Name: 人类舱内单聚物研究病原体、共脉和宿主肠道上皮细胞之间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习将三维人源肠类器官转化为单层培养的方法，用于研究宿主-病原体相互作用及黏液生物学。该技术为炎症性肠病和微生物组研究提供了可操作的体外模型。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 P01 AI125181、K01 DK106323（JGI）和 K01 DK113043（JFA）。我们感谢美国马里兰州巴尔的摩市马里兰大学 James Kaper 提供大肠杆菌（E. coli）HS 菌株和肠出血性大肠杆菌（EHEC）。同时感谢约翰斯·霍普金斯大学 Conte 消化疾病基础与转化研究核心中心（P30 DK089502）的整合生理学与影像学核心设施以及约翰斯·霍普金斯大学质谱与蛋白质组学核心设施的支持。

本方案基于作者先前发表的研究6,7,14,15,16。以下步骤应在生物安全柜中采用正确的无菌技术进行操作。所有涉及人体样本的研究方法均已获得约翰斯·霍普金斯大学医学院机构审查委员会（IRB NA_00038329）的批准。
1. 用细胞外基质包被细胞培养插件
<ol>
	<li>在100 mM乙酸中配制5 mL胶原蛋白IV储备液（1 mg/mL）。于4 °C静置约4小时，使其充分水合/溶解。</li>
	<li>将胶原蛋白IV储备液分装后，保存于4 °C（≤1个月）或-20 °C（&#62;1个月）。</li>
	<li>包被前立即用无菌组织培养级水将胶原蛋白IV储备液稀释至终浓度为34 μg/mL。对于24孔板细胞培养小室，每孔小室加入100 μL溶液，相当于10 μg/cm2。</li>
	<li>将培养板置于标准CO2组织培养箱中，37 °C孵育≥2小时；或为方便起见，用石蜡膜密封板边缘后，于4 °C孵育过夜或最长1周。</li>
</ol>
2. 从三维培养物中分离肠类器官/结肠类器官
注意：类器官或结肠类器官由供体活检样本建立，并根据先前描述的标准方案在三维培养体系中维持培养14,18。简言之，通过螯合及机械振荡法从肠道活检或切除组织中分离隐窝结构。隐窝经洗涤、收集后接种于基底膜基质（BMM）中。向培养物中加入扩增培养基（见步骤4.2），每2天更换一次。接种后数小时内即可观察到三维结构的形成。
<ol>
	<li>从24孔板中吸除培养基，每孔加入1 mL预冷的收获液（见材料表）。</li>
	<li>使用小型细胞刮刀松动并打碎基底膜基质沉淀物，特别注意靠近孔边缘的物质。</li>
	<li>将板置于摇床中，在约200 rpm、4 °C条件下振荡30–45分钟。</li>
</ol>
3. 解离三维肠类器官/结肠类器官
<ol>
	<li>使用带有无菌滤芯吸头的P200单通道移液器或多通道移液器对细胞悬液进行吹打重悬。</li>
	<li>将细胞悬液汇集至一个15 mL锥形管中。若总悬液体积&#62;6 mL，则使用多个管。</li>
	<li>加入等体积含10 mM HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（1×）和青霉素-链霉素（1×）的Advanced DMEM/F12培养基（洗涤培养基）。轻轻颠倒混匀3–4次。在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟。
	<ol>
		<li>可选：吸除洗涤培养基，每孔加入0.5 mL胰蛋白酶（参见材料表）。用P200移液器重悬类器官，盖紧管盖后置于37 °C水浴中约2分钟。立即取出管子，加入洗涤培养基至终体积10 mL，并重复步骤3.3的离心操作。 
		注意：如果吹打无法获得大小均一的细胞团块，建议执行此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 接种类肠器官/类结肠器官悬液
<ol>
	<li>若包被的插入式培养小室储存于 4 °C，接种细胞前需在 37 °C、5% CO2 的组织培养孵箱中平衡至少 30 分钟。</li>
	<li>针对每个待接种的插入式培养小室，准备 1 mL 温热（25–37 °C 之间）的扩增培养基（EM），并加入 10 μM Y-27632 和 10 μM CHIR 99021。 
	注：EM 由以下成分组成：Advanced DMEM/F12 培养基，含 B27（1×）、50% WNT3A 条件培养基、15% RSPO1 条件培养基、10% Noggin 条件培养基、50 ng/mL 人 EGF、500 nM A-83-01、10 μM SB 202190、抗生素/抗真菌素混合液（1×）、10 mM HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（1×）和青霉素-链霉素（1×）（参见材料表）。</li>
	<li>吸除含有细胞沉淀的离心管中的洗涤液，并用足量 EM 重悬细胞，确保每插入式培养小室至少有 100 μL 细胞悬液。</li>
	<li>吸除每个插入式培养小室中的 IV 型胶原溶液，并用 150 μL 洗涤液/小室洗涤两次。</li>
	<li>向每个插入式培养小室下方空间加入 600 μL EM。</li>
	<li>向每个插入式培养小室中加入 100 μL 细胞悬液。</li>
	<li>将培养板放回组织培养孵箱，静置至少 12 小时。 
