Name: CRISPR/Cas12a 多路复用基因组编辑糖母细胞和酵母像素艺术的创作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习利用CRISPR/Cas12a单crRNA阵列对酿酒酵母进行多重基因组编辑，无需克隆即可同时修饰多个位点，高效构建产类胡萝卜素菌株并创作酵母像素艺术。该方法为合成生物学研究提供了快速灵活的基因工程工具。

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本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为686070（DD-DeCaf）和764591（SynCrop），以及荷兰科学研究组织（NWO）“生命构建模块”研究计划（项目编号737.016.005）的资助。T.E.G. 获得了英国皇家学会（资助号UF160357）和BrisSynBio的资助，一个&#160;英国生物技术和生物科学研究理事会/工程与物理科学研究理事会合成生物学研究中心（资助号：BB/L01386X/1）。我们感谢 Zi Di 和 Jeffrey van Wijk 在酵母点种实验及酵母像素艺术创作中的贡献。&#160;

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作者声明存在利益冲突。作者已就所介绍的方法申请了相关知识产权。

本方案描述了利用来自 Lachnospiraceae bacterium ND2006 的 Cas12a 蛋白，结合单个 crRNA 阵列和供体 DNA，对 S. cerevisiae 进行多重基因组编辑的方法。文中详细说明了单个 crRNA 阵列和供体 DNA 的设计过程。与已广泛应用的 CRISPR/Cas9 系统相比，CRISPR/Cas12a 具有一项独特的附加功能，即能够加工由单个 crRNA 阵列表达的多个 crRNA13,33。由于这一特性，可更简便地实现多个靶点的同时编辑，并可通过一次转化完成。Zetsche et al.34 此前已证实该单 crRNA 阵列策略，利用 AsCas12a 在哺乳动物细胞中同时编辑了多达四个基因；Swiat et al.35 则利用 FnCas12a 将四个 DNA 片段插入酵母基因组。据我们所知，目前尚未有报道使用 Cas12a 系统实现更高数量的同步基因组修饰，且 Cas12a 单阵列所能容纳的靶点最大数量仍有待确定。近年来，结合 Cas12a 与单个 crRNA 阵列的进一步研究还包括在多种生物中实现多重转录调控33,36,37。
在本方案中有一些关键步骤。应仔细设计 Cas12a 基因组编辑实验中涉及的所有 DNA 序列，特别是当引入新的 DNA 序列时。在将新的 crRNA 间隔序列组合成单个 crRNA 阵列之前，应通过单重基因组编辑实验（如 Verwaal et al.19 所述）确定其功能。遵循 Cas12a 编辑实验中所用转化缓冲液溶液的制备建议，以实现酵母的高效转化。
该技术存在一些可选的优化方案。建议在转化过程中使用1 µg的每种供体DNA，即线性化的pRN1120质粒或单个crRNA阵列表达盒，尽管使用较低量的DNA也可能获得满意的转化效率。可通过预实验转化来确定是否可使用较低的DNA用量。酿酒酵母（S. cerevisiae）的转化也可采用本方案未描述的其他方法，例如Gietz et al.（2007）38所述的方法。引导RNA受体质粒pRN1120适用于表达单个crRNA以及不同Cas12a变体（例如，来自Acidaminococcus spp. BV3L6或Francisella novicida U112）的单个crRNA阵列，同时也可用于与Cas9联用表达sgRNA19。供体DNA不仅限于类胡萝卜素基因表达盒以及靶向基因组DNA中所述INT1、INT2和INT3位点的侧翼区域。根据本方案所述的设计原则，任何感兴趣的DNA均可通过多重方式导入宿主基因组；或者，也可利用供体DNA实现宿主基因组中特定DNA片段的删除。单个crRNA阵列的模块化结构便于对间隔序列和直接重复序列进行便捷调整。通过修改间隔序列，可改变预期的整合位点，其设计可借助基因组靶位点识别工具完成，例如 GuideScan软件1.039。除了使用包含连接序列的较长侧翼序列外，还可通过在PCR引物中引入50 bp的侧翼区域序列，将该50 bp侧翼序列直接包含在供体DNA序列中。在此情况下，成功的多重基因组编辑实验仅需总共三个供体DNA片段，而非九个。
