Name: 矫形子宫内膜癌模型，具有从 Vivo 传播和培养的 VX2 细胞中制成的再生淋巴病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习在兔子体内建立VX2子宫内膜癌原位模型并培养细胞的方法。该技术可靠且可重复，能够模拟人类癌症的腹膜后淋巴结转移模式，为影像引导手术技术的研究提供重要工具。

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本研究由特里·福克斯研究所（PPG#1075）、加拿大卫生研究院（基础项目资助 #154326）、加拿大癌症协会研究所（704718）、加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会以及玛格丽特公主癌症基金会资助。
我要感谢Marguerite Akens博士提供了建立初始VX2模型所需的原始VX2细胞以及冻存的VX2肿瘤组织块。感谢Marco DiGrappa协助开展初始的VX2细胞培养实验，感谢Lili Ding在VX2细胞培养方面的帮助。

深部腹壁缝合：确定腹膜切口的顶端，用组织镊夹住腹膜、腹直肌和筋膜。所有动物实验均在大学健康网络（University Health Network）动物资源中心（ARC）批准的设施中进行，并遵循经批准的动物使用与护理方案（AUP #3994/#4299）。VX2细胞系由大学健康网络Dr. Aken实验室提供。
1. 体外VX2细胞系的建立
<ol>
	<li>从兔股四头肌中收获VX2肿瘤，并移植至小鼠 flank 部位生长。
	<ol>
		<li>解冻冷冻的 VX2 肿瘤组织块（1 cm × 1 cm），在培养皿中用手术刀片切碎，分次加入少量 Hanks 平衡盐溶液（HBSS），通过 70 µm 滤网过滤，确保所有细胞均被滤过，最终体积为 1 mL。</li>
		<li>计数细胞，并用0.9%磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1 × 107/mL，并置于无菌管中冰上保存。 
		注意：肿瘤组织块由实验室合作者提供，来源于此前在兔股四头肌中传代培养的VX2肿瘤。</li>
		<li>使用2-5%吸入式异氟烷对一只雌性新西兰白兔（体重2.5–3.5 kg）进行麻醉，去除注射部位的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁注射部位。注射500 µL制备好的VX2细胞悬液（5 × 10⁶细胞/500 µL）6 细胞/mL）注入兔的股四头肌中。从第10天开始，临床上监测兔的肿瘤生长情况。</li>
		<li>在肿瘤直径达到1-1.5 cm（使用游标卡尺外部测量）后，对兔子实施安乐死&#160;一种经兽医批准的方法。通过检查心率和呼吸率等生命体征确认动物安乐死。用聚维酮碘溶液清洁区域后，使用无菌器械切除肿瘤。</li>
		<li>在生物安全柜中，使用无菌器械将肿瘤组织置于10 cm细胞培养皿上，用手术刀片切碎成约0.2 cm的小块。按照步骤1.1.1所述方法，加入1 mL HBSS，将肿瘤碎片通过70 µm细胞筛网过滤。计数细胞，并用0.9%生理盐水稀释，调整至浓度为7.5 × 10⁶5 200 µL 中的细胞</li>
		<li>使用1 L/min流速的4%异氟烷对雄性NOD scid gamma小鼠（体重25 g）进行麻醉，并以2%异氟烷维持麻醉状态。待小鼠麻醉成功后，用27号针头将1.1.5步骤所得溶液200 µL注射至小鼠侧腹部皮下组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VX2 细胞的体外收获与传代
	<ol>
		<li>每周两次通过临床监测异种移植瘤的生长情况，使用游标卡尺测量直至肿瘤直径达到1 cm。</li>
		<li>通过将小鼠置于 CO₂ 中使其安乐死2 在4%异氟烷气体麻醉后实施颈椎脱位或安乐死。在生物安全柜内的无菌条件下切除肿瘤。</li>
		<li>用手术刀将肿瘤在含有3 mL DMEM/Ham’s F12 + 10% 胎牛血清（FBS）培养基的6 cm组织培养皿中切碎成1–2 mm大小的组织块。</li>
		<li>将肿瘤组织碎片置于37 °C、5% CO₂的培养箱中静置培养2 培养两天，直至细胞开始从肿瘤组织块中长出。随后，每天在光学显微镜下观察培养皿中的细胞融合度。当细胞融合度达到70%时，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶至培养瓶中，于37 °C培养箱中孵育5分钟，进行胰酶消化。</li>
		<li>用 6 mL 含 10% FBS 的 DMEM/Ham’s F12 培养基中和胰蛋白酶，收集细胞，在 4 °C、300 x g 条件下离心 5 分钟 g. 吸除上清液，将沉淀重悬于3.5 mL新鲜DMEM/Ham’s F12 + 10% FBS培养基中。用1.6 × 10⁵个细胞接种至新的I型胶原蛋白包被的6 cm培养皿中6 每孔细胞数以达到约50%的细胞接种密度。 
		&#8203;注：50% 细胞密度是指细胞贴壁后占据培养板表面积的 50%。</li>
		<li>早期传代： 重复上述过程（胰酶消化、传代接种），直至细胞传代5次后，使用定量PCR检测法通过PCR评估细胞系纯度，以区分兔基因组DNA与小鼠基因组DNA（见步骤1.3.1–1.3.4）。 
		注意：经过8代培养后，细胞可在未经胶原蛋白包被的常规贴壁培养板上扩增。</li>
		<li>传代、胰酶消化，并将细胞以2 × 10⁶个/mL的浓度分装冻存于DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO中6 每管。将细胞储存于液氮中，待实验需要时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>存活细胞VX2来源的确认：
	<ol>
		<li>使用纯化的鼠和兔基因组DNA创建标准曲线（步骤1.3.2和步骤1.3.3）。采用针对LINE-1逆转录转座子元件第二个开放阅读框中物种特异性序列的引物。 