	注：避免振荡或剧烈倾斜培养板，以防结肠类器官片段在插入式培养小室膜上分布不均。</li>
	<li>将培养板置于相差显微镜下，使用 2.5×–10× 物镜观察细胞贴壁与铺展情况，直至形成融合的单层细胞。</li>
	<li>接种后 1–2 天，大多数片段应已黏附于胶原基质。此时更换培养基，并停止使用 Y-27632 和 CHIR 99021。此后每 2–3 天更换一次培养基，直至细胞融合。通常在 7–10 天内达到融合状态。</li>
</ol>
5. 测量跨上皮电阻
<ol>
	<li>连接电极导线并打开上皮细胞伏特-欧姆计（EVOM）电源。确认测量功能已设置为欧姆（ohms）。</li>
	<li>将电极尖端短暂浸入70%乙醇中，然后用实验室纸巾擦干。将电极置于5 mL洗涤培养基中平衡约5分钟。</li>
	<li>将较短的电极尖端浸入小室内的培养基中，较长的电极尖端插入下层孔板的培养基中。保持电极完全垂直，直至EVOM读数相对稳定，或不超过60秒。 
	注意：若电极组件严重偏离垂直方向，或电极尖端高度调节不当，较短的尖端可能接触并破坏细胞单层。</li>
	<li>将EVOM测量值与浸没在培养基中无细胞的小室所获得的数值进行比较，以评估细胞融合或分化进展情况。</li>
</ol>
6. 汇合的肠类器官/结肠类器官单层细胞的分化
<ol>
	<li>将培养基从 EM 更换为分化培养基（DM），之后每两天更换一次培养基，直至第 5 天。DM 是指不含 WNT3A、RSPO1、A-83-01 和 SB 202190 的 EM 培养基。</li>
	<li>持续监测跨上皮电阻（TER），以确认分化过程按预期进行。在分化第 1 至第 5 天期间，TER 将持续上升。单层细胞在第 5–6 天后可能继续增加 TER 并保持活力，但在第 5–6 天使用时可获得最显著且最可重复的实验结果。</li>
</ol>
7. 使用共生性或致病性 E. coli 进行细菌感染
<ol>
	<li>进行感染实验前一天，使用不含抗生素的EM或DM洗涤并喂养单层细胞。</li>
	<li>用无菌微生物接种环轻轻刮取冷冻保存的细菌甘油菌种表面，接种至2 mL LB液体培养基中，将试管置于37 °C摇床培养箱中培养12–16小时。</li>
	<li>取50 μL初始培养物加入5 mL新鲜LB液体培养基中（1:100稀释），继续在摇床中培养90分钟。此步骤将获得对数生长期的菌液，浓度为105–106菌落形成单位（cfu）/mL。
	<ol>
		<li>可选：使用分光光度计在600 nm波长处测定光密度（OD600）以确认细菌浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细菌培养物在12,000 × g离心10分钟，弃上清液，用不含抗生素的EM或DM重悬细菌，调整终浓度为107 cfu/mL。</li>
	<li>向插入式培养小室中加入10 μL细菌悬液（终浓度为106 cfu/mL）。用移液器缓慢吹打混匀，避免扰动细胞外黏液层。</li>
	<li>将培养板放回组织培养箱中，进行所需时间的感染孵育。</li>
</ol>
8. 固定以保存和免疫染色黏液
<ol>
	<li>从24孔板中取出细胞培养小室，小心地将其倒置在实验室纸巾上以去除顶端培养基，并擦去附着在小室外壁的液体。</li>
	<li>在新的24孔板中，将小室浸入由冰醋酸与无水乙醇按1:3比例配制的Clarke固定液中，在室温下固定10分钟。</li>
	<li>将小室倒置以去除固定液，并在1×PBS中重新水化细胞10分钟。随后按照标准免疫染色流程进行操作。</li>
	<li>使用剃刀刀片沿小室膜的边缘切割，用镊子将膜转移至玻璃显微镜载玻片上，并用封片剂固定盖玻片。</li>
</ol>
9. 免疫印迹用细胞裂解物的制备
注意：以下步骤需在冰上或低温环境中进行。
<ol>
	<li>吸弃培养基，用 PBS 清洗小室一次。</li>
	<li>向小室中加入 150 μL 含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（见材料表），静置 5–10 分钟。裂解缓冲液包含：50 mM Tris（pH 8）、150 mM NaCl、1% IGEPAL CA-630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和 1:100 的蛋白酶抑制剂混合物。</li>
	<li>使用小型细胞刮刀将细胞从小室上刮下，然后用 P200 移液器轻轻吹打悬浮液数次，并转移至微量离心管中。</li>
	<li>使用微探头超声仪以 20% 振幅进行 5 次、每次 1 秒的脉冲超声处理（参见材料表）。</li>
	<li>若立即进行电泳，则加入 SDS-PAGE 上样缓冲液；否则将裂解物分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功形成肠类器官/结肠类器官单层的关键参数包括：1）以健康且处于增殖状态的三维培养物作为起始材料；2）在接种单层细胞前，用人类胶原蛋白IV型包被细胞培养小室表面；3）通过机械或酶消化方法将三维培养物进行碎片化处理，但不应解离至单细胞水平。
在分离三维肠类器官/结肠类器官时，最佳振荡速度可能因特定振荡仪的旋转直径不同而有所变化。目的是不仅要充分振荡培养板以实现有效混匀，还要避免细胞悬液溅到培养板盖上或邻近孔中。孵育时间短于&#60;30分钟可能导致细胞表面残留较多的基质胶（BMM），这会影响细胞在插入式培养小室上贴附并形成均一的单层细胞。过长的孵育时间（≥1小时）将显著降低细胞活力。
