Name: 通过建立单罐双酶级联,从弗拉瓦内生物合成一种黄酮 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解单罐双酶级联法从flavanones生物合成flavonols的高效方法。该技术节省劳动力和时间，成本低廉且易于控制，在医药和食品工业中具有巨大的工业化应用潜力。

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本工作得到了扬州大学特聘教授启动基金、江苏省特聘教授启动基金、江苏省“六大人才高峰”项目（项目编号：2014-SWYY-016）以及江苏省高校优势学科建设工程（兽医学）项目的资助。感谢扬州大学测试中心在黄酮类化合物的高效液相色谱和质谱分析方面提供的支持。

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<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

许多研究致力于黄酮醇的制备，因其在医疗保健和食品工业中具有潜在应用价值。然而，传统的植物提取方法使用有机溶剂，以及化学合成方法，均存在固有缺陷，限制了黄酮醇的生产应用。本文报道了一种通过构建体外双酶级联反应，在单一体系中由黄烷酮一步生成黄酮醇的详细方法。该方案的关键步骤包括：1）获得高活性的纯化重组酶；2）建立单一体系中的双酶反应级联。通常情况下，植物来源的基因在细菌中表达时倾向于形成包涵体，导致酶活性丧失。众所周知，某些肽段（如TrxA和SUMO）有助于提高在细菌中表达的重组蛋白的表达量和可溶性16。因此，将目标基因克隆至含有此类表达标签的质粒（如pET-32a(+)和pET SUMO）中将有助于蛋白表达（步骤3.2.3）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度是影响原核表达蛋白可溶性的另外两个关键参数16。为进一步减少包涵体的形成，需对IPTG浓度和诱导温度进行优化。最佳IPTG浓度和诱导温度主要取决于质粒类型和菌株种类。在本方案中，IPTG浓度和诱导温度分别优化为0.2 mM和20–22 °C（步骤4.2.3）。此外，温...

黄酮醇是植物黄酮类化合物的一个主要亚类，参与植物的发育和着色过程1,2,3。更重要的是，这类化合物具有多种有益健康的活性，例如抗癌4,5、抗氧化6、抗炎7、抗肥胖8、抗高血压9以及改善记忆的能力10，因而引发了大量针对这些植物来源的次生代谢产物的研究。传统上，这些化合物主要通过有机溶剂从植物中提取获得。然而，由于其在植物中的含量极低11,12,13，大多数黄酮醇的生产成本仍然较高，严重限制了其在医疗保健和食品工业中的应用。
在过去的几十年中，科学家已开发出多种获取黄酮类化合物的方法14,15。然而，这些复杂分子的化学合成存在多种固有缺陷16。该方法不仅需要使用有毒试剂和极端反应条件，还需要经过多个步骤才能获得目标黄酮类化合物14,17。此外，该策略面临的另一个重要挑战是活性黄酮类分子的手性合成。因此，通过化学合成法大规模生产黄酮类化合物并非理想的策略16,17。
近年来，科学家开发出一种颇具前景的替代策略，通过构建含有黄酮类生物合成途径的微生物来生产这些复杂的天然化合物18,19,20,21,22，该途径在植物中已被成功解析23。例如，Duan 等人将一条生物合成途径导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，实现了山奈酚（KMF）的生产24。Malla 等人则通过将黄烷酮3-羟化酶（f3h）、黄酮醇合酶（fls1）以及UDP-葡萄糖：黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶UGT78K1基因导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，成功合成了糖基化黄酮醇——毛蕊异黄酮苷（astragalin）17。尽管已有不少成功范例，但由于细胞平台的复杂性、人工合成的遗传元件与宿主之间的不兼容性、目标产物对宿主细胞的抑制作用，以及工程化细胞系统本身的不稳定性，许多基因工程微生物仍无法有效生成目标产物16。
黄酮类化合物生产的另一种有前景的替代策略是在体外构建多酶级联反应。Cheng 等人报道，通过在一锅体系中组装完整的酶促途径，可成功合成 enterocin 聚酮化合物25。这种无细胞合成策略规避了微生物生产工厂的限制，因此适用于大量生产某些黄酮类化合物16。
最近，我们已成功开发出一种双酶合成系统，可将柚皮素（NRN）在一锅反应中转化为KMF16。本文详细描述了该系统及产物分析所涉及的方法。此外，我们还展示了两个应用该系统分别从柚皮素（NRN）和埃里多替醇（ERD）生成KMF和槲皮素（QRC）的实例。同时，我们讨论了该方法中的关键步骤以及黄酮类化合物生物合成领域的未来研究方向。

