人诱导多能干细胞体外生成体细胞衍生物的研究

我们在这里提出了一个方案, 分化为每个体细胞衍生物 (肌细胞, 硬化体, 皮肤和合成) 在化学定义的条件下, 这在未来的疾病建模和骨科手术中基于细胞的治疗。

诱导多能干细胞（iPSC）中索米特衍生物的诱导是将多能干细胞用于再生治疗或疾病研究应用的关键步骤。该技术可用于在化学定义的条件下将人类 iPS 细胞分化成佐铁矿衍生物，如肌蛋白、皮肤病、丝皮和合成细胞。使用从患有难以治疗的肌肉骨骼疾病的患者建立的 iPSC，此方法可用于建模疾病的表型和测试新的药物治疗。

这种方法还可以用于增进我们对生物学的理解，以及人类胚胎形成过程中副中皮形成的基础机制。在开始预分质间皮诱导前四天，在10厘米的培养皿上涂上4毫升的细胞外基质溶液，在4摄氏度下进行夜间孵育。第二天早上，用8毫升无进料细胞培养基代替细胞外基质溶液。

要开始无喂食的培养，请用PBS清洗人类 iPSC 培养，并在培养皿中加入一毫升 CTK 溶液。当细胞开始与培养皿底部分离时，用新鲜的PBS清洗培养素两次，以完全去除所有SNL进纸细胞，然后再向培养皿中加入一毫升无喂食细胞培养。使用细胞刮刀手动分离干细胞，将细胞转移到15毫升锥形管中。

用1000微升移液器尖端轻轻移液细胞溶液三次，将细胞转移到细胞外基质涂层培养皿中。然后，将细胞返回到细胞培养箱三天。孵育结束时，用8毫升的先入质中皮诱导培养基代替无馈剂细胞培养基，并在未来四天内在细胞培养箱中启动前血间膜分化，在第三天改变培养基。

在孵化结束时，通过流式细胞学分离三角洲样蛋白1阳性细胞，通过离心收集分段细胞。将颗粒重新放入一毫升的苏米间代诱导介质中进行计数，将1倍10至第五细胞放入每个井中，将含有1毫升的间子体诱导介质的细胞外基质溶液涂层的12井板，并辅以10微摩尔的rhho激酶，或 ROCK，抑制剂Y-27632。然后，将细胞返回细胞培养箱四天，改变培养物第一天和三天不含抑制剂的培养物。

要与丝状细胞进行合成分离，在将细胞与每井分离0.2毫升细胞分离试剂分离之前，使用PBS清洗丝管细胞。在室温下三分钟后，向每井加入0.8毫升化学定义的基底介质，用细胞刮刀分离细胞。将细胞转移到15毫升圆锥管中进行离心，然后将颗粒重新在一毫升的合成分诱导介质中进行计数。

将五乘十至四细胞放入每个井中，将一个细胞外基质溶液涂覆的24井板中含有一毫升的合成细胞诱导介质，并返回细胞培养箱三天。在合成细胞诱导的第三天，用合成细胞诱导介质二代替介质，将板回孵化器18天，每三天更换一次培养基。前位间皮分明分化后，超过85%的细胞对三角洲样蛋白1呈阳性，该蛋白是前血性间皮的标记物，但对PAX3呈阴性，PAX3是苏米蒂克间皮的标记。

此群体在四天的体膜间皮诱导后成为PAX3阳性的间皮细胞。此外，卡得林-11的染色，一个上皮化的间皮的标记，只有在CHIR99021的添加后，才在细胞到细胞的交界处积累。通过免疫细胞化学和PAX3荧光可以评估对皮肤肌电、肌电、皮肤病、丝皮和合成细胞的分化。

与人类皮肤纤维细胞类似，iPSC衍生的真细胞产生胶原蛋白和透明质酸，由ELISA评估。为了证明人类 iPSC 衍生的合成细胞和人类成年十细胞的可比反应性，可以进行机械拉伸刺激测定。在 iPSC 传通之前，确认培养汇合在 70% 到 80% 之间，并相应地确认分裂细胞的比例为 1 比 2 到 1 比 1 比 4。

这种传递对于成功的 iPSC 差异化至关重要。对于未来使用这种方法的基于细胞的疗法，有必要建立一种新的无细菌条件，其中不包括从非人类动物衍生的任何成分。