将三维肠类器官/结肠类器官解离所需的吹打程度可能因移液器活塞的硬度和操作者的熟练程度而异。建议在吹打过程中定期使用相差显微镜观察孔内内容物，以评估碎片的均一性，目标为每个碎片约含30个细胞。除了或替代吹打操作，也可用胰蛋白酶对悬液进行短时间消化，以获得更小且均一的碎片。如果单层中存在大量类似三维结构的区域，则胰酶消化可能更为合适。然而，不建议将类器官完全解离为单细胞，因为这会显著降低细胞活力。通常情况下，一个在35 μL基质胶微滴中培养的肠类器官/结肠类器官孔足以接种2–3个Transwell小室，但具体数量还取决于类器官/结肠类器官的数量及其平均大小。
随着类结肠体单层细胞的分化，其可能吸收大量顶侧培养基。可通过向插入式培养皿的上层添加额外的DM培养基（150–200 μL）来避免此问题，尽管上层培养室部分干燥似乎不会对后续实验中单层细胞的存活率或功能产生不利影响。分化约4–5天后，类结肠体单层细胞会形成细胞表面可见的胞外黏液，在小心吸除DM培养基后，可观察到细胞表面存在较厚或凝胶状物质。
对于肠出血性大肠杆菌与外层黏液层的相互作用，我们常规使用本方案中指定的细菌滴度和孵育时间。然而，对于独特的细菌菌株，应首先在多种浓度和孵育时间条件下进行检测，以确定达到预期效果的合适参数。
在黏液固定过程中，吸除顶端培养基可能会带走大部分细胞外未附着的黏液层。因此，需小心倾倒培养基。若因表面张力导致培养基残留在小室中，可用折叠的实验纸巾一角破坏表面张力，并吸走大部分培养基。固定和染色后，在将盖玻片覆盖于小室滤膜上时，可能会无意中使黏液层脱落或压平。为保持黏液层的高度，应将滤膜置于一滴封片剂液滴上，再小心地将盖玻片盖在滤膜上。切勿敲击或按压盖玻片，以免显著压平黏液层。
为了从三维培养的细胞形成极化单层，必须重现肠上皮细胞基底外侧膜整合素与细胞外基质（ECM）蛋白之间的相互作用。层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白以及多种蛋白聚糖构成了肠上皮的细胞外基质21,22。我们比较了人源细胞来源的层粘连蛋白、纤连蛋白、IV型胶原以及小鼠来源的基底膜基质（BMM）作为插入式培养小室的包被材料。只有IV型胶原能够支持稳定、长期（长达4周）融合的类肠体/类结肠体单层的形成（图1-2）。在其他每种测试基质上仅获得小片状类似单层的生长区域，但这些区域未能进展至完全融合。使用人源IV型胶原作为ECM替代物具有多项优势。来源于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞的BMM并非人源，而人源IV型胶原可商业化获取，且通常更具成本效益。此外，BMM是成分复杂的蛋白质混合物，存在固有的批次间差异，并可能含有肉瘤细胞分泌的生长因子，从而影响基因表达23。
肠上皮细胞与下方细胞外基质（ECM）在肠上皮修复过程中的相互作用仍未完全阐明。已有研究提示，IV型胶原而非层粘连蛋白，可作为人结肠上皮细胞的黏附配体24，并促进肠隐窝上皮细胞的修复25，该结论基于抗IV型胶原抗体可抑制细胞黏附的实验结果得出。上皮细胞表达的β1-整合素似乎在ECM相互作用中具有重要作用，因为特异性针对β1-整合素的抗体可显著阻断结肠上皮细胞与IV型胶原的黏附24。尽管IV型胶原可作为类器官/结肠类器官单层培养中可靠的ECM基质，但在此模型中，上皮细胞随时间对ECM的重塑作用尚未被评估，更复杂的、由IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白组成的明确定义的ECM混合物的影响也尚未研究。
以单层形式培养的人源肠类器官/结肠类器官（图1-4）可实现对微生物或小分子的操控与取样，而这些操作在三维基质包埋的类器官培养体系中往往繁琐甚至无法完成。三维肠类器官/结肠类器官在大小、结构复杂性及腔内容积方面存在较大变异，因此对微生物或小分子进行显微注射时难以实现精确的定量。此外，与单层培养相比（表1），三维培养体系无法直接接触腔面和基底外侧表面，从而难以检测与生理或病理生理过程相关的离子、营养物质、细胞因子或分泌性因子。融合度（图1-2）是肠类器官/结肠类器官单层培养的关键特性之一，不仅对于建立营养物质、离子及其他大分子的生理浓度梯度至关重要16，而且有助于在腔内微生物群与无菌的、富含间充质细胞/免疫细胞的浆膜环境之间形成有效的屏障。在今后的研究中，若需将肠类器官/结肠类器官单层与间充质细胞、免疫细胞或神经元细胞共培养以构建更复杂的生理模型，上述因素均需予以充分考虑。
本文所述细胞培养小室模型的已知局限性包括缺乏流体剪切应力和机械拉伸/压缩（蠕动）等物理力，以及缺少肠道上皮在体内通常所处的厌氧性顶侧环境。这些因素有可能通过更复杂的微生理系统加以解决26，但其实现也需要额外的成本、设备和技术专长。无论是三维培养还是单层培养，除非特意添加相关组分，否则均不存在与肠道微生物组、间质细胞群体以及免疫系统的相互作用或贡献。
在胶原蛋白IV包被的细胞培养小室上培养的肠类器官/结肠类器官单层细胞，未来可应用于其他病原性或共生微生物相互作用、药物或营养吸收、毒性、代谢、屏障功能以及通过与其他肠道细胞类型共培养所介导的功能增强等方面的研究。不仅可利用健康供体的肠上皮进行评估，也可利用携带基因突变或患有肠道疾病个体的组织进行研究，前提是这些个体的体内表型已被证实可在体外肠类器官/结肠类器官培养中得以保留。