<table><tbody><tr><td>2&amp;times; Pfu MasterMix</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW0717A</td><td>高保真基因的PCR扩增</td></tr><tr><td>Agilent 1200 系列 RRLC 系统配备 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>用于黄酮类化合物HPLC/MS分析的设备</td></tr><tr><td>Agilent MassHunter 工作站（版本 B.03.01）</td><td>安捷伦科技有限公司</td><td>N/A</td><td>用于从配备安捷伦6460三重四极杆LC/MS系统的安捷伦1200系列RRLC系统采集数据的软件</td></tr><tr><td>二氢槲皮素</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>91216</td><td>从柚皮素生产山奈酚的中间产物</td></tr><tr><td>二氢槲皮素</td><td>中国四川中药标准物质中心</td><td>PCS0371</td><td>从柚皮芹菜素合成槲皮素的中间产物</td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW2301</td><td>PCR扩增或凝胶纯化DNA的纯化</td></tr><tr><td>柚皮素</td><td>上海源野生物科技有限公司</td><td>B21160</td><td>生产槲皮素的底物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW0809</td><td>用于表达目的基因的细菌菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW0808</td><td>用于质粒扩增的细菌菌株</td></tr><tr><td>FreeZone 1 升台式冷冻干燥系统</td><td>Labconco Corporation</td><td>7740020</td><td>用于冻干溶解于有机溶剂中黄酮类化合物的设备</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW2302</td><td>从琼脂糖凝胶中纯化DNA条带</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>上海塔能科学 &amp;amp; Technology Co. Ltd.</td><td>中国台湾&lt;黄酮醇是一类具有多种生物和药理活性的黄酮类化合物主要亚类。本文提供一种体外酶法合成黄酮醇的方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因 Atf3h 和 Atfls1 克隆并在大肠杆菌中过表达。通过亲和层析纯化重组酶后，在特定合成缓冲液中构建双酶级联反应体系。以两种黄酮醇的合成为例，通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行分析鉴定。该方法在黄酮醇衍生物制备方面较其他方法具有显著优势，省时省力且成本效益高。反应过程易于精确控制，便于放大进行大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮合成黄酮醇。&gt; 2500</td><td>用于在琼脂糖凝胶上可视化DNA条带或在聚酰胺TLC板上可视化黄酮类斑点的设备</td></tr><tr><td>GenElute 质粒小提试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>PLN350-1KT</td><td>质粒的小量制备</td></tr><tr><td>山奈酚</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>60010</td><td>最终反应产物与标准物质</td></tr><tr><td>MassHunter 定性分析（版本 B.01.04）</td><td>安捷伦科技有限公司</td><td>N/A</td><td>一种用于分析HPLC/LC/MS数据的软件</td></tr><tr><td>NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>用于测定 DNA/RNA 浓度的设备</td></tr><tr><td>柚皮素</td><td>Sigma-Aldrich 公司有限责任公司</td><td>N5893</td><td>产生山奈酚的底物</td></tr><tr><td>Ni-IDA 琼脂糖树脂</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW0010</td><td>His标签融合蛋白的纯化</td></tr><tr><td>pET-32a(+)</td><td>Novagen</td><td>69015-3</td><td>用于克隆和表达目的基因的质粒</td></tr><tr><td>质粒测序</td><td>GENEWIZ 苏州</td><td>N/A</td><td>重组质粒测序</td></tr><tr><td>引物合成</td><td>GENEWIZ 苏州</td><td>N/A</td><td>PCR引物的合成</td></tr><tr><td>槲皮素</td><td>上海阿拉丁生化科技股份有限公司</td><td>Q111273</td><td>终反应产物与标准物质</td></tr><tr><td>SuperRT cDNA合成试剂盒</td><td>北京科为博生物科技有限公司</td><td>CW0741</td><td>从总RNA合成第一链cDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EL0016</td><td>将插入片段连接至线性化载体DNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15596018</td><td>总RNA的提取</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12605099</td><td>一款用于PCR引物设计和DNA序列分析的软件</td></tr><tr><td>Xcalibur v2.0.7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>一种用于分析HPLC数据的软件</td></tr></tbody></table>