综上所述，本方案提供了利用Cas12a结合单个crRNA阵列方法在S.&#160;cerevisiae中进行多重基因组编辑的逐步操作指南。该方案通过使用9个供体DNA片段和编码三个gRNA的单个crRNA阵列实现了多重基因组编辑。我们展示了本研究中报告的三种菌株设计的整体编辑效率较高，介于50%至94%之间。总之，Cas12a的独特之处在于其能够在细胞内将单个crRNA阵列加工成独立的crRNA，这使得Cas12a成为实现多重基因组编辑以及一次性构建靶向多个表达盒的转录调控模块的优秀工具。最终获得了三种产生类胡萝卜素的菌株，其产量不同，颜色呈现从黄色到橙色的多种色调。利用这些菌株及野生型菌株，我们展示了如何直接使用声波液体处理系统制作酵母像素艺术——以此纪念罗莎琳德·富兰克林（Rosalind Franklin），她65年前通过著名的“照片51”为DNA结构的发现作出了重要贡献23。

CRISPR/Cas 酶无疑彻底改变了分子生物学，并作为基因组编辑工具被广泛采用，其编辑速度是此前无法实现的1。DiCarlo 等2首次报道了利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对&#160;Saccharomyces cerevisiae基因组进行修饰，成功实现了基因敲除，并利用外源引入的寡核苷酸完成定点突变。后续酵母CRISPR工具箱的发展包括：将无催化活性的“死亡”Cas9（dCas9）与转录效应结构域融合，实现转录的激活与沉默3；在代谢通路工程中同时应用基因组编辑与调控功能，实现基因的同步激活、抑制和删除4；从S. cerevisiae基因组中删除大片段序列5；以及多条染色体的融合6。
CRISPR/Cas基因组编辑系统起源于细菌和古菌的适应性免疫系统，分子生物学家已将这些系统改造用于基因组编辑。其功能基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）DNA区域，该区域编码可识别外源DNA或RNA的RNA，以及CRISPR相关基因（Cas），后者编码RNA引导的内切核酸酶。1,7,8,9根据最近对CRISPR/Cas系统的基因组分析，建议将CRISPR/Cas系统分为两类、五种类型和16个亚型10这两类系统根据参与靶标切割的效应复合物的结构特征加以区分。通常，具有多亚基结构的CRISPR/Cas系统被归类为1类，而具有单亚基效应复合物的系统则属于2类。10,11在本文中，我们探讨了第二类V型Cas12a，此前称为Cpf110,12，是II型Class 2 Cas9的一种替代工具。尽管Cas9在研究中已被充分表征并广泛应用，Cas12a仍具备额外的优势特性12首先，Cas12a 形成一个&#160;与42至44个核苷酸长度的CRISPR RNA（crRNA）形成复合物，无需额外的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。因此，在CRISPR/Cas12a系统介导的基因组编辑中，可使用比CRISPR/Cas9更短的引导RNA。其次，Cas12a独特的内切核酸酶和内切核糖核酸酶活性使其能够对前体crRNA进行成熟加工。13这种RNase活性使得多个crRNA可以在单个CRISPR crRNA阵列上进行编码，而Cas9则需要分别表达每一个所谓的单导向RNA&#160;（sgRNA），或者例如表达额外的内切核酸酶（例如，Csy4）与围绕每个sgRNA的Csy4识别基序联用14,15第三，Cas12a识别靶位点需要在靶序列5’端存在原间隔序列邻近基序（PAM），并在PAM下游+18至+23位点后进行切割，产生具有黏性末端的DNA片段；而Cas9则需要PAM位于靶序列的3’端，并在PAM上游-3位点后切割，产生平末端的DNA断裂12第四，Cas12a 的 PAM 共识核苷酸序列为 (T)TTV，而 Cas9 为 NGG，这使得 Cas12a 成为靶向富含 T 的启动子和终止子序列的有力候选工具。16最后，最近一项研究报道，Cas12a相较于天然Cas9具有更高的靶向特异性17.