肠类器官、小肠类器官和结肠类器官在理解干细胞行为、肠道发育、屏障/转运功能以及细胞分化方面已取得诸多进展。1 然而，三维培养限制了对宿主上皮-病原体相互作用的研究，因为除非对封闭结构进行显微注射，否则细菌或毒力因子无法直接进入腔内。2,3 此外，从三维培养体系中难以有效采集分泌物（如小分子、蛋白质或黏液）用于后续分析。在三维培养中，已利用荧光染料和延时显微镜评估病原体对上皮屏障功能4和离子转运5的影响，但在可渗透的组织培养支持物上生长的单层细胞更适合采用其他技术，例如跨上皮电阻（TER）测量和Ussing chamber/电压钳记录技术。6,7
已有大量文献描述了类肠体/类结肠体的二维或单层培养方案。已发现可促进上皮细胞贴附的材料包括胶原蛋白水凝胶8,9、0.1% 明胶10、薄层小鼠肉瘤来源的基底膜基质（BMM）11,12,13以及人源胶原蛋白IV6,7,14,15,16,17。接种方法包括通过移液进行机械性破碎6,14,15，以及使用胰蛋白酶10,11、中性蛋白酶13或EDTA9解离细胞间黏附因子。少数方案使用非多孔组织培养塑料器皿进行接种，但这会限制基底外侧的接触，因此大多数应用依赖于可渗透的组织培养小室。关于稳定融合单层形成及维持的文献记录在不同研究之间差异较大。此外，不同研究团队所采用的人源类器官培养和分化培养基成分各不相同，并随着越来越多研究人员根据自身实验需求和可用资源对方法进行调整而持续发展。
为解决三维肠道上皮培养在宿主-病原体相互作用研究中的局限性，我们提出了一种改进的方案，可将三维人源肠类器官或结肠类器官转化为单层培养。当类器官在类似隐窝的未成熟状态下达到汇合后，撤除生长因子WNT3A、RSPO1以及抑制剂A-83-01和SB 202190，可诱导其分化为类似于小肠绒毛或结肠表面上皮的表型。我们介绍了理想的基质——人Ⅳ型胶原，用于包被培养小室插入膜，以获得均匀的肠类器官或结肠类器官片段用于接种。我们证明，该方案可形成具有高跨上皮电阻（TER）的汇合单层。结肠类器官单层可分泌一层致密的顶端黏液层，从而可通过免疫印迹或免疫染色开展病原体-黏液相互作用的离体（ex vivo）研究。本文还描述了一种改良的固定程序，以在免疫染色过程中保持结肠黏液层的完整性。该方法旨在提供一个可操作的模型，用于研究感染初期肠道宿主与病原体之间的最早期相互作用。

