用于质谱流式细胞术进行细胞周期特异性细胞蛋白表达分析的小鼠皮肤角质形成细胞的分离与染色

该方案具有两个主要意义：第一，它使研究人员能够确定从动物模型中分离的皮肤细胞的细胞周期状态；第二，它还使我们能够在细胞周期的不同阶段分析蛋白质的表达情况。

与以往测定细胞增殖的方法相比，我们的方法能够更精确地确定细胞周期中的不同阶段，并且还可以在细胞分裂的各个阶段分析超过40种不同的标志物。这显著提升了该方法的应用范围和灵活性。本方案可用于癌症研究，以及任何需要确定细胞周期特异性蛋白表达模式的其他疾病研究中。

此外，该方案可调整用于其他细胞类型及其他模式生物。初次使用者应专注于获得尽可能高质量的细胞制备。这需要及时处理实验皮肤样本，使用新鲜试剂，尽量缩短组织消化时间，并在离心后小心弃去上清液，以保持细胞的完整性和数量。

首先，按照文稿中的描述，使用免费的在线 panel 设计软件设计金属标记抗体 panel。然后，通过在 60 摄氏度下将 IdU 粉末溶解于 0.1 N 氢氧化钠溶液中，配制浓度为 10 毫克/毫升的 IdU 储存液。将 IdU 储存液分装至微量离心管后，于 -20 摄氏度冷冻保存，以用于长期储存。

使用前立即用12 N盐酸将IdU溶液的pH值调节至7.5，并取少量废弃等分试样用pH试纸检测，确保溶液pH为7.5。配制2×甲醛固定液时，将5毫升10×PBS与1毫升16% PFA及44毫升高纯度分子生物学级蒸馏水混合。配制100毫摩尔顺铂储备液时，将300.5毫克顺铂粉末溶解于10毫升DMSO中。

对于需要持续一天以上的实验，配制10毫摩尔的顺铂工作液。称量小鼠体重，然后确定每克体重给予0.1毫克IdU的剂量。通过腹腔注射给予计算剂量的IdU，并在注射后等待两小时，再收获细胞。

使用一把外科级剪刀，从先前在耳基部注射了IdU的安乐死小鼠身上手术切除耳朵。将耳朵放置在干燥的100毫米培养皿中。用精细镊子在切割区域的中部或边缘处创建一个囊腔，以仔细分离耳前侧与后侧皮肤，然后将两片皮肤瓣拉开，分别对前侧和后侧皮肤进行后续操作。

将一只耳朵的腹侧和背侧皮肤小心放入12孔培养板的一个孔中，每孔加入1毫升新鲜配制的dispase/collagenase溶液，使皮肤的真皮面接触溶液。在37°C下孵育1小时以消化皮肤。将消化后的耳部皮肤或新生小鼠皮肤置于干净的培养皿中，表皮面朝下接触培养皿表面。

使用镊子将皮肤展平，并从中心向边缘呈环形轻轻滑动，使真皮与表皮分离。用镊子夹住表皮边缘，轻柔地将其从培养皿表面剥离并提起。小心地将表皮放置于预热的细胞脱离溶液中，置于培养板的一个孔内。

在37摄氏度下孵育5分钟，或在室温下孵育20分钟。用无菌镊子夹住表皮，通过将表皮在培养皿底部拖动摩擦以解离细胞。加入1毫升含1% FBS的DMEM，通过40微米细胞筛网过滤至收集管中。

用额外的两毫升 DMEM 充分冲洗，并加入细胞悬液中。在 120 ×g 下离心五分钟，小心吸去上清液。用含 1% FBS 的一至二毫升 DMEM 重悬细胞沉淀，并按前述方法再次离心收集细胞。

为了标记细胞以区分活细胞和死细胞，将一百万至三百万个细胞重悬于含有25微摩尔顺铂的1毫升DMEM中，孵育1分钟。加入等体积胎牛血清（FBS）吹打混匀以终止反应。在120 × g离心5分钟后，将上清液倾倒至含有稀释漂白液的烧杯中，并将离心管倒置，使残留液体流至纸巾上。