		注意：CRPV E6 的引物序列为：5’- GATCCTGGACCCAACCAGTG 和 5’-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT。实验中使用了 LINE-1 逆转座子元件。兔 LINE-1 的引物序列为：5’-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC 和 5’-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT；小鼠 LINE-1 的引物序列为：5’-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG 和 5’-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG。</li>
		<li>为构建CRPV E6标准曲线，使用商品化试剂盒按照生产商说明书纯化VX2肿瘤细胞裂解液（步骤1.1.1）。使用商品化检测试剂定量该DNA。在低EDTA-TE缓冲液中进行6次连续稀释，浓度从225 pg/µL稀释至0.925 pg/µL。为构建小鼠基因组DNA标准曲线，将100 µg商品化小鼠基因组DNA用低EDTA-TE缓冲液稀释，进行5次梯度稀释，浓度从125 pg/µL降至0.0125 pg/µL。</li>
		<li>将步骤1.3.2中各样品稀释液各取4 µL加入孔中，并在PCR扩增仪中运行样品。使用每次运行所得的Cq值及每孔中的DNA量，结合扩增仪软件的自动阈值设置，绘制标准曲线。</li>
		<li>使用标准的qPCR程序，在热循环仪上进行40个循环的两步法PCR（98 °C 和 60 °C）。确定阈值，并设定ΔCt值 &#62;35，以确保兔VX2细胞系中鼠源污染最少。每个反应体系总体积为10 µL，包含5 µL 2x Mastermix、1 µL正向与反向引物（反应中引物终浓度为250 nM）以及4 µL DNA样本。 
		注意：请参见参考文献54,55 有关进行 PCR 的详细信息。设定阈值，并将 ΔCt 值设定为 &#62;35，以确保兔VX2细胞系中尽量减少小鼠污染。qPCR可靠检测VX2 DNA的推荐含量为1-10 pg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. VX2 细胞培养及细胞悬液制备
<ol>
	<li>将含有 VX2 细胞的冻存管（步骤 1.2.7 中冻存）在 37 °C 水浴中解冻 1 分钟，转移至锥形离心管中，并加入 10 mL 培养基（1:1 DMEM/F-12 + 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）。在 107 × g 条件下离心 8 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 9 mL 培养基中。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至大培养瓶中。在 37 °C 条件下静置培养。每日使用光学显微镜检查细胞融合度，并每三天更换一次培养基。</li>
	<li>制备用于注射的培养 VX2 细胞悬液
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到 80% 时，向培养瓶中加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶进行消化。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中 5 分钟。将消化液转移至锥形离心管中，在 107 × g 条件下离心 8 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 9 mL 磷酸盐缓冲液将细胞沉淀洗涤 3 次，每次均按上述方法离心并弃去上清液。计数细胞后，用 0.9% 磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 4 × 107 个细胞/mL，并置于冰上保存于无菌锥形离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于注射的体内传代 VX2 细胞悬液
	<ol>
		<li>解冻冻存的 VX2 肿瘤组织块（1 cm × 1 cm），在培养皿中使用手术刀片将其切碎，并按照步骤 1.1.1 的方法通过 70 µm 滤网过滤。分次加入少量 HBSS，确保所有细胞均被过滤，最终体积为 1 mL。计数细胞后，用 0.9% 磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 1 × 107/mL，并置于冰上保存于无菌管中。 
		注：肿瘤组织块由实验室合作者提供，来源于既往在兔股四头肌中传代的 VX2 肿瘤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 手术模型建立
<ol>
	<li>建立手术麻醉与术前准备
	<ol>
		<li>提前1小时对雌性白色新西兰兔（2.5–3.5 kg）进行预给药&#160;在计划的手术程序之前，注射乙酰丙嗪（1 mg/kg，肌内注射）和美洛昔康（0.2 mg/kg，皮下注射）。&#160;使用2-5%吸入式异氟烷麻醉一只雌性新西兰白兔（体重2.5–3.5 kg），去除注射部位的毛发，并用聚维酮碘溶液清洁注射部位。</li>
		<li>使用喉罩气道（LMA）对麻醉后的家兔进行插管，并用胶带固定。通过调节吸入式异氟烷剂量维持深度麻醉，剂量范围为2%–5%。在整个手术过程中定期监测麻醉深度，通过观察生命体征（呼吸频率、毛细血管再充盈时间、如有条件可监测血氧饱和度）以及评估疼痛迹象（活动、对刺激的回缩反应、发声）或麻醉过浅表现（活动、咬LMA导管）进行判断。 
		注意：此操作应由具备手术麻醉监护经验的人员完成。</li>
		<li>在耳缘背侧静脉中放置22号耳静脉导管。于手术皮肤切口前10分钟静脉注射头孢唑林（20 mg/kg）。</li>
		<li>在将兔子放置于手术台上之前，先剪除骨盆和腹部的毛发，然后将兔子以仰卧位固定于手术台上。使用三步法外科皮肤准备（聚维酮碘皂液、氯己定溶液、聚维酮碘溶液）清洁手术区域。在标记耻骨上缘后，用剖腹手术巾遮盖手术区域，暴露下腹部约5 cm × 5 cm的范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开腹切口的制作及子宫角的辨认