我们提出了一种利用CRISPR/Cas12a系统进行基因组编辑的实验方案 S. cerevisiae 特别关注使用单个crRNA阵列同时将多个DNA表达盒引入独立基因组位点（多重基因组编辑）。该方案的关键步骤如图所示 图1作为概念验证，CRISPR/Cas12a 系统被用于将三个表达盒导入基因组中 S. cerevisiae 可实现β-胡萝卜素的生产18 如示意图所示 图2β-胡萝卜素的产生影响表型 S. cerevisiae: 即在成功导入类胡萝卜素生物合成所需的全部三种异源基因后，原本白色的 S. cerevisiae 细胞会根据各基因启动子的表达强度呈现黄色或橙色。由于该通路具有简单的可视化读出特性，已被用于开发先进的基于CRISPR的基因组编辑系统与方法。19,20. 在本研究中，表达盒编码类胡萝卜素基因 crtE, crtYB 和 crtI 已采用黄金门克隆（Golden Gate cloning, GGC）方法构建21 使用异源启动子和同源终止子驱动基因表达。表达盒两侧被称为连接子（connectors）的特异性50个碱基对（bp）序列所包围，这些序列可用于 体内 通过使用含有相同50 bp序列的整合侧翼DNA序列（侧翼区域），将目标片段组装并整合到酵母基因组DNA中由侧翼区域指定的位置。通过采用不同强度的启动子，获得了类胡萝卜素产量水平不同的菌株，从而导致细胞颜色产生差异。这些菌株——灵感来自“Yeast Art Project”22 - 采用声波液体处理器点样系统，利用四种颜色的酵母菌株创建了一幅高分辨率的罗莎琳德·富兰克林“酵母照片”。富兰克林（1920–1958）是英国化学家和X射线晶体学家，因通过“照片51号”对DNA结构的发现作出重要贡献而闻名23,24,25.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;实验方案专用化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td>电泳</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>大肠杆菌转化子筛选</td></tr><tr><td>BsaI-HF (20 U/&amp;micro;l)</td><td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>黄金门克隆</td></tr><tr><td>细胞裂解液（来自 Puregene Yeast/Bact. Kit B 试剂盒）</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取</td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>pRN1120线性化</td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1626</td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化（载体DNA）</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>pRN1120线性化</td></tr><tr><td>分析纯无水乙醇</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>G418硫酸二盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td>酿酒酵母转化子筛选</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&amp;nbsp;</td><td>酵母像素艺术</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>100993</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取</td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6883</td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>Nancy-520 DNA凝胶染料</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>电泳</td></tr><tr><td>NEB10感受态大肠杆菌细胞</td><td>New England BioLabs</td><td>C3019H</td><td>大肠杆菌转化：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>诺尔斯曲菌素</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB102</td><td>酿酒酵母转化子筛选</td></tr><tr><td>Phusion缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>聚乙二醇4000</td><td>Merck</td><td>7490</td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>蛋白沉淀溶液（10 M NH4AC）（来自 Puregene Yeast/Bact. Kit B 试剂盒）</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取</td></tr><tr><td>紫色上样染料</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td>电泳</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>质粒纯化</td></tr><tr><td>RNase混合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>黄金门克隆</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 (1 