将细胞沉淀重悬于2 mL不含钡阳离子的PBS中，然后按照先前所述方法再次离心。固定细胞时，将细胞沉淀重悬于1 mL不含钡阳离子的PBS中。在持续低功率涡旋振荡条件下，逐滴加入1 mL的2× PFA固定缓冲液。

置于摇床上，室温孵育10分钟。在500 × g条件下离心5分钟后，小心倾去上清液。用2 mL不含钡阳离子的PBS洗涤细胞，在相同条件下再次离心，并重复洗涤步骤。

最后，将沉淀重悬于2毫升无钡阳离子的PBS中。在500 × g条件下离心5分钟，小心弃去上清液。将细胞重悬于1毫升1×固定缓冲液中，在室温下孵育10分钟，然后重复离心步骤。

为了洗涤细胞，加入一毫升条形码通透缓冲液。在500 × g 离心五分钟的同时，向条形码中加入100微升条形码通透缓冲液并立即混匀。将细胞沉淀重悬于800微升条形码通透缓冲液中。

向细胞中加入条形码溶液，混匀，并在室温下孵育30分钟。在500 × g下离心5分钟。用2毫升细胞染色缓冲液洗涤细胞，再次离心。

接下来，将一百万至三百万个细胞重悬于1毫升核抗原染色缓冲液工作液中，在室温下孵育30分钟。在500 × g离心5分钟后，小心弃去上清液。将细胞重悬于1毫升核抗原染色透化缓冲液中，再次离心。

经过多次重悬和离心后，用残留液体轻轻涡旋重悬细胞沉淀。加入50 µL胞内抗体混合液，混匀，并在室温下孵育45分钟。加入2 mL细胞染色缓冲液。

再次以与上一步相同的条件离心，并弃去上清液。将沉淀重悬于2毫升细胞染色缓冲液中，在500 × g下离心5分钟，并重复重悬和离心步骤。将细胞重悬于1毫升嵌入溶液中，在4°C下保存1至3天。

再次离心细胞后，用 2 毫升细胞染色缓冲液洗涤沉淀，在相同条件下离心，并用 2 毫升水再进行两次洗涤，离心条件相同。用稀释的 EQ 微球溶液将细胞沉淀重悬至浓度为每毫升一百万个细胞，然后在质谱流式细胞仪上检测样品。测定成年小鼠耳部和新生小鼠皮肤组织的预期细胞得率和细胞活力。

产量的估算取决于皮肤的表面积。对于需要较大量细胞的实验，新生儿皮肤是更合适的选择。在对条形码标记的质谱流式数据进行标准化和去卷积处理后，用于筛选完整、单个且具有活性的细胞的基本设门策略如下所示。

活细胞百分比可能反映染色前细胞的质量或状态。图中还展示了培养的癌细胞与分离的小鼠耳部细胞之间在活力上的差异。活细胞根据事件长度与CD45的散点图进行设门，以排除造血细胞。

加入谱系标记物可实现对不同细胞周期阶段中目标细胞群体的筛选。通过基于荧光的流式细胞术检测BrdU与PI，可获得基本的细胞周期图谱。然而，在质谱流式细胞术中加入其他增殖标记物，能够更精确地鉴定细胞周期的各个阶段。

采用这种方法，可以针对不同细胞类型或实验条件构建细胞周期图谱，例如在同一实验中对 CD45 阴性与 CD45 阳性细胞的图谱进行比较。在另一个示例中，对定义 G1 期 EGFR 和 mTOR PI3K 信号通路的标志物进行分析，结果显示 CD45 阴性细胞（以橙色显示）与 CD45 阳性细胞（以蓝色显示）具有相似的表达图谱。质谱流式细胞术需要大量高质量的细胞。

如果用户对稀有细胞群体感兴趣，可能需要更多的细胞数量。分离得到的活细胞可用于DNA或RNA分析、生化研究，或在用于质谱流式细胞术的固定和染色前进行组织培养。在使用多聚甲醛、盐酸或氢氧化钠时，用户应根据需要使用个人防护装备和生物安全柜。