<table><tbody><tr><td>2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇</td><td>Sigma</td><td>T4661</td><td>Tris 碱，裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>ALK4/5/7 抑制剂</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>生长培养基组分</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>F-肌动蛋白荧光探针</td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂混合液</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td>Primocin (100x)</td></tr><tr><td>B27, 50x</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>生长培养基组分</td></tr><tr><td>细胞培养小室</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Transwell，PET 膜，0.4 &amp;mu;m 孔径，24 孔板</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>GSK3&amp;beta; 抑制剂</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原蛋白，来源于人胎盘</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 类器官收获溶液</td><td>Trevigen</td><td>3700-100-01</td><td>降解基底膜基质</td></tr><tr><td>肠出血性 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; (EHEC)</td><td>Kaper 实验室，马里兰大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特计</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特计电极</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 菌株 HS</td><td>Kaper 实验室，马里兰大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 封片剂</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td>用于将小室膜固定在显微镜载玻片上</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，200 mM</td></tr><tr><td>HEK293T/Noggin-Fc 细胞系</td><td>van den Brink 实验室，Tytgat 肝脏与肠道研究研究所</td><td></td><td>用于制备 Noggin 条件培养基</td></tr><tr><td>HEK293T/RSPO1-Fc-HA 细胞系</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td>用于制备 R-脊椎蛋白-1 条件培养基</td></tr><tr><td>HEPES，1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>生长培养基组分</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>荧光核染料</td></tr><tr><td>人表皮生长因子 (EGF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td>生长培养基组分</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>倒置细胞培养光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX51</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>L-WNT3A 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td>用于制备 Wnt3a 条件培养基</td></tr><tr><td>Matrigel，生长因子减少型</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>用于三维培养的基底膜基质</td></tr><tr><td>小型细胞刮刀</td><td>United BioSystems</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>MUC2 抗体，小鼠单克隆</td><td>Abcam</td><td>ab11197</td><td>免疫染色使用 1:100，免疫印迹使用 1:500</td></tr><tr><td>MUC2 shRNA 慢病毒颗粒</td><td>GE Dharmacon</td><td>RHS4531</td><td>GIPZ 慢病毒 shRNA，ID: 4583</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Grant Instruments</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>生长培养基组分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-031</td><td></td></tr><tr><td>带微探头的超声破碎仪</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>Tocris</td><td>1264</td><td>p38 MAPK 抑制剂</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>TrypLE Express，1x</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>胰蛋白酶，用于消化肠类器官/结肠类器官片段</td></tr><tr><td>连环蛋白抗体，兔单克隆</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td>免疫印迹使用 1:1000</td></tr><tr><td>水，组织培养级，无菌过滤</td><td>Corning</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>RhoA/ROCK 抑制剂</td></tr></tbody></table>