	<ol>
		<li>戴上手术帽和口罩。使用氯己定或聚维酮碘外科洗手液清洁双手。采用无菌技术，穿上无菌手术衣并戴好无菌外科手套。</li>
		<li>使用11号刀片手术刀，在兔腹部耻骨联合上方1 cm处的皮肤及皮下组织上做一长度为2.5 cm的切口。切开腹直肌筋膜，并向两侧分离腹直肌，暴露其下方的腹膜。确认腹膜下方无肠管或其他腹腔器官后，锐性切开腹膜。</li>
		<li>通过识别膀胱，并用戴手套的手指在膀胱顶端向上、向后及向外侧扫查，定位子宫角。 
		注意：如有必要，可通过手指按压排空膀胱。找到子宫角后，将其经腹壁切口拉出，置于腹壁上。</li>
		<li>使用3-0编织可吸收缝线，在每侧子宫角距宫颈约1.5–2.0 cm的远端位置进行单缝结扎。缝合位置应位于子宫动脉稍内侧，该动脉沿每侧子宫角的外侧走行。将缝线扎紧，以闭塞远端子宫角。图1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫肌层VX2接种
	<ol>
		<li>使用27号针头，将0.5 mL先前制备的VX2细胞悬液（来自步骤2.3.2，用于培养的VX2模型，或步骤2.4，用于体内扩增的VX2模型）注入每侧子宫角肌层中靠近缝合部位的位置（位于缝合处与宫颈之间）。注射过程持续1分钟，并确保细胞未注入 underlying 子宫腔内。&#160;使用异氟烷（2-5%）吸入麻醉，并配合带有Bain回路的麻醉机对动物进行麻醉。</li>
		<li>注射后对子宫肌层注射部位施加压力30秒，以尽量减少细胞外漏。检查注射部位和缝合部位的止血情况，并将子宫角放回腹腔内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缝合外科切口
	<ol>
		<li>腹壁深层关闭：确定腹膜切口的顶端，用组织镊夹住腹膜、腹直肌和筋膜。
		<ol>
			<li>为此，将缝线在一侧切口顶端固定：在一侧切口处由浅至深进针，另一侧则由深至浅出针，打结固定。利用已固定的缝线，沿切口方向逐段横向穿过腹壁各层组织，连续缝合，针距依次推进，往返于切口两侧。缝合完毕后打结并剪断缝线。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>浅表腹壁缝合：确定皮肤切口的顶端，使用3-0可吸收多股缝线进行皮下连续缝合关闭腹部皮肤。在闭合的切口上涂抹外科胶水，使皮肤边缘对合。
		<ol>
			<li>首先，在切口的一端固定缝线，即在一侧切口处从深层缝至浅层，另一侧则从浅层缝至深层，打结固定。随后利用已固定的缝线，在真皮层内与切口平行进行连续缝合，逐步沿切口左右交替推进。缝合完毕后打结并剪断缝线。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>从麻醉中苏醒：关闭异氟烷，切口关闭后让兔子通过面罩吸入氧气，同时监测其苏醒迹象（如自主运动、睁眼以及喉罩气道上的咀嚼动作）。一旦观察到上述迹象，立即拔除气管插管，并提供&#160; 通过面罩供氧并使用保暖毯，直至兔子清醒并能自主坐立。</li>
		<li>术后监测：术后每天监测兔子两次，持续4天，之后再每日监测一次，持续10天。监测内容包括动物的一般状况、食物和饮水摄入量、尿液和粪便排泄情况、疼痛评估、体重、生命体征（心率、呼吸频率）以及手术部位是否存在肿胀、红斑、分泌物或裂开。</li>
		<li>术后疼痛控制：每日皮下注射美洛昔康（0.2 mg/kg），持续48小时&#160;术后根据疼痛评估按需给予。&#160;术后立即给予布托啡诺，并每12小时给药一次&#160;（0.01–0.05 mg/kg 皮下注射）持续24小时，随后根据疼痛评估按需给予</li>
		<li>术后可根据兽医建议，每天给予抗生素（恩诺沙星，5 mg/kg，肌内注射），连续使用七天，以预防伤口感染。&#160;根据需要，每天两次皮下注射液体（15 mL SQ），以应对脱水；根据需要每日提供软食或其他饮食补充剂以应对体重下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤生长监测
<ol>
	<li>临床监测：从术后第14天开始，每2天监测一次兔子肿瘤生长的临床症状。肿瘤生长的临床症状可能包括口服摄入减少、精神萎靡、腹部压痛、可触及的腹部包块以及盲肠食粪行为丧失。</li>
	<li>影像学与侵入性监测
	<ol>
		<li>CT成像：在术后第21至28天，按照此前3.1.1–3.1.2步骤所述进行术前给药、麻醉和气管插管。将兔子置于仰卧位，放入临床前CT扫描仪中，在静脉注射10 mL碘海醇造影剂后，获取骨盆和腹部的影像。</li>
		<li>手术监测：完成影像检查后，在兔子仍处于全身麻醉状态下将其转移至手术室。按照步骤3.1.4所述进行体位摆放、术区准备和铺巾，通过原切口做长约1.5 cm的再次剖腹探查切口。辨认子宫角并仔细检查是否存在肿瘤。关闭切口，并按照步骤3.5.2–3.5.4所述提供术后护理。</li>
		<li>兔模型使用：若在手术监测时发现兔子存在肿瘤，则将兔子宫内膜癌模型用于计划中的实验。使用体内扩增细胞接种后4周的兔子进行额外实验，而使用体外培养VX2细胞接种后约5–6周的兔模型，以适应较慢的肿瘤生长速度。&#160;当肿瘤直径达到1–1.5 cm（使用游标卡尺体外测量）时，采用兽医批准的方法处死兔子。通过检测心率和呼吸频率等生命体征确认动物死亡。用聚维酮碘溶液清洁局部区域后，使用无菌器械切除肿瘤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种建立VX2子宫内膜癌模型的标准化手术方法，并首次报道了使用培养的VX2细胞构建该模型。75%的成瘤率低于文献中先前报道的100%35,37,53,56；然而，病理证实的淋巴结转移率达到90%，与该模型既往研究结果一致35,53。
加入子宫缝合步骤后，模型的成功率从57%显著提高至81%，我们认为该步骤是手术方案中不可或缺的一部分。最初未进行子宫缝合，是由于文献中关于缝合应用的报道存在矛盾，且存在双侧子宫动脉结扎可能导致子宫角去血管化的担忧。鉴于增加子宫缝合后移植成功率显著提高，我们推测细胞悬液从注射部位泄漏可能是早期成功率较低的原因之一。将细胞悬液在解剖结构上限制于子宫角的一小部分区域，可确保高浓度...

