其天然微环境中分离，进而以单细胞悬液形式进行分析。为了克服这些局限性，并促进生物学研究中更贴近生理状态的结果转化，本方案旨在应用一种简便的方法，利用常规共聚焦显微镜对离体完整淋巴结进行成像，相较于传统免疫荧光染色，该方法在成像速度、组织结构保存和细胞活性方面均具有优势。通过采用此方法，我们发现，缺乏γδ T细胞（一类参与宿主抵御病原体早期防御的T淋巴细胞亚型）的小鼠，其生发中心和T细胞区结构较野生型小鼠明显受损4。这些发现促使我们进一步开展研究，证实了γδ T细胞在淋巴器官稳态维持及体液免疫应答中发挥关键作用4。此外，本方案通过皮下注射方式给予探针和抗体，使其经由组织淋巴循环进入淋巴结，模拟了生理递送途径。这一策略建立在此前多项研究基础之上，这些研究曾利用原位抗体标记技术对淋巴系统相关结构8,9、生发中心动态变化10,11,12以及血液流动可及性靶点13,14,15进行可视化观察。

<table><tbody><tr><td>BV421 抗 CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>BB515 抗 CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>BB515 大鼠 IgG2a，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>BV421 小鼠 IgG2b，K 同型对照</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cellview 培养皿</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35×10 mm，带玻璃底</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>-</td><td>胰岛素 U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimtech Science 品牌</td><td>7557</td><td>尺寸 21 × 20 cm / 每盒 100 张</td></tr><tr><td>显微外科弯头镊</td><td>WEP 外科器械</td><td>定制</td><td>12.5 cm</td></tr><tr><td>显微外科弯头剪</td><td>WEP 外科器械</td><td>定制</td><td>11.5 cm</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>-</td><td>30 号 &amp;times; &amp;frac12; 英寸</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R 共聚焦显微镜头</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>配备主要 4 种激光线（405、488、543 和 647 nm）</td></tr><tr><td>PE 抗 F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2a，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95；0.2 mg mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>配备主要 4 种激光线（405、488、543 和 647 nm）</td></tr></tbody></table>

利用离体共聚焦显微镜观察淋巴结结构及细胞定位

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

淋巴结（LNs）是分布于体内的器官，是先天性免疫应答与适应性免疫相互连接的场所。事实上，淋巴结在淋巴管通路中具有战略性的位置，可使组织抗原与淋巴结内所有定居的免疫细胞发生密切接触。因此，利用离体全淋巴结成像技术来研究细胞组成、分布、定位及相互作用，将有助于深入了解机体如何协调局部与全身免疫应答。本方案介绍了一种在体内给予荧光标记抗体后的离体成像策略，该方法可使用常规共聚焦显微镜和现成试剂，具有高度可重复性和操作简便的优点。通过皮下注射抗体，可在不影响组织结构的前提下，对引流淋巴结中的不同细胞群体进行标记，避免了传统免疫荧光显微技术可能造成的组织损伤。

本手稿展示了在向腹股沟和腘窝淋巴结注射荧光标记抗体以标记这些器官中特定细胞群后，如何在不破坏其结构的情况下切除这些淋巴结的技术（图1 和 图2）。
通过使用BV421标记的抗CD4抗体和BB515标记的抗CD19抗体对淋巴结细胞进行免疫标记，并结合共聚焦成像分析，明确了T细胞（CD4+）和B细胞（CD19+）在腹股沟和腘窝淋巴结中的定位。在这两种器官中，B细胞滤泡均被T细胞群所包围（图3、图4 和 视频1），这是淋巴结结构的典型特征1。为排除沿淋巴窦排列的吞噬细胞可能捕获注射的荧光抗体而导致细胞标志物非特异性标记的可能性，抗体混合物中包含了PE标记的抗F4/80抗体。如图5所示，吞噬细胞并未内化注射的抗体，...