U/&amp;micro;l)</td><td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>黄金门克隆</td></tr><tr><td>UltraPure琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>电泳</td></tr><tr><td>Wizard SV凝胶及PCR产物纯化系统试剂盒</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>PCR产物及线性化pRN1120的纯化</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td>pRN1120线性化</td></tr><tr><td>Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&amp;micro;L)</td><td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取（酵母裂解酶）</td></tr><tr><td>Zymolyase储存缓冲液</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>酿酒酵母基因组DNA提取（酵母裂解酶配制所需）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2*蛋白胨-酵母提取物（PY）琼脂</td><td></td><td></td><td>大肠杆菌平板培养</td></tr><tr><td>2*PY培养基</td><td></td><td></td><td>大肠杆菌培养</td></tr><tr><td>去矿物质水</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>ELFO缓冲液</td><td></td><td></td><td>电泳</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>多个步骤</td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td></td><td></td><td>DNA储存，酿酒酵母转化</td></tr><tr><td>酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YEPD；2%葡萄糖）培养基</td><td></td><td></td><td>酿酒酵母培养</td></tr><tr><td>YEPD（2%葡萄糖）琼脂</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; 酿酒酵母平板培养</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（50 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 0.5 - 10 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 10 - 200 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 100 - 1000 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇瓶（500 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机（Falcon管）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo 525声波液体处理系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机（Eppendorf管）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCSN067</td><td>Addgene</td><td>ID 101748</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; 菌株&lt;br/&gt; CEN.PK113-7D</td><td>EUROSCARF 菌种库</td><td></td><td>http://www.euroscarf.de</td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a 对 saccharomyces cerevisiae 的多重基因组编辑及酵母像素艺术的创建

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

高效率、易用性以及多重适应性使得成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统在高级基因修饰中得到广泛应用 Saccharomyces cerevisiae，一种工业生物技术中的模式生物和常用工作平台。本研究应用了CRISPR相关蛋白12a（Cas12a），这是一种RNA引导的内切酶，其特性与Cas9有明显区别，进一步拓展了基因组编辑的分子工具箱。CRISPR/Cas12a系统的一个优势在于，它可通过单一转录单元（单个CRISPR RNA（crRNA）阵列）表达多个引导RNA，实现多重基因组编辑。本文提供了一种将多个异源基因同时整合到 S. cerevisiae 利用CRISPR/Cas12a系统，通过单一crRNA阵列构建体表达多个crRNA，对基因组进行编辑。该方法利用了 S. cerevisiae 执行 体内 将DNA片段重组，以将单个crRNA阵列组装到可用于转化子筛选的质粒中，同时组装可整合至基因组预定位置的供体DNA序列。Cas12a被组成型预先表达，以促进对靶位点的切割 S.&#160;cerevisiae 在表达单个crRNA阵列后，可在基因组的预定位置实现编辑。本方案包括单个crRNA阵列和供体DNA表达盒的设计与构建，并采用一种基于独特50 bp DNA连接序列和独立整合侧翼DNA序列的整合策略，通过标准化和模块化简化实验设计，同时拓展应用范围。最后，我们展示了一种利用声波液体处理仪和构建的不同颜色类胡萝卜素产生型酵母菌株创建酵母像素艺术的简便技术。