通过构建一锅法双酶级联反应实现黄烷酮向黄酮醇的生物合成

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

黄酮醇是黄酮类化合物中的一个重要亚类，具有多种生物学和药理学活性。本文提供一种黄酮醇的体外酶法合成方法。该方法将黄酮醇生物合成途径中的两个关键基因Atf3h和Atfls1克隆并在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达。通过亲和层析纯化获得重组酶，随后在特定的合成缓冲体系中构建双酶级联反应。以该体系合成了两种黄酮醇作为示例，并通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC/LC/MS）进行鉴定。该方法在黄酮醇的制备方面相较于其他方法具有明显优势，具有省时、省力且成本效益高的特点。反应过程易于精确控制，因而可放大用于大规模生产。由于反应体系组分简单，目标产物易于纯化。然而，该体系通常仅限于由黄烷酮前体合成黄酮醇。

F3H 和 FLS1 是植物中将黄烷酮转化为黄酮醇的两个关键酶，如图1所示。为了建立一个体外生物合成系统以从黄烷酮生产黄酮醇，从4周龄的A. thaliana幼苗中克隆了Atf3h（GenBank登录号NM_114983.3）和Atfls1（GenBank登录号NM_120951.3）基因，并将其插入原核表达载体pET-32a(+)中。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达融合蛋白，随后使用Ni-IDA琼脂糖树脂进行纯化。如图2所示，纯化的融合蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上的纯度超过95%，足以用于建立体外双酶级联反应系统。
<img alt="黄酮类生物合成途径图解，显示酶F3H和FLS1催化的化学结构变化。" class...