子宫内膜癌，即子宫内膜的癌症，是全球第二常见的妇科恶性肿瘤，在发达国家则是最常见的恶性肿瘤1。子宫内膜癌的发病率持续上升，2005年至2013年间每年增长2.3%，同期死亡率也相应增加了2.2%1,2,3。淋巴结转移的诊断至关重要，因为阳性淋巴结的存在是生存率的强烈负向预测因子4,5,6,7，并可指导辅助治疗的实施8,9,10,11,12,13。目前，淋巴结转移通过手术切除盆腔和腹腔主要血管表面的淋巴组织进行诊断。该手术称为淋巴结清扫术，由于两项大型临床试验得出的生存数据存在矛盾14,15,16,17,18，以及已知的术中15,19,20和术后并发症风险21,22,23，因此存在争议。由于目前的无创影像学手段尚不具备足够的灵敏度和特异性以取代淋巴结切除术24，学界正积极推动开发新的诊断性影像技术。为了在临床前环境中测试这些新型技术，需要建立一种具有腹膜后淋巴结转移的可靠子宫内膜癌模型。
兔VX2肿瘤模型是一种成熟的模型，已被广泛用于研究多种人类实体器官肿瘤25，包括肺26、头颈部27，28、肝29、肾30、骨31，32、脑33、胰腺34和子宫35，36，37。VX2模型最初由Kidd和Rous于1940年建立38，通过成功移植Shope于1933年发现的棉尾兔乳头瘤病毒而获得39。自那时起，VX2模型一直通过在新西兰白兔股四头肌中连续传代维持其体内存在40。然而近年来，多个研究团队已成功在体外培养VX2细胞40，41，42，并证实了该培养细胞系仍保留致瘤性31，42，43。VX2肿瘤在组织学上被定义为未分化型鳞状细胞癌44，并含有类似腺癌的腺样结构特征26。该肿瘤具有易于植入、生长迅速和高度血管化的特点44，45，且能可靠地发生转移，最常见转移至区域性和远端淋巴结45。由于兔子宫的血管和淋巴解剖结构46以及原位生长部位与人类相似，VX2癌的转移模式可模拟人类子宫内膜癌的转移过程，使该模型成为研究人类转移性疾病的可靠工具。此外，组织学特征如异常的微血管增殖47，以及人类与兔之间在免疫学48和遗传学上的相似性49，50，提示该肿瘤微环境可能反映了人类子宫内膜癌的微环境特征。
多个研究团队已报道使用VX2构建具有腹膜后转移的子宫内膜癌模型，成功率较高36,51,52；然而，现有文献在模型构建方法方面存在显著差异。已报道的细胞悬液接种剂量低至4 × 105 个细胞/子宫角51，高至5 × 109 个细胞/子宫角37,53，但目前尚无关于所需VX2细胞剂量的统一标准。此外，已有多种接种方法被报道，包括将肿瘤组织通过显微外科技术植入子宫肌层36、注射VX2细胞悬液37,44,52,53，以及在某些情况下，接种前对子宫角进行缝合固定52。最后，尚无研究团队报道使用体外培养的VX2细胞构建该模型。因此，本研究旨在展示一种成功且标准化的VX2模型构建方法，并首次报道利用体外培养的VX2细胞在中国台湾兔中建立具有腹膜后转移的子宫内膜癌模型。