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

源自隐窝基底部干细胞的人源三维（3D）肠类器官或结肠类器官培养体系目前是最先进的 离体 肠道上皮的模型。由于三维培养物具有封闭的结构和显著的细胞外基质支持，因此并不适合用于宿主-病原体相互作用的研究。类肠体或类结肠体可在可渗透的组织培养膜上生长为上皮单层，从而允许对管腔侧和基底侧细胞表面及其相应液体环境进行操作。这种增强的管腔表面可及性有助于模拟细菌与宿主上皮之间的相互作用，例如肠出血性大肠杆菌降解黏液的能力 E. coli （EHEC）在结肠上皮上的作用。本文描述了一种用于三维培养物破碎、单层接种以及跨上皮电阻（TER）测量的方法，以监测细胞达到融合和分化的过程。结肠类器官单层分化后可分泌黏液，可通过免疫荧光或免疫印迹技术进行研究。更广泛而言，肠类器官或结肠类器官单层培养为评估病原性或共生微生物群可能靶向的特定细胞群体提供了一个具有生理相关性的研究平台。

人源肠类器官和结肠类器官以三维结构培养，随后解离并切割成小片段，接种于人胶原蛋白IV包被的细胞培养小室中。单层细胞的形成过程可通过明场显微镜每日观察，并结合免疫荧光染色（图1）以及跨上皮电阻（TER）的持续升高（图2）进行监测，TER的变化反映了紧密连接对离子的通透性，并与单层细胞的融合程度相关。空置的24孔培养小室的TER值约为50–100 Ω·cm2，当细胞融合后TER上升至约400–500 Ω·cm2。融合单层中的所有上皮细胞均通过连接复合体相互连接，该结构可在细胞周边由F-肌动蛋白环显示（图1）。在含完全生长因子的培养基中，单层细胞呈现增殖性的隐窝样上皮特征，主要由活跃分裂的细胞组成，这些细胞可掺入核苷类似物EdU（图2）。撤除生长因子WNT3A和RSPO1可促进细胞分化，形成类似绒毛结构的培养物，其中不含增殖细胞。分化后的单层细胞包含肠吸收细胞（肠类器官）或结肠细胞（结肠类器官），并可发育出特化的肠道上皮细胞类型，这已在三维培养中得到证实18，包括杯状细胞和肠内分泌细胞15。分化后的单层细胞还表现出TER显著升高（> 1000 Ω·cm2）（图2），表明其紧密连接已成熟。
在正常的人体生理条件下，肠上皮层将营养物质和富含微生物的管腔空间与无菌的浆膜环境分隔开来。上皮层严格调控这两个区室之间的相互作用。类肠体和类结肠体单层细胞保留了这一重要的区室化特性，如表1中的蛋白质组学分析所示。从分化后的类肠体单层细胞收集的顶端和基底外侧条件培养基在蛋白质组成上存在显著差异。可同时获取顶端和基底外侧两侧的培养环境，从而能够以时间依赖的方式分别收集两种上清液，用于检测其他分子（如细胞因子和趋化因子）的差异性分泌情况。15，17
单层细胞是一种便捷且高度可重复的模型，可用于通过免疫印迹和免疫染色检测蛋白质表达的变化。因此，利用这两种技术均可检测到通过shRNA敲低（KD）引起的黏蛋白2（MUC2）表达变化（图3）。shRNA转导在三维结肠类器官中进行，并在含抗生素的筛选培养基中维持培养。在确认敲低效果后，结肠类器官可长期维持为三维培养物，和/或铺板为单层细胞用于实验研究。此外，与野生型亲本结肠类器官系相比，MUC2敲低并不影响单层细胞形成的效率。用于免疫印迹的单层细胞收集操作简便，类似于人上皮腺癌来源细胞系所采用的方案。通常，从一个0.33 cm2培养小室中培养的单层细胞可提取约50 µg或更多的总蛋白。如图3所示，MUC2在未分化（UD）野生型结肠类器官单层细胞中几乎无法检测到，但在分化后（DF）的野生型单层细胞中表达水平显著升高。而在转导了MUC2 shRNA的未分化和分化结肠类器官单层细胞中，MUC2表达均低于检测限。
重要的是，单层细胞是研究上皮细胞顶面宿主-微生物相互作用的合适模型。结肠类器官单层细胞在分化后会形成一层厚的、MUC2 阳性的附着黏液层，该黏液层不易被共生性 E. coli HS 菌穿透（图 4），这与在正常人结肠中所观察到的情况相似。19 然而，肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli，EHEC）作为一种人类结肠病原菌，已被证明能够破坏富含 MUC2 的附着黏液层，从而到达上皮细胞的顶面（图 4）。14,20 此时，残留的 MUC2 仅存在于杯状细胞内部。
<img alt="显微镜图像中的细胞结构和F-actin结构；细胞核为蓝色，F-actin为绿色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1： 人源肠类器官/结肠类器官单层培养的建立。 （A） BMM溶解并吹打后结肠类器官片段的示例。（B） 结肠类器官片段接种后插入物的示例。比例尺（A-B）= 200 μm。代表性（C）最大强度投影和（D）共聚焦光学Z切片及其对应的正交投影显示，接种于人源IV型胶原包被滤膜上的结肠类器官片段在接种后2-4天形成多个单层岛状结构。在C和D中，无细胞区域（星号）表现为缺乏细胞核染色（Hoechst 33342，蓝色）和顶端F-actin染色（鬼笔环肽，绿色）。代表性（E）最大强度投影和（F）共聚焦光学切片及其对应的正交投影显示，接种约1周后，结肠类器官单层融合，通过F-actin免疫荧光染色可检测到连续的顶端表面。（G）代表性最大强度投影的高倍放大图像和（H）共聚焦光学切片及其对应的正交投影显示，在融合的结肠类器官单层中，细胞形成F-actin周连接环（白色箭头）和不成熟的顶端刷状缘（黄色箭头）。比例尺（C-H）= 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞增殖分析：EdU染色（细胞核，EdU），TER曲线图，横截面（细胞核，F-肌动蛋白）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小肠类器官/结肠类器官单层细胞分化的评估。（A） EdU（红色）掺入显示在空肠单层细胞分化过程中增殖能力逐步下降。（B） 在扩增或分化培养基中汇合的空肠单层细胞的平均TER测量值。误差条表示标准误（SEM）。UD，未分化；DF，已分化。数字对应于特定条件下的培养天数；UD1为达到汇合的第一天，约在接种后1周。（C） 与分化第5天（DF day 5）的空肠单层细胞相比，UD空肠单层细胞具有更宽、更短的细胞形态，且顶端肌动蛋白构成的刷状缘发育较不成熟。比例尺（A, C）= 50 μm。所有单层细胞均在接种后至少1周时进行观察，且在开始分化前已达到汇合状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="MUC2在野生型与敲低型中的共聚焦显微镜图像，以及显示蛋白质大小的SDS-PAGE凝胶电泳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3： 野生型结肠类器官与经shRNA转导的敲低（KD）结肠类器官均能形成汇合的单层结构。 （A） 分化5天的野生型（WT）人类汇合结肠类器官单层的代表性图像，以及（B） 来源于MUC2敲低（KD）结肠类器官培养物的类似生长的单层结构。比例尺（A–B）= 50 μm。