使用硫唑橙替代溴化乙锭或其他染料进行DNA电泳
2019年3月31日
本文介绍了一种利用噻唑橙在凝胶电泳实验中检测DNA的方案。使用噻唑橙可替代溴化乙锭，且可通过紫外光或蓝光实现荧光检测。
本方案提供了一种简单且低成本的替代方法，用于在电泳过程中检测DNA，无需使用溴化乙锭。通过去除溴化乙锭，可采用紫外光或蓝光进行检测。蓝光不会对DNA造成损伤，从而提高了后续实验的成功几率。
尝试这种方法非常简单，您只需将凝胶中的溴化乙锭替换为硫唑橙即可。首先，通过将约0.7克琼脂糖溶于70毫升的三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-EDTA或三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐缓冲液中，制备1%的微型凝胶。
接下来，将噻唑橙溶解于DMSO中，配制成10,000倍浓缩液。噻唑橙对光不特别敏感，但在不使用时应避光保存。对于长期储存，可将噻唑橙-DMSO混合液分装成小份后冷冻保存。
然后，加入硫唑橙至终浓度为1.3微克/毫升，并将琼脂糖缓冲液与硫唑橙混合物微波加热约60秒，以溶解琼脂糖。将琼脂糖混合液倒入含有合适梳子的凝胶制备装置中，静置使琼脂糖溶液凝固成胶。若尚未将凝胶置于电泳装置中，则上样前应先将凝胶放入电泳装置内。
然后加入TAE或TBE电泳缓冲液，直至完全覆盖凝胶表面。接着，使用上样染料加入10 µL DNA样品。同时加入DNA分子量标记物作为参考。
盖上盖子并连接电极，在 mini-gel 中以 100 伏电压电泳，直至加样染料迁移约 4 到 7 厘米。如果在制胶前未加入噻唑橙，则将凝胶浸入含有噻唑橙的缓冲液中，在轻微振荡条件下染色约 20 分钟，或直至条带完全显现。如需使用紫外透射仪观察凝胶，需将凝胶从电泳装置中取出，并放置于紫外透射仪上。
使用蓝光透射仪或手电筒观察凝胶时，将凝胶置于蓝光透射仪上，或从上方或下方用蓝光LED手电筒照射凝胶。使用琥珀色发射滤光片滤除蓝光，以便观察DNA与硫唑橙复合物产生的荧光，并保护染料。如需进行进一步的酶切或连接反应，可从凝胶中切下目标DNA条带，并使用现成的试剂盒或标准方案提取DNA。
在凝胶成像装置中选择合适的激发和发射参数。若缺乏配备合适滤光片的成像系统，可在相机与凝胶蓝光激发光源之间放置一个琥珀色滤光片。溴化乙锭、硫唑橙以及一种常见的可被蓝光检测的商用DNA染料之间的检测灵敏度相似，在小型凝胶中，这三种染料每泳道的检测限均为1至2纳克。
用硫唑橙染色的琼脂糖凝胶在经紫外光或蓝光透射仪或蓝光手电筒激发后可被检测到。尽管硫唑橙似乎比溴化乙锭的危险性更低，但仍应佩戴手套和护目镜等标准个人防护装备。
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概述
本方案提供了一种简单且低成本的替代溴化乙锭的方法，用于凝胶电泳中的DNA检测。通过使用噻唑橙，研究人员可利用紫外光或蓝光进行荧光检测，从而提高实验过程中DNA的安全性。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 电泳技术
背景
- 溴化乙锭是一种常用的DNA染色剂，但会对DNA完整性造成风险。
- 硫唑橙为DNA可视化提供了更安全的替代方案。
- 使用无损伤的蓝光即可实现荧光检测。
- 该方法成本低廉且易于实施。
研究目的
- 提供一种无需使用溴化乙锭的DNA检测方案。
- 展示硫唑橙在凝胶电泳中检测DNA的有效性。
- 强调使用蓝光进行DNA可视化的优势。
使用的方法
- 使用琼脂糖和适当缓冲液制备1%微型凝胶。
- 在凝胶中以硫唑橙替代溴化乙锭。
- 使用紫外光或蓝光进行荧光检测。