黄酮醇的衍生化对其在医疗保健和食品工业中的应用至关重要。本文提供了一种由黄烷酮生物合成黄酮醇的详细实验方案，并讨论了其中的关键步骤及其相较于其他方法的优势。

黄酮醇是一类具有多种生物和药理活性的黄酮类化合物主要亚类。本文提供一种体外……

利用该方案，我们能够在一个反应体系中轻松地从黄烷酮大量制备多种黄酮醇。该技术省时省力、成本效益高且易于控制，具有巨大的产业化潜力。是的，该方法可为其他次生代谢产物的经济化生产提供思路，但在应用于其他体系时需要进行一些改进。他通常会得到很少甚至没有产物。我的建议是在冰上操作重组酶，并在酶的储存液中加入10%甘油。这是因为只有通过直观演示，新手才能理解影响实验成功执行的关键细节和要点。首先配制缓冲液。将适量的TRIS碱、抗坏血酸钠和α-酮戊二酸溶解于去离子水中，配制成2倍浓度的合成缓冲液，并用移液器向溶液中加入适量甘油。使用移液器滴加盐酸调节pH至7.2，并通过添加去离子水定容至所需体积。将两倍合成缓冲液在4 °C保存以备后续使用。然后通过将七水合硫酸亚铁溶解于去离子水中，配制100倍贮存液。将黄酮类化合物溶解于甲醇中，配制成25 mmol/L的贮存液，并于-20 °C保存。最关键的步骤是建立一个合成系统。为了建立从黄烷酮合成黄烷醇的系统，首先根据本表所列试剂，在一个2毫升离心管中配制反应体系。将开口的离心管置于40摄氏度、600 rpm的振荡金属浴中反应40分钟。随后，加入 10 微升乙酸和 100 微升乙酸乙酯以终止反应。两小时后，用移液器将上层有机相转移至 1.5 毫升离心管中，并将离心管置于通风橱内，于室温下空气干燥。进行薄层色谱（TLC）分析时，首先从通风橱中取出离心管，将黄酮类粉末重新溶解于 160 微升甲醇中。通过将25毫摩尔的黄酮类化合物储备液用甲醇稀释，配制一系列浓度的黄酮类标准品。取1微升重新溶解的反应样品和1微升黄酮类标准品，点样于聚酰胺板上。在同一块板上，对其他浓度的黄酮类标准品进行相同操作。然后在通风橱中，将加样后的薄层板放入装有展开剂系统的层析缸中。将薄层板固定在层析缸底部，在展开剂系统中展开20分钟。取出后于室温下空气中自然干燥。使用喷雾瓶将1%的乙醇氯化铝溶液喷洒在薄层板上，随后再次于室温下晾干30分钟。在254纳米紫外光下观察薄层板上的斑点并拍照。然后在计算机上打开ImageJ软件，点击“文件”菜单中的“打开”，以导入待分析的图像。单击 ImageJ 用户界面中最左侧的矩形选择工具。使用鼠标在图像中框选出感兴趣区域（ROI），然后按数字键“1”标记第一个 ROI。用鼠标将矩形选择框向右移动至下一个 ROI 位置，然后按数字键“2”标记第二个 ROI。按两次“二”以标记所有其他感兴趣区域。按“三”可在弹出窗口中为所有感兴趣区域生成轮廓图。然后，使用直线选择工具绘制基线，以定义每个目标峰的封闭区域。通过单击 ImageJ 用户界面中相应的图标激活笔工具。单击峰内区域，将在弹出窗口中显示所有峰的结果。接着，在 Excel 中，将弹出窗口中的灰度值与相应的黄酮类化合物浓度作图，绘制基于薄层色谱的纯品黄酮类化合物标准曲线。然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮类化合物的产率。使用注射器依次将每个样品通过0.45微米和0.22微米滤膜过滤。通过吸液喷嘴将样品注入高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）系统，并使用C18色谱柱在30摄氏度下进行样品分离。以每分钟1毫升的流速，使用水中10%至85%体积比的乙腈梯度洗脱色谱柱，并监测洗脱液在200至800纳米波长范围内的吸光度。在负离子模式下进行LC-MS分析，干燥氮气流速为每分钟10升，温度为300摄氏度，鞘气流速为每分钟7升，温度为250摄氏度，并使用内置软件采集数据。为提取单波长色谱图，打开定性分析程序，点击文件，打开数据文件。在打开数据文件窗口中选择要分析的文件，然后单击“打开”以打开该文件。在色谱图结果窗口中右键单击鼠标，然后在弹出菜单中选择提取色谱图。在类型列表中，单击其他色谱图。在检测器组合框中，选择 DAD1，然后单击“确定”以在色谱结果窗口中显示 HPLC 结果。单击位于色谱结果窗口顶部的手动积分图标。使用鼠标为需要进行手动积分分析的峰绘制基线。单击“视图”中的“积分峰列表”以显示结果。将峰面积结果复制到 Excel 中，根据标准黄酮类化合物的相应浓度绘制基于 HPLC 的标准曲线，然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮类化合物的产量。随后重复相同步骤，提取单波长色谱图，以分析黄酮类化合物的精确质荷比质谱数据。单击色谱图结果工具栏上的范围选择图标。选择目标峰。在选定范围内单击鼠标右键，然后在弹出菜单中单击“提取质谱图”，以在质谱图结果窗口中显示结果。为了确定该体外系统是否可用于将黄烷酮转化为黄酮醇，向系统中添加了NRN。在聚酰胺薄层色谱板上出现了两个新斑点。其中一个斑点的迁移距离与DHK相似，另一个则与KMF相似。通过HPLC和LC-MS进一步分析表明，该新化合物的保留时间分别为12分钟和20分钟，在质荷比（M/Z）为287和285处出现准分子离子峰，与二氢 kaempferol（DHK）和 kaempferol-3-methyl ether（KMF）的峰一致。为了确定该系统是否可用于将其他黄烷酮转化为相应的黄酮醇，向体系中加入了ERD。在聚酰胺TLC板上出现了两个新斑点，其迁移距离分别与二氢槲皮素（DHQ）和槲皮素（QRC）相似。高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析表明，这两种新化合物的保留时间分别为10分钟和16分钟，准分子离子峰m/z为303和301，与二氢槲皮素（DHQ）和槲皮素（QRC）的相应数据完全一致。在配制合成体系时，应最后加入酶，倒数第二个加入硫酸亚铁。是的，该方法为其他次级代谢产物的经济化生产提供了指导。

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科研

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生物化学

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