通过构建三种表达 crtE、crtYB 和 crtI 基因的类胡萝卜素合成型 S. cerevisiae 菌株，展示了利用 CRISPR/Cas12a 进行多重基因组编辑的实验方案，这些菌株分别使用了强、中、弱三种不同强度的异源启动子：分别为菌株1、菌株2和菌株3（补充表3）。构建这些菌株需要为每个菌株生成三个供体DNA表达盒以及六段侧翼区域，以靶向基因组DNA中的三个不同位点（见图2B）。如本文所述，启动子、开放阅读框、终止子以及两个连续的50 bp连接序列通过Golden Gate克隆反应组装成一个表达盒，并通过PCR验证组装结果（图3A）。单个crRNA阵列以合成DNA片段形式订购，并通过PCR扩增获得（图3B）。用于插入单个crRNA阵列的受体质粒（质粒pRN1120）使用EcoRI-HF和XhoI进行线性化处理，并通过电泳确认线性化效果（图3C）。所引入的供体DNA表达盒及侧翼区域的设计与核苷酸序列详见补充表3和补充表4。单个crRNA阵列表达盒的序列见补充表1。单个crRNA阵列中包含的间隔序列（spacer）的功能此前已通过单重基因组编辑实验结合单个crRNA进行了验证19。
使用Cas12a进行基因组编辑的效率首先根据转化后获得的有色菌落数量进行评估（表1，图4）。所构建的三种菌株的编辑效率在50%至94%之间。值得注意的是，用于构建菌株1的表达盒引入后表现出最低的编辑效率，这可能与供体DNA的性质有关（即，这些表达盒在三个强启动子控制下分别编码crtE、crtYB和crtI）。其次，通过PCR验证了三个供体DNA表达盒在基因组DNA目标位点的正确整合（图5）。引物设计的原则是仅在供体DNA正确整合至目标位点时才能扩增出PCR产物。在每次转化实验中，从转化平板上挑选8个菌落进行检测（注意：图5中仅展示了其中3个）。总体而言，每种供体DNA检测的8个菌落中，>90%的转化子在INT1位点实现了crtE供体DNA的正确整合，在INT2位点实现了crtYB的正确整合，以及在INT3位点实现了crtI的正确整合。这些结果表明，CRISPR/Cas12a系统结合单个crRNA阵列能够实现对S. cerevisiae基因组多个位点的高效多重编辑。
此外，我们利用构建的三种产类胡萝卜素的酵母菌株以及一种无色的野生型菌株，展示了“酵母像素艺术”的创建过程。以罗莎琳德·富兰克林的黑白图像（图6A）为起点，生成了一幅四色图像（图6B）及相应的点样列表，并使用声波液体处理仪将四种不同的酵母菌株点样到琼脂微孔板上，最终形成了一幅高分辨率的罗莎琳德·富兰克林“酵母画像”（图6C,D,E）。
<img alt="Cas12a编辑用单个crRNA阵列制备流程图；PCR方法及酵母像素艺术结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：CRISPR/Cas12a 多重基因组编辑实验方案的工作流程 S. cerevisiae. 该流程包含本方法的关键步骤。详细信息请参见实验方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR-Cas12a 基因编辑示意图；含 crRNA 的线性化载体，展示切割位点" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2CRISPR/Cas12a 多重基因组编辑使用单个 crRNA 阵列的示意图 (A单个crRNA阵列由三个成熟形式的crRNA单元组成，每个单元包含一个针对LbCas12a的20 bp直接重复序列（灰色方块）和一个23 bp的引导序列（彩色菱形）。crRNA阵列的表达由 SNR52 启动子和 SUP4 终止子。转化 S. cerevisiae 使用线性化的pRN1120以及含有与pRN1120同源序列的单个crRNA阵列表达盒（斜线纹）可实现 体内 在预先表达 LbCas12a 的细胞中重组为环状质粒。随后由 Cas12a 对单个 crRNA 阵列进行加工。BCas12a 被引导至预期的基因组靶位点 INT1、INT2 和 INT3，并产生双链断裂。在转化体系中加入了包含侧翼区域和类胡萝卜素基因表达盒的供体 DNA。供体 DNA 组装体被靶向至基因组 DNA 中 INT1 位点附近的连续 DNA 区域crtE），INT2（crtYB) 和 INT3 (crtI位点通过 体内 由于存在50 bp的同源连接序列（标记为5、A、B、C、D或E）而发生重组。P1–P3，不同的启动子；T1–T3，不同的终止子。该图已根据Verwaal的资料修改 等 201819. 使用合成生物学开放语言（SBOL）视觉符号表示的遗传构建体40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳分析；DNA分离；ladder；bp标记；结果；分子生物学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：PCR验证基因组编辑实验。（A）组装的供体DNA片段的Golden Gate克隆反应验证。获得的结果与预期长度一致。（B）单个crRNA阵列的PCR。（C）质粒pRN1120的线性化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂平板上细菌菌落生长、对比图、实验结果、微生物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：S. cerevisiae 利用多重基因组编辑方法进行转化的平板图。 （A）菌株 1 在三个强启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（深橙色菌落）。（B）菌株 2 在三个中等强度启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（橙色菌落）。（C）菌株 3 在三个弱启动子驱动下表达 crtE、crtYB 和 crtI（黄色菌落）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA片段分离和基因编辑菌落鉴定的凝胶电泳结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过PCR验证供体DNA表达盒在基因组DNA目标位点的整合情况。（A）菌株1的三个菌落的验证结果。（B）菌株2的三个菌落的验证结果。（C）菌株3的三个菌落的验证结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="罗莎琳德·富兰克林照片转化为3D图像；实验室中的分光光度计装置；彩色像素化效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：罗莎琳德·富兰克林的酵母像素艺术图。（A）用作模板的220 × 280像素罗莎琳德·富兰克林黑白RGB照片。（B）将罗莎琳德·富兰克林的黑白照片通过计算机转换为4色、64 × 96像素的列表。（C）酵母像素艺术图，包含64 × 96个酵母菌落，图中附带局部放大区域。（D）声学液体处理仪的照片，旁边放置两个完全培养的平板。（E）完全培养的微孔板照片，其上含有64 × 96个酵母菌落。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>菌株 1</td>