<table><tbody><tr><td>11刃手术刀，无菌，一次性</td><td>Aspen Surgical (VWR)</td><td>80094-086</td><td></td></tr><tr><td>22号耳静脉导管</td><td>CDMV</td><td>14332</td><td></td></tr><tr><td>3-0 可吸收多股缝合线（Polysorb）</td><td>Covidien</td><td>356718</td><td></td></tr><tr><td>3-0 编织可吸收缝合线（Polysorb）</td><td>Covidien</td><td>356718</td><td></td></tr><tr><td>70 µm 细胞筛，独立包装，尼龙材质</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪（Atravet）</td><td>CDMV</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘皂液（聚维酮碘 7.5%）</td><td>CDMV</td><td>4363</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液（聚维酮碘 10%）</td><td>UHN Stores</td><td>457955</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>McGill University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>UHN 住院药房</td><td>无需货号</td><td></td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td>CDMV</td><td>119872</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>354450</td><td>品牌不重要</td></tr><tr><td>Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，24孔板</td><td>Corning</td><td>354408</td><td>品牌不重要</td></tr><tr><td>Corning BioCoatCellware，I型胶原蛋白，6孔板</td><td>Corning</td><td>354400</td><td>品牌不重要</td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质，*无LDEV，10 mL</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HAM F12 1:1</td><td>Life Technologies</td><td>11320</td><td>品牌不重要</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Caledon Lab Chem</td><td>1/10/4100</td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星（Baytril 注射剂）</td><td>CDMV</td><td>11242</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Corning Centri-Star</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，加拿大来源，500 mL</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td>品牌/来源不重要</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>UHN 住院药房</td><td>无需货号</td><td></td></tr><tr><td>碘海醇造影剂</td><td>GE Healthcare</td><td>407141210</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康（Metacam 0.5%）</td><td>CDMV</td><td>104674</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>本院品牌（UofT 医药库）</td><td>1011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Multicell 或 Sigma</td><td>331-010-CL 或 D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100 mL；10000 U 青霉素，10000 µg 链霉素）</td><td>Corning-Cellgro</td><td>CA45000-652</td><td></td></tr><tr><td>无菌Hanks平衡盐溶液（无Ca++，无Mg++，无酚红）</td><td>T.C.M.F（Bristow博士）</td><td>2011年1月28日</td><td></td></tr><tr><td>外科胶（组织粘合剂）</td><td>3M Vetbond</td><td>14695B</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.25%），蛋白质组学级</td><td>Sigma</td><td>T-6567-5X20UG</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，0.05%，100 mL</td><td>Wisent Inc</td><td>325-542-EL</td><td>品牌不重要</td></tr></tbody></table>

