通过构建一锅法双酶级联反应实现黄烷酮向黄酮醇的生物合成

利用该方案，我们能够在一个反应体系中轻松地从黄烷酮大量制备多种黄酮醇。该技术省时省力、成本效益高且易于控制，具有巨大的产业化潜力。是的，该方法可为其他次生代谢产物的经济化生产提供思路，但在应用于其他体系时需要进行一些改进。

他通常会得到很少甚至没有产物。我的建议是在冰上操作重组酶，并在酶的储存液中加入10%甘油。这是因为只有通过直观演示，新手才能理解影响实验成功执行的关键细节和要点。

首先配制缓冲液。将适量的TRIS碱、抗坏血酸钠和α-酮戊二酸溶解于去离子水中，配制成2倍浓度的合成缓冲液，并用移液器向溶液中加入适量甘油。使用移液器滴加盐酸调节pH至7.2，并通过添加去离子水定容至所需体积。

将两倍合成缓冲液在4 °C保存以备后续使用。然后通过将七水合硫酸亚铁溶解于去离子水中，配制100倍贮存液。将黄酮类化合物溶解于甲醇中，配制成25 mmol/L的贮存液，并于-20 °C保存。

最关键的步骤是建立一个合成系统。为了建立从黄烷酮合成黄烷醇的系统，首先根据本表所列试剂，在一个2毫升离心管中配制反应体系。将开口的离心管置于40摄氏度、600 rpm的振荡金属浴中反应40分钟。

随后，加入 10 微升乙酸和 100 微升乙酸乙酯以终止反应。两小时后，用移液器将上层有机相转移至 1.5 毫升离心管中，并将离心管置于通风橱内，于室温下空气干燥。进行薄层色谱（TLC）分析时，首先从通风橱中取出离心管，将黄酮类粉末重新溶解于 160 微升甲醇中。

通过将25毫摩尔的黄酮类化合物储备液用甲醇稀释，配制一系列浓度的黄酮类标准品。取1微升重新溶解的反应样品和1微升黄酮类标准品，点样于聚酰胺板上。在同一块板上，对其他浓度的黄酮类标准品进行相同操作。

然后在通风橱中，将加样后的薄层板放入装有展开剂系统的层析缸中。将薄层板固定在层析缸底部，在展开剂系统中展开20分钟。取出后于室温下空气中自然干燥。

使用喷雾瓶将1%的乙醇氯化铝溶液喷洒在薄层板上，随后再次于室温下晾干30分钟。在254纳米紫外光下观察薄层板上的斑点并拍照。然后在计算机上打开ImageJ软件，点击“文件”菜单中的“打开”，以导入待分析的图像。

单击 ImageJ 用户界面中最左侧的矩形选择工具。使用鼠标在图像中框选出感兴趣区域（ROI），然后按数字键“1”标记第一个 ROI。用鼠标将矩形选择框向右移动至下一个 ROI 位置，然后按数字键“2”标记第二个 ROI。

按两次“二”以标记所有其他感兴趣区域。按“三”可在弹出窗口中为所有感兴趣区域生成轮廓图。然后，使用直线选择工具绘制基线，以定义每个目标峰的封闭区域。

通过单击 ImageJ 用户界面中相应的图标激活笔工具。单击峰内区域，将在弹出窗口中显示所有峰的结果。接着，在 Excel 中，将弹出窗口中的灰度值与相应的黄酮类化合物浓度作图，绘制基于薄层色谱的纯品黄酮类化合物标准曲线。

然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮类化合物的产率。使用注射器依次将每个样品通过0.45微米和0.22微米滤膜过滤。通过吸液喷嘴将样品注入高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）系统，并使用C18色谱柱在30摄氏度下进行样品分离。

以每分钟1毫升的流速，使用水中10%至85%体积比的乙腈梯度洗脱色谱柱，并监测洗脱液在200至800纳米波长范围内的吸光度。在负离子模式下进行LC-MS分析，干燥氮气流速为每分钟10升，温度为300摄氏度，鞘气流速为每分钟7升，温度为250摄氏度，并使用内置软件采集数据。为提取单波长色谱图，打开定性分析程序，点击文件，打开数据文件。

在打开数据文件窗口中选择要分析的文件，然后单击“打开”以打开该文件。在色谱图结果窗口中右键单击鼠标，然后在弹出菜单中选择提取色谱图。在类型列表中，单击其他色谱图。

在检测器组合框中，选择 DAD1，然后单击“确定”以在色谱结果窗口中显示 HPLC 结果。单击位于色谱结果窗口顶部的手动积分图标。使用鼠标为需要进行手动积分分析的峰绘制基线。

单击“视图”中的“积分峰列表”以显示结果。将峰面积结果复制到 Excel 中，根据标准黄酮类化合物的相应浓度绘制基于 HPLC 的标准曲线，然后根据所得公式计算本方案中目标黄酮类化合物的产量。随后重复相同步骤，提取单波长色谱图，以分析黄酮类化合物的精确质荷比质谱数据。

单击色谱图结果工具栏上的范围选择图标。选择目标峰。在选定范围内单击鼠标右键，然后在弹出菜单中单击“提取质谱图”，以在质谱图结果窗口中显示结果。

为了确定该体外系统是否可用于将黄烷酮转化为黄酮醇，向系统中添加了NRN。在聚酰胺薄层色谱板上出现了两个新斑点。其中一个斑点的迁移距离与DHK相似，另一个则与KMF相似。

通过HPLC和LC-MS进一步分析表明，该新化合物的保留时间分别为12分钟和20分钟，在质荷比（M/Z）为287和285处出现准分子离子峰，与二氢 kaempferol（DHK）和 kaempferol-3-methyl ether（KMF）的峰一致。为了确定该系统是否可用于将其他黄烷酮转化为相应的黄酮醇，向体系中加入了ERD。在聚酰胺TLC板上出现了两个新斑点，其迁移距离分别与二氢槲皮素（DHQ）和槲皮素（QRC）相似。

高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析表明，这两种新化合物的保留时间分别为10分钟和16分钟，准分子离子峰m/z为303和301，与二氢槲皮素（DHQ）和槲皮素（QRC）的相应数据完全一致。在配制合成体系时，应最后加入酶，倒数第二个加入硫酸亚铁。是的，该方法为其他次级代谢产物的经济化生产提供了指导。