			<td>菌株 2</td>
			<td>菌株 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>有色菌落</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>白色菌落</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总菌落数</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转化效率</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：多重基因组编辑方法的编辑效率。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>crRNA 阵列序列a,b,c,d,e,f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGTCTTTGAAAA 
			GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG 
			TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA 
			TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC 
			ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT 
			CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC 
			GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT 
			TTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG 
			GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a. 与 pRN1120 同源（粗体）。 
			b. SNR52 启动子（斜体）。 
			c. 基因组靶序列（下划线）。 
			d. 针对 LbCas12a 的向导直接重复序列（斜体，粗体）。 
			e. SUP4 终止子（斜体）。 
			f. 与 pRN1120 同源（粗体）。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
补充表 1：与质粒 pRN1120 具有同源性的 LbCas12a 单 crRNA 阵列。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列a</td>
			<td>描述b</td>
			<td>使用步骤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>用于扩增单个crRNA阵列的正向引物</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>用于扩增单个crRNA阵列的反向引物</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>用于扩增含连接子5的供体DNA的正向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>用于扩增含连接子A的供体DNA的反向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>用于扩增含连接子B的供体DNA的正向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>用于扩增含连接子C的供体DNA的反向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>用于扩增含连接子D的供体DNA的正向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>用于扩增含连接子E的供体DNA的反向引物</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATG</td>
			<td>用于扩增含连接子5的INT1 5'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-110</td>
			<td>AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC 
			TGGATATGCAAAGCGATTGGAA 
			GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC 
			ATTCC</td>
			<td>用于扩增含连接子5的INT1 5'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-111</td>
			<td>TTGCCCATCGAACGTACAAG 
			TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT 
			TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC 
			TTTG</td>