本方案描述了一种在不改变器官结构的情况下对引流淋巴结中不同细胞群体进行成像的技术。

淋巴结（LNs）是分布于全身的器官，在此处，先天免疫应答能够与适应性免疫相连接。事实上，淋巴结是……

本可重复且易于操作的实验方案采用离体淋巴结成像策略，用于追踪体内给予的荧光标记抗体向局部次级淋巴器官的引流过程。演示该技术可对操作步骤进行具体可视化展示，有助于实验方案的成功实施。该技术非常简单直接，任何人员均可操作。唯一具有挑战性的环节是小鼠操作，这需要一定的训练。与传统的荧光染色方法相比，该技术具有更快的组织处理速度、更好的组织保存效果以及更高的细胞活性。该操作流程的培训将由实验室技术员 Bruna Tatematsu 负责。将目标抗体（与适当的荧光染料偶联）在100微升PBS中稀释，用于腹股沟淋巴结成像；或在50微升PBS中稀释，用于腘窝淋巴结成像。对于腹股沟淋巴结成像，将100微升抗体混合液加入配备30号半英寸针头的1毫升胰岛素注射器中，皮下注射至实验小鼠的内侧大腿。对于腘窝淋巴结成像，将50微升抗体混合液皮下注射至实验动物的一只足垫中。然后将动物放回其饲养盒中。对于腹股沟引流淋巴结的采集，在注射后至少等待三小时，用胶带将小鼠固定在丙烯酸板上，并在腹部皮肤上涂抹矿物油。使用标准显微外科剪刀和显微外科弯镊，从耻骨至剑突沿中线切开腹部皮肤，并将腹壁肌肉组织与皮肤分离。在垂直切口线的上端和下端做横向皮肤切口，以在注射侧形成皮瓣，并将皮肤牵开以暴露淋巴结。将皮瓣固定在丙烯酸板上，用镊子取出半透明、通常呈双叶状的腹股沟引流淋巴结。对于腘窝引流淋巴结的采集，在注射后至少12小时，将小鼠俯卧位固定在丙烯酸板上。在动物注射侧的小腿和膝盖部位涂抹矿物油。接着，从小腿后侧的足跟至膝盖做一正中切口，将小腿肌肉组织与皮肤分离。暴露腘窝区域。腘窝淋巴结将呈现为窝内一个透明的球形结构。然后，使用显微外科弯头镊子将淋巴结取出。为准备成像，将整个器官置于35 mm × 10 mm、带玻璃底的培养皿中，并用镊子清除组织周围的所有脂肪。将器官置于培养皿中央，并用浸有生理盐水的柔软擦拭纸覆盖组织。对于离体成像，将培养皿放置于倒置共聚焦显微镜的载物台插槽中，使用共聚焦显微镜的常规透射光及 4-10X 物镜获取清晰焦平面。随后从透射光模式切换至激光模式，利用同位素标记、未标记或非荧光样品调节激光功率、偏移量（offset）和增益，以消除自发荧光及非特异性染色信号。使用4倍、10倍和20倍物镜，以1024 × 1024像素分辨率获取淋巴结结构及细胞分布的图像。然后，使用适当的图像分析软件分离通道，添加比例尺和感兴趣的色彩，并重建三维视图。利用抗CD4和抗CD19抗体对淋巴结细胞进行免疫标记，并结合共聚焦成像分析，可有效定位腹股沟淋巴结中的T细胞和B细胞。在腘窝淋巴结中，与腹股沟组织类似，B细胞滤泡周围被T细胞群所包绕，这是淋巴结结构的典型特征。如这些图像所示，吞噬细胞并未内化注射的抗体，表明B细胞和T细胞的染色具有特异性。此外，对标记信号的重新构建显示T细胞与B细胞的染色信号不重叠，进一步证实了染色的特异性。在整个腹股沟淋巴结中，包括被膜下窦，均可见单核细胞。其中大多数单核细胞表达CX3CR1，其次是CCR2和CXCR31CCR2双阳性细胞。在腘窝淋巴结中也观察到相同的细胞分布模式和细胞表型。两个淋巴结均显示出无单核细胞受体表达的深染区域，这些区域被淋巴细胞占据。此外，单核细胞在淋巴结内部区域中较为稀少，主要集中在组织的外周区域，表明这些细胞主要分布于淋巴结的被膜下窦。为了使淋巴系统将抗体正确引流至淋巴结，必须将抗体混合物精确注射至皮下组织。该方法可用于荧光标记药物的生物分布研究，以及荧光标记纳米颗粒的细胞靶向研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用前 Vivo 共聚焦显微镜可视化淋巴节点结构和细胞定位

双光子成像已揭示了在基础状态及免疫应答过程中淋巴结内淋巴细胞的运动性及细胞间相互作用1。本文中，我们展示了T细胞的过继转移、淋巴结的分离，以及离体淋巴结中CD4+...

小鼠外周淋巴结的解剖与双光子成像

本方案描述了一种对导入淋巴结切片中的荧光标记T细胞进行成像的方法。该技术可利用传统的宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜，对T细胞的迁移进行实时分析。...

ex vivo 条件下利用宽场与共聚焦显微镜对小鼠淋巴结切片中的T细胞进行成像

双光子显微镜技术的最新进展已实现实时观察 在...

活体小鼠腘窝淋巴结成像

近年来发展的近红外荧光（NIRF）成像技术可能有助于阐明淋巴系统在癌症转移、免疫反应、伤口修复及其他淋巴系统相关疾病中所起的作用。...

小鼠淋巴管系统的非侵入性光学成像

本视频演示了一种从小鼠后肢分离并收获腘窝引流淋巴结的解剖技术。淋巴结在连接先天免疫与适应性免疫中发挥关键作用，获取结构完整、组织结构保存良好且细胞活性完好的淋巴结，有助于研究局部和全身的免疫应答。...

一种用于离体成像的收获小鼠腘窝引流淋巴结的解剖方法

通过空间调制多焦点双光子显微镜的激发模式，可在成年小鼠淋巴结中实现高达120 µm深度的高分辨率活体成像，并增强对比度。在100 µm深度处，测得的分辨率为487 nm（横向）和551...

高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。...

长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法

落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

本方案描述了一种对人肺肿瘤组织切片中经荧光标记抗体标记的驻留性肿瘤浸润CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可利用共聚焦显微镜对CD8...

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

本文介绍了一种将组织透明化技术与光片荧光显微镜（LSFM）相结合的实验方案，用于获取脑脊液及脊髓硬膜外液引流相关的淋巴管和淋巴结（LNs）的三维、细胞分辨率图像。...

使用 iDISCO+ 和光片荧光显微镜对椎体淋巴管系统及其引流进行三维成像

本文介绍了一种评估小鼠脑膜淋巴管（MLVs）的实验方案，脑膜淋巴管在多种神经系统疾病中发挥重要作用。该方案旨在提供一种整合性方法，既能评估示踪剂引流功能，又能对背侧脑膜淋巴管网进行详细的形态学表征。...

综合评估脑膜淋巴管的整合方案：小脑延髓池注射、淋巴结成像、脑膜解剖与全层组织染色

学习使用离体共聚焦显微镜技术观察小鼠淋巴结结构，通过荧光标记抗体特异性定位T细胞和B细胞的空间分布。该方法可追踪免疫细胞在淋巴器官中的精确定位，为免疫学研究提供可靠的成像分析手段。

利用离体共聚焦显微镜观察淋巴结结构及细胞定位

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