（C） 经转导表达乱序shRNA或MUC2 shRNA的结肠类器官培养物的代表性免疫印迹结果表明，敲低引起的蛋白表达变化可通过免疫印迹进行定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MUC2、大肠杆菌、EHEC抗原的共聚焦显微镜图像；上皮细胞中MUC2强度的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：类肠体/类结肠体单层培养模型适用于研究管腔微生物与宿主之间的相互作用。 (A) 人类类结肠体单层培养的代表性最大强度投影与正交光学切面显示，其顶端存在较厚的MUC2阳性黏液层，该黏液层可阻止E. coli HS（黑色箭头）穿透，细菌仅停留在黏液层表面。该单层培养模型以106 cfu/mL浓度的HS菌株感染6小时。 (B) 人类类结肠体单层培养在顶端接种肠出血性大肠杆菌（EHEC，106 cfu/mL，6小时）后的代表性最大强度投影图像。比例尺（A-B）= 50 μm。 (C) MUC2免疫荧光强度检测结果显示，与未感染对照组相比，EHEC感染的类结肠体单层培养中MUC2表达显著降低。误差线表示标准误（SEM）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>蛋白</td>
			<td>登录号</td>
			<td>肽丰度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基底外侧培养基</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝型脂肪酸结合蛋白 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001434.1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前纤维蛋白-1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_005013.1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>载脂蛋白A-IV前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_000473.2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞外ADP-核糖基转移酶4前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_066549.2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工型1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002037.2 (+1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血清转铁蛋白前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001054.1 (+1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素D结合蛋白同工型3前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过氧化氢酶 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001743.1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚集蛋白同工型1前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_940978.2 (+1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乳转铁蛋白同工型1前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002334.2 (+1)</td>
			<td>262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>顶侧培养基</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三叶因子3前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_003217.3</td>
			<td>326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三叶因子1前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_003216.1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白同工型a前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丝束蛋白B同工型1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三叶因子2前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_005414.1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>恶性脑肿瘤缺失蛋白1同工型b前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_015568.2 (+3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>角蛋白，II型细胞骨架1 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_006112.3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌球蛋白-9 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_002464.1</td>
			<td>150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氨基肽酶N前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_001141.2 (+1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚集蛋白前体 [Homo sapiens]</td>
			<td>NP_940978.2 (+1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 通过液相色谱/串联质谱法在分化的空肠单层细胞顶侧和基底侧液体样本中鉴定出的部分肽段列表。

