构建高倾斜扫描瓦片显微镜以实现大视野单分子成像的指南
2019年4月8日
本文详细描述了如何构建一种高度倾斜扫描瓦片（HIST）显微镜，并介绍了其在单分子成像中的应用。
我们的方法能够实现比传统方法大40倍的成像区域来观察单个分子，且背景信号显著降低。与其他技术不同，我们的方法仅使用一个物镜，无需特殊的样品腔室，并且可轻松兼容商用显微镜系统。在收集必要组件后，即可开始构建该系统。
此处，实验台上已预先放置了多个元件。一个铝制基座上安装有显微镜主体，配备压电载物台和样品 holder。实验台上还放置了三台激光器以及用于合束的光学元件。
将合并后的光束尽可能高效地耦合到单模光纤中。作为最后的初步步骤，在笼式系统中组装一个准直光源。该光源包含一个临时的相干光源，连接至单模光纤、光纤适配器、消色差透镜和光阑。
从检测光路开始操作。首先，将准直光源放置在显微镜主体的物镜端口处。调节物镜下方的反射镜，使输出光束大致呈水平方向，并与实验台上的孔洞对齐。
在光路中插入二向色镜，并将光束反射90度。添加反射镜以调节透射光束的光路，使其进入sCMOS相机。通过反射镜调节，确保光束照射到芯片的中心位置。
接下来，将一支焦距为300毫米的管镜插入到距离相机约一个焦距的位置。从显微镜主体上移除准直光源。然后调节管镜的位置，以确定其焦平面。
当相机能够清晰分辨天花板上的图案时，停止调整。检测光路在此示意图中展示。请注意，在多色荧光成像中，管镜前方增加了多通带滤光片。
返回显微镜主体。将准直光源重新安装到物镜支架中。在二向色镜之后，在反射光束的光路中放置一个折叠镜，以将光束偏转90度。
将准直光源从显微镜主体上取下并放置在附近。接着，在距离反射镜约一个焦距的位置插入一个焦距为 400 毫米的透镜。在显微镜主体上安装物镜。
然后沿光轴方向调整反射镜的位置，观察物镜上方的天花板，当其上形成完美的艾里斑图案时停止调整。接着取下物镜，重新安装带有打开光圈的准直光源。
确定光束在距反射镜约400毫米处沿光路的最小位置。确定该点后，在此处安装一个反射镜，作为共轭像平面。此时装置的状态如本示意图所示。
刚刚添加的镜子标记为 M5。再插入另一面镜子，将光束反射 90 度，并在其后安装一个焦距为 150 毫米的透镜。该透镜应距离共轭像平面 150 毫米。接下来，暂时移除激发光路中的第一个透镜。
通过此配置找到第二个透镜的焦平面位置。将单轴振镜置于该焦平面上，作为共轭的后焦平面。向振镜施加零伏电压，并旋转其支架，使其将光束反射90度。
接下来，在光路中放置一个折叠反射镜，将光束以90度角反射。将透镜放置在距离共轭后焦平面100毫米的光路位置。再次从显微镜支架上移除准直光源。
沿光路在最后一个准直透镜之前插入一个焦距为400毫米的柱面透镜。然后使用带有光纤适配器和单模光纤的另一个100毫米准直透镜，并配合使用光阑。接着，利用光阑、光纤和透镜将一束准直光通过成像系统。
使用它来聚焦光束。在第一个透镜前方450毫米处插入一个50毫米的柱面透镜。这是包含检测和激发光路的最终装置的示意图。
三束激光的输出通过单模光纤耦合进入光路。测试时制备一个三维水凝胶样品，该样品由20纳米的深红色微球与水凝胶混合而成。
在装置位置将水凝胶样品放入样品 holder 中。为激发样品，打开 638 纳米激光器，并将其功率调节至小于 1 毫瓦。将相机控制软件设置为内部触发模式，然后采集视频。
此时，振镜电机上施加的电压为零。调整相机位置，使图像位于镜头中心。接下来，调节位于共轭像平面的反射镜。
旋转镜面的水平旋钮，以实现高度倾斜的照明。记录图块图像，如同3D水凝胶中含20纳米微珠的示例荧光图像所示。比例尺为20微米。
在设置好硬件和软件以驱动振镜扫描后，继续进行下一步操作。这是用于该系统的振镜扫描软件。通过将 Vmin 设置为负500毫伏，实现全视场成像。
然后将 Vmax 设置为 500 毫伏。接下来，切换到相机采集软件，在触发模式中选择外部触发。
在 LightScan PLUS 下拉菜单中选择“向下下一个”，然后单击扫描速度控制。现在可以设置某些控制参数。在窗口高度下输入 180 行。
在“曝光”中输入28毫秒。完成后，返回镜面控制软件。在镜面控制软件中打开3D层叠功能，设置层叠数量和步长大小。
单击“拍摄视频”以开始录制图像。这是单链标记DNA的落射照明成像示例。相比之下，高倾斜扫描平铺技术生成了此图像。
HIST 图像与 Epi 图像相比，背景信号更弱。DNA 位于三维水凝胶中，激发波长为 638 纳米。这是一张标记的真核翻译延伸因子 2 的 Epi 图像。
HIST 图像的信噪比得到改善，且照明更加均匀。两者的照明功率均为 7.5 毫瓦。
成像速度均为每秒2.5帧。保持较大的倾斜角度，并将扫描镜与相机读出同步，这一点至关重要。这可确保在图像采集过程中具有较高的信噪比。
我们预计，HIST显微技术将有助于多个应用领域，包括在更深层组织中实现超分辨率成像，以及在较厚的组织切片中进行高通量基因表达谱分析。
概述
本文介绍了用于单分子成像的高倾斜扫描片层（HIST）显微镜的构建与应用。与传统技术相比，该方法通过更大的成像区域和更低的背景噪声显著增强了可视化能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 显微镜技术
- 单分