一种由体内传代培养的vx2细胞构建的伴有腹膜后淋巴结病变的原位子宫内膜癌模型

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

子宫内膜癌是北美最常见的妇科恶性肿瘤，其全球发病率正在上升。治疗方案包括手术，是否联合辅助治疗则取决于通过淋巴结切除术确定的淋巴结受累情况。淋巴结切除术是一种并发症较多的手术，且在许多患者中并未显示出治疗获益，因此需要一种新的方法来诊断淋巴结转移。为了测试新型成像剂，亟需建立一种可靠的伴有腹膜后淋巴结转移的子宫内膜癌模型。文献中已多次报道VX2子宫内膜癌模型，但在模型建立方法上存在显著差异。此外，此前仅使用体内传代的VX2细胞构建该模型，尚无研究报道使用体外培养的VX2细胞构建此模型。本文介绍了一种标准化的手术方法和术后监测方法，用于建立VX2子宫内膜癌模型，并首次报道了使用体外培养的VX2细胞成功构建该模型。

使用28只兔子建立子宫内膜癌模型。实验时兔子的平均体重为2.83 kg（2.71–3.58 kg）。其中21只兔子成功长出子宫肿瘤，模型总体成功率为75%。在将子宫缝合步骤纳入实验方案之前，成功率为57%，而加入子宫缝合后成功率提升至81%。子宫缝合是在第7只兔子之后加入实验方案的。th 兔模型因初始建模成功率较低而进行了优化。采用培养的VX2细胞建模尝试8只兔，成功5例（成功率63%）；采用体内传代扩增的VX2细胞建模尝试22只兔，成功16例（成功率73%）。在使用体内传代VX2细胞建立的模型中，细胞接种剂量为5 × 106 每只动物每个子宫角均进行了操作，接种至实验的平均天数为29天（范围24–31天）。在由培养的VX2细胞建立的模型中，采用递增剂量方案确定合适的接种剂量。接种剂量为2.5 x 106 细胞和 5 x 106 每子宫角细胞数的尝试未获成功，且剂量为 10 x 106 每子宫角细胞数在一只兔子中接种成功，然而从接种到实验期间的57天内，肿瘤生长缓...