- 电泳后评估DNA完整性。
主要结果
- 噻唑橙可有效染色琼脂糖凝胶电泳中的 DNA。
- 使用蓝光进行检测具有较高的安全性。
- 该实验方案简单且可重复。
- 由于 DNA 损伤减少，后续实验的成功率有所提高。
结论
- 噻唑橙是溴化乙锭的一种可行替代物。
- 使用蓝光可最大限度减少检测过程中对DNA的损伤。
- 该方法可提高后续分子生物学实验的可靠性。
常见问题
行业重要性概述
DNA凝胶电泳在靶点验证和检测方法开发中仍是一项基础性实验流程，其中样品完整性直接影响下游实验的可靠性。使用噻唑橙替代溴化乙锭可在保持检测灵敏度的同时降低基因毒性风险，从而支持更安全的化合物筛选和先导化合物鉴定流程。这使得生物制药研发团队能够在不牺牲通量或成本效益的前提下，保持DNA质量以用于克隆、测序或功能检测。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过DNA片段分析实现假设验证，且不会引入染色导致的假象，从而避免干扰目标确认。
- 操作价值：兼容现有的紫外或蓝光成像设备，对于 currently 使用溴化乙锭的实验室，无需重新设计实验方案。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可实现定量DNA片段大小分析，检测限为每泳道1-2 ng，适用于克隆效率评估或PCR产物验证中的精确片段分析。
- 操作价值：无需处理溴化乙锭相关的有害废物及特殊处置要求，简化实验室安全合规流程。
转化与临床前研究
- 科学价值：保持DNA完整性，适用于连接、转化或转染等下游应用，提高临床前模型构建中载体构建的成功率。
- 操作价值：实现蓝光可视化，减少紫外线对样品的损伤，提升重复实验间的可重复性。
流程与工作流整合
该方法适用于发现生物学工作流程，在评估基因修饰或筛选结果时，可为靶点验证、先导物识别以及临床前构建体开发提供DNA分析依据。
- 发现生物学：支持准确的DNA片段分离与大小测定，能够在靶点确认过程中可靠地评估基因编辑效果、质粒完整性或PCR扩增产物。
- 筛选：提供可重复且定量的条带可视化结果，对于评估基于核酸检测中的文库多样性或阳性结果确认至关重要。
- 分析：生成可在不同样本间比较的荧光强度数据，从而在不同实验条件下对DNA产量或纯度进行一致性的比较。
- 转化研究：保持DNA的功能性，可用于哺乳动物细胞转染或病毒载体生产，对推动候选分子进入临床前测试至关重要。
- 企业级复用：作为一种即插即用的试剂替代方案，可在不同团队和实验地点间标准化使用，无需对电泳设备或软件重新验证。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少染料诱导的DNA损伤，降低机制研究中的不确定性，提高用于靶点评估的分子生物学数据的可靠性。
- 操作价值：使用廉价且无危害的硫代黄素橙染料，储存简便（分装后冷冻保存于DMSO中），降低试剂成本和安全防护负担。
- 战略价值：通过保持样品完整性，支持后续测序、克隆或功能检测，增强“推进/终止”决策的可靠性。
- 项目影响：确保基于DNA的数据质量达到先导化合物优化和临床前候选物筛选的标准，支持基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 具备琼脂糖凝胶制备与电泳的分子生物学专业知识。
- 配备紫外或蓝光透射仪及琥珀色发射滤光片的标准电泳装置，用于检测。
- 对冷冻保存的噻唑橙-DMSO 分装样品进行一致的解冻与混匀，以确保染色均匀。
- 在适配新型样本时，需在不同模型系统（如质粒、基因组 DNA）中验证染色效率。
- 局限性：若采用电泳后染色，需优化染色时间（20 分钟），相比预制胶方法增加了一个步骤。