			<td>用于扩增含连接子A的INT1 3'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>用于扩增含连接子A的INT1 3'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>用于扩增含连接子B的INT2 5'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-114</td>
			<td>TGCTAAGATTTGTGTTCGTT 
			TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT 
			CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC 
			TGGTTG</td>
			<td>用于扩增含连接子B的INT2 5'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-115</td>
			<td>ACGCTTTCCGGCATCTTCCA 
			GACCACAGTATATCCATCCGCCT 
			CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG 
			GTGG</td>
			<td>用于扩增含连接子C的INT2 3'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATGACCGGG</td>
			<td>用于扩增含连接子C的INT2 3'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>用于扩增含连接子D的INT3 5'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-118</td>
			<td>GCGGAATATTGGCGGAACGG 
			ACACACGTGGATACAAACCTG 
			GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG 
			AAGAACG</td>
			<td>用于扩增含连接子D的INT3 5'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-119</td>
			<td>AAATAACCACAAACATCCTT 
			CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT 
			GTACCTGATGGGACGTCAGCACT 
			GTAC</td>
			<td>用于扩增含连接子E的INT3 3'端的正向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATTCATTC</td>
			<td>用于扩增含连接子E的INT3 3'端的反向引物</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 5'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTTACTTC</td>
			<td>用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 3'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 5'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 3'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 5'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 3'端的正向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 5'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>用于验证con5-crtE-conA整合至INT1 3'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 5'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>用于验证conB-crtYB-conC整合至INT2 3'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 5'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>用于验证conD-crtI-conE整合至INT3 3'端的反向引物</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>a. 加粗序列表示连接子序列。 
			b. 正向引物和反向引物分别标记为FW和RV。</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
补充表 2：引物序列。
<img alt="基因整合表，显示不同菌株中基因编辑的启动子、ORF和终止子细节" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="补充表3"> 
补充表3：构建菌株的设计。
<img alt="用于研究分析的整合侧翼DNA序列的DNA测序图谱，多重阵列。" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="补充表4"> 
补充表4：供体DNA表达盒及其侧翼区域的序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

CRISPR/Cas12a 系统结合单个 crRNA 阵列，可在多个位点同时实现对 S.&#160;cerevisiae 基因组的高效多重编辑。通过构建能够产生类胡萝卜素的酵母菌株，并进一步用于制作酵母像素艺术，验证了该方法的有效性。

CRISPR/Cas12a 对 Saccharomyces cerevisiae 的多重基因组编辑及酵母像素艺术的创建

高效率、易用性以及规律成簇间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统的多功能性……