本方案介绍了一种标准化的体外培养VX2细胞的方法，并建立了在兔体内具有腹膜后淋巴结转移的子宫内膜癌原位VX2模型。原位子宫内膜癌模型对于研究新型影像学技术在淋巴结转移诊断中的临床前应用具有重要意义。

一种由体内传代培养的VX2细胞构建的伴有腹膜后淋巴结病变的原位子宫内膜癌模型

子宫内膜癌是北美最常见的妇科恶性肿瘤，其发病率在全球范围内呈上升趋势。治疗方案包括手术，可选择性结合……

这种具有腹膜后淋巴结转移的VX2子宫内膜癌模型可用于研究影像引导手术技术。该技术的主要优点在于其可靠性高、操作简便，并能产生一致的转移扩散，模拟人类子宫内膜癌的转移模式。总体而言，这是一种简便的技术。然而，在尝试构建模型之前练习缝合操作将有助于使该过程更加容易。该技术的可视化演示非常重要，因为它有助于展示模型建立过程中涉及的手术步骤。本次操作将由 Harley Chan 和我进行演示，我实验室的技术员丁丽丽（Lili Ding）也将参与演示。为准备用于注射的体外扩增的VX2细胞，首先将冻存的VX2细胞置于37摄氏度的珠子或水浴中温育一分钟。细胞融化后，将细胞悬液转移至含有10毫升培养基的15毫升离心管中。通过离心沉淀细胞。将沉淀重悬于9 mL培养基中。将细胞转移至大培养瓶中，在37°C条件下静置培养，并每日通过光学显微镜观察细胞融合度。当细胞融合度达到80%时，向培养瓶中加入3 mL 0.2%胰蛋白酶，然后将细胞放回细胞培养孵育箱中孵育5分钟。待细胞脱落后，将细胞悬液转移至锥形管中，通过离心收集细胞。每次用9毫升新鲜PBS洗涤细胞沉淀，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在冰上将细胞重悬于新鲜PBS中进行计数，随后在新的锥形管中稀释至每毫升PBS含4×10⁷个VX2细胞的浓度。为准备用于注射的体内扩增的VX2细胞，将冷冻的1厘米见方的VX2肿瘤组织块逐一解冻，并使用手术刀在培养皿中将组织样本切碎。将组织碎片转移至70微米滤膜中，并分次加入少量（最多1毫升）Hank's平衡盐溶液（HBSS），以确保所有细胞均通过滤网。随后，在冰上将细胞悬液转移至无菌离心管中，稀释至每毫升HBSS含1×10⁷个VX2细胞的浓度，并在稀释前对细胞进行计数。确认动物对刺激无反应后，将麻醉的白色新西兰雌兔仰卧位放置于手术台上。剪除骨盆和腹部区域的毛发，并采用三步外科皮肤准备法清洁暴露的皮肤。佩戴手术帽和口罩后，先用消毒剂刷洗手部，再穿上无菌手术衣和无菌外科手套。标记耻骨上缘，并用剖腹手术巾铺盖手术区域，仅暴露下腹部一个5厘米×5厘米的区域。接着，使用11号手术刀片在耻骨联合上方1厘米处做一2.5厘米长的切口，切开皮肤和皮下组织。切开腹直肌鞘，并将腹直肌向两侧分离，以暴露其下方的腹膜。确认腹膜下无肠管或其他腹部脏器。锐性切开腹膜，辨认膀胱，并用戴手套的手指向上、向后及向侧方推开膀胱顶端，以定位子宫角。将子宫角经腹壁切口牵出，置于腹壁上。使用3-0编织可吸收缝线对每侧子宫角进行单缝结扎，结扎位置位于宫颈远端约1.5至2厘米处，且紧邻子宫动脉内侧。随后扎紧缝线，确保包含远端子宫角。为将先前制备的VX2细胞悬液接种至子宫肌层，取1毫升注射器（配备27号针头），抽取1毫升细胞悬液。在一分钟内缓慢地将0.5毫升细胞悬液注入每个子宫角的缝合部位近端，位置位于缝线与宫颈之间。然后对肌层注射部位施加压力30秒，以尽量减少细胞泄漏。在将子宫角放回腹腔之前，检查注射部位和缝合部位是否止血。进行腹壁深层关闭时，首先确定腹膜切口的顶端，使用手术钳夹住腹膜、腹直肌及筋膜。用一根3-0可吸收多股缝线在切口一端由浅至深进针，另一端由深至浅出针，以固定缝线。随后，沿切口两侧逐步移动，利用相连的缝线垂直于切口方向，穿过腹壁各层组织连续缝合，最后打结并剪除线尾。对于腹壁浅层关闭，使用3-0可吸收多股缝线进行皮下连续缝合，从切口一侧由深至浅缝合，另一侧由浅至深缝合。打结后，利用已固定的缝线沿切口方向在真皮层内平行进行连续缝合，逐步从一侧向另一侧推进。缝合完毕后打结，并剪除线头。将手术胶涂抹于闭合的切口处，以使皮肤边缘贴合。随后，将动物置于带有氧气供给并进行监测的保温毯上，直至动物清醒并能自主坐立。在建立该模型时，以每侧子宫角接种剂量为2×10⁷个细胞，共接种两次，在四只家兔中均成功建模，从接种至实验的平均时间为45天，因此确定该剂量为培养型VX2模型的最佳注射剂量。对于在体内传代建立的VX2模型，在16只兔中成功构建，从接种至实验的平均时间为29天，确定每次每子宫角注射1×10⁶个细胞为最佳接种剂量。所有模型均成功诱导出腹膜后淋巴结的转移性转化。此外，通过组织学分析发现，由培养的VX2细胞来源的肿瘤及转移性淋巴结与体内传代VX2细胞来源的肿瘤表现相似，可见密集的甲苯胺蓝染色细胞侵入肌层，并形成类似腺样结构，伴有大量病理性有丝分裂相。将缝线置于子宫动脉内侧，以避免血管穿刺导致出血，并注意将细胞注入肌层而非子宫内膜腔。在模型制备过程中需注意采用规范的无菌操作技术，以防止术后感染，同时在手术期间做好防护，避免接触钡材料。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。...