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。

源自隐窝基底部干细胞的人类三维（3D）肠类器官或结肠类器官培养体系，目前是最先进的肠道体外模型……

3D肠道类器官培养限制了宿主上皮与病原体相互作用的研究，因为细菌或毒力因子无法直接进入类器官腔。此外，从小分子、蛋白质到黏液等分泌物质均难以从3D培养体系中便捷地采集，用于后续分析。为克服这些局限，本文介绍了一种改良方案，可将3D人源肠类器官或结肠类器官转化为单层培养。结肠类器官单层细胞分泌一层致密的顶端黏液层，可用于病原体与黏液相互作用的离体研究。该方法旨在提供一种可操作的模型，以研究感染初期肠道宿主与病原体之间的最早期相互作用。结肠类器官单层细胞将为研究黏液生物学提供一种新途径，而黏液生物学在宿主-病原体相互作用、微生物组研究以及炎症性肠病中具有重要意义。该方法可应用于其他分泌黏液的器官，例如上消化道、呼吸系统和女性生殖系统。通过可视化演示，帮助使用者掌握在单层细胞生长期间以及免疫染色固定过程中黏液的保存操作。本实验操作将由本实验室的科研人员 Karol Dokladny 进行示范。孵育包被的细胞培养物后，从24孔板中吸除培养基，并向每孔加入1毫升冰冻收获液。使用小型细胞刮刀松动并打碎基底膜基质沉淀物。特别注意靠近孔边缘的任何物质。然后，在4°C条件下，将培养板置于摇床中以约200转/分钟的速度振荡30至45分钟。使用配有无菌滤芯吸头的P200单通道移液器吹打重悬细胞。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。如果总悬浮体积超过六毫升，请使用多个小瓶。然后，向小瓶中加入等体积的含10毫摩尔HEPES、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和青霉素-链霉素的Advanced DMEM/F12培养基。此即洗涤培养基。将小瓶倒置三到四次以混匀。在4°C条件下，以300 × g离心10分钟。细胞铺板前，将包被的插入式培养小室置于组织培养孵育箱中平衡至少30分钟。对于每个待铺板的插入物，将1毫升扩增培养基置于37摄氏度水浴中预热，并加入两种抑制剂。然后将混合物加入孔板中。吸除含有细胞沉淀的管中的洗涤培养基，更换为足量的扩增培养基，确保每个插入物至少含有100微升，并重悬细胞。然后，从每个小室中吸除胶原蛋白IV溶液，并用洗涤液每孔150微升洗涤两次。向每个小室下方的空间加入600微升扩增培养基。将冻存管中的细胞悬液用移液器吸取100微升加入每个小室中。将培养板放回组织培养孵育箱中，静置至少12小时，避免振荡或剧烈倾斜培养板。孵育后，将培养板置于配备2.5倍至10倍物镜的相差光学显微镜上。用不含抑制剂的培养基更换培养液，以终止抑制处理。每隔两到三天继续更换一次培养基，直至细胞融合。使用尖头镊子从24孔板中取出细胞培养插件。小心地将插入物倒置在实验室用纸巾上，以去除顶端培养基，并擦去附着在插入物外表面的液体。在新的24孔板中，将插入物浸入冰醋酸与无水乙醇按1:3比例配制的溶液中，室温下固定10分钟。随后，在实验台面上将插入物倒置放在纸巾上，以去除固定液。将插入物放入盛有1×PBS的塑料容器中，孵育10分钟以重悬细胞，随后进行标准免疫染色操作。如需保存，使用剃刀刀片沿插入膜边缘切割，用镊子将膜转移至玻璃显微镜载片上。然后加入封片剂并加盖盖玻片。本实验中，人源肠类器官和结肠类器官以三维结构培养，随后解离并片段化，接种于人胶原蛋白IV包被的细胞培养小室中。通过明场显微镜观察和免疫荧光染色，每日监测单层细胞的形成进程。接种于人胶原蛋白IV包被的滤膜上的结肠类器官片段，在接种后两到四天内形成多层单层样岛状结构。通过最大强度投影和共聚焦光学Z轴切片及其相应的正交投影显示，无细胞区域表现为核染色和顶端F-肌动蛋白染色均缺失。接种约一周后，通过F-肌动蛋白免疫荧光染色可检测到具有连续顶端表面的融合结肠类器官单层。代表性最大强度投影和共聚焦光学切片的高倍放大图像及其相应的正交投影显示，汇合的结肠类器官单层细胞形成F-肌动蛋白周连接环以及不成熟的顶膜刷状缘。EdU掺入实验表明，在空肠单层细胞分化过程中，细胞增殖能力逐步下降。与分化五天后的空肠单层细胞相比，未分化的空肠单层细胞形态更宽、更短，其顶膜基于肌动蛋白的刷状缘也更不成熟。将类结肠体进行碎片化处理至关重要。如果碎片过大，则无法附着于包被滤膜上，反而会重新形成三维类结肠体。我们提出了一种改进方法，用于在类结肠体单层细胞上研究黏液生物学。可以开展其他宿主-病原体研究，以观察病原体与肠道顶膜表面之间的相互作用。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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来源：In, J. G.,等. 利用人类结肠类器官单层培养研究病原体、共生菌与宿主肠上皮之间的相互作用. J. Vis. Exp.

生成具有屏障功能的人类结肠类器官单层以研究宿主-病原体相互作用

的 离体 器官培养可在完整组织结构的背景下研究生物学过程。本文介绍一种方法 离体 小鼠结肠的培养，可用于研究肠道内的固有免疫和抗菌宿主防御。...

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从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

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利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

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使用志贺氏菌进行上皮细胞感染分析

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利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

学习将三维人源肠类器官转化为单层培养的方法，用于研究宿主-病原体相互作用及黏液生物学。该技术为炎症性肠病和微生物组研究提供了可操作的体外模型。

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

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