本方案展示了一种新型的多重基因组编辑方法，通过在单次转化步骤中将多个表达盒引入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的不同基因位点，实现高效的多基因编辑。该无需克隆的质粒构建方法可表达单一crRNA阵列，从而建立一种快速、高效且灵活的基因组编辑流程。我们将对野生型酵母细胞进行改造，通过在基因组的空闲位点引入外源异源基因，使其能够产生类胡萝卜素。单个crRNA阵列由来自无RNA聚合酶启动子的游离单个crRNA表达而成。Cas12a在体内将crRNA阵列加工成单个crRNA。这些crRNA引导Cas12a靶向基因组DNA上的特定位点，Cas12a在该位点引入双链断裂。向下的DNA片段在体内重组并整合到基因组DNA中。演示该实验方案的是博士生Klaudia Ciurkot，助理科学家Jeffery van Wijk。以及来自我们实验室的高级副研究员 Brenda Vonk。在获得用于合成DNA多重基因组编辑实验的单个crRNA阵列后，配制PCR扩增混合液，并将该阵列放入热循环仪中进行扩增。通过电泳分析PCR产物时，将样品在0.8%琼脂糖凝胶上以5 V/cm的电压运行40分钟。使用DNA片段大小范围为100至10000个碱基对的DNA分子量标记。随后根据生产商说明书，利用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。进行酵母转化时，首先将野生型酵母接种于含有20 mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）培养基的100 mL三角瓶中进行预培养。在30摄氏度、250转/分钟条件下过夜培养。次日早晨，根据计算量取适量过夜预培养的酵母菌液，接种至20 mL新鲜YEPD培养基中。将培养物置于摇床培养箱中，直至在600纳米处测得的光密度达到1.0。通过离心收集酵母细胞。用20 mL室温去离子水洗涤酵母细胞沉淀，随后再次离心。将沉淀重悬于100微升醋酸锂Tris-EDTA溶液中，并将酵母转移至微量离心管中。取5微升单链载体DNA和1微克质粒pCSN067与酵母细胞悬液混合。然后加入600微升聚乙二醇LiAc-TE溶液与样品混合。将酵母细胞和质粒在台式加热模块中于30摄氏度、450转/分钟条件下孵育30分钟。孵育结束后，向转化溶液中加入70 µL二甲基亚砜并混匀。将混合物在42摄氏度水浴中热激15分钟。将混合物转移至15 mL圆底试管中。向试管中加入10 mL YEPD，在30摄氏度、250 rpm条件下过夜培养。次日早晨，通过离心收集转化后的细胞，并用移液器吸除上清液，仅保留最后200微升。将转化后的酵母细胞沉淀重悬于剩余的上清液中。取150微升转化混合物，以及剩余50微升转化混合物用YEPD稀释20倍后的样品各150微升，分别涂布于添加了0.2克/升G418的YEPD琼脂平板上。在30摄氏度培养48至72小时后，挑取单个转化子，重新划线接种至含有0.2 g/L G418的新YEPD琼脂平板上。对于第二次转化，将菌液培养至600纳米处的光密度值达到1.0，方法如前所述。取20微升菌液加入微量离心管中。离心后，将菌体沉淀重悬于100微升LiAc-TE溶液中，并加入单链DNA（ssDNA）。在另一个离心管中，加入一微克单个 crRNA 阵列、一微克用于 crRNA 阵列的线性化受体质粒、每种供体 DNA 各一微克以及每种侧翼区域各一微克。然后将 DNA 混合物转移至感受态酵母细胞管中，并按照第一次转化的操作完成第二次转化。次日早晨，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于少量上清液中。然后将150 µL转化混合物以及150 µL转化混合物在YEPD培养基中20倍稀释的样品，分别涂布于添加了0.2 g/L G418和0.2 g/L 诺尔斯苏菌素（nourseothricin）的YEPD琼脂平板上。在30°C培养48至72小时后，挑取单个有色转化子，在新的YEPD平板上重新划线，以获得单个有色菌落。为测定基因组编辑效率，统计转化平板上有色菌落与白色菌落的数量，将有色菌落数除以菌落总数。为制作酵母像素艺术图，将三种不同颜色的类胡萝卜素产生型S.cerevisiae菌株以及野生型CEN分别接种至装有100 mL YEPD培养基的500 mL摇瓶中进行培养。PK113-7D 菌株。将培养物在 30 摄氏度下振荡培养过夜，转速为 250 rpm。将每种过夜培养物各 0.5 mL 转移至含有 0.5 mL 无菌非离子密度梯度介质的单独试管中，每管对应一份培养物，并通过涡旋短暂混匀溶液。将细胞悬液分别转移至已验证的2×3储液槽中。使用带有流体校准设置6RES_AQ_GPSA2的csv文件，在声波液体处理仪上将每种酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株从相应的已验证储液槽源板中点样25纳升至含有50 mL YEPD琼脂的6144孔目标微孔板中。所有孔完成点样后，将微孔板在30°C条件下孵育48小时。为了增强菌株的颜色，将琼脂平板在 4 摄氏度下保存至少 72 小时。平板上出现了罗莎琳德·富兰克林（Rosalind Franklin）的图像。如所示，启动子、开放阅读框、终止子以及两个相邻的 50 bp 连接序列可通过 Golden Gate 克隆反应组装成一个表达盒，并通过 PCR 验证。通过 PCR 扩增单个 crRNA 阵列后，通过电泳确认受体质粒的单个 crRNA 阵列已被线性化。多重基因组编辑的效率可通过转化后有色菌落的百分比以及 PCR 分析结果来计算，后者用于确认供体 DNA 在目标基因组 DNA 位置的整合。例如，从罗莎琳德·富兰克林的黑白图像开始，创建了一个四色图像及点样列表，随后通过声波液体处理仪将四种不同的酵母菌株点样到琼脂微孔板上，如图所示，最终生成了该科学家的高分辨率酵母绘画图像。进行该转化时，应使用 freshly prepared 溶液和高质量的 DNA 片段。该方法还可用于将特定的缺失和点突变多重导入基因组 DNA 中。此外，也可开展 CRISPR 调控实验。该方法可进行改进，以在阵列中引入多于一种的游离crRNA，从而增加可同时进行的编辑数量。

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

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