结直肠癌小鼠原位模型

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像...

用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

本视频展示了通过将高转移性的VX2细胞悬液注射到兔结扎的子宫角中，建立子宫内膜癌兔模型的方法。该方法可成功诱导原发性子宫内膜癌并伴有腹膜后淋巴结转移。...

建立转移性子宫内膜癌模型：一种在兔模型中诱导子宫内膜癌伴淋巴结转移的技术

建立原发性侵袭性原位膀胱癌异种移植模型的传统技术需要开腹手术并游离膀胱。该操作对小鼠造成显著的病痛，技术难度高且耗时。因此，我们开发了一种利用超声引导的高精度经皮穿刺方法。...

微创建立小鼠原位膀胱异种移植模型

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用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。<br...

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

本实验方案的目的是演示前列腺癌细胞的前列腺内注射，随后进行阉割。在具有临床相关性的肿瘤微环境和免疫健全宿主的背景下，建立依赖雄激素及去势抵抗性前列腺癌的原位临床前模型，对于研究该疾病至关重要。...

一种用于雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型

我们介绍了一种利用生物发光技术量化肿瘤负荷的小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型，以模拟人类乳腺癌的进展过程。...

建立小鼠原位转移性乳腺癌模型及实施小鼠根治性乳房切除术

本文旨在为开发和使用VX2癌兔肝癌模型提供基础指导。...

兔VX2肝癌模型的建立及其血管造影应用

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。...

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

本方案描述了将患者来源的癌细胞原位植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的操作。该模型可重现晚期结直肠癌的转移性疾病，能够在具有临床相关性的肺转移和肝转移场景中评估新型治疗药物。...

原位移植患者来源的癌细胞可模拟晚期结直肠癌

学习在兔子体内建立VX2子宫内膜癌原位模型并培养细胞的方法。该技术可靠且可重复，能够模拟人类癌症的腹膜后淋巴结转移模式，为影像引导手术技术的研究提供重要工具。

一种由体内传代培养的VX2细胞构建的伴有腹膜后淋巴结病变的原位子宫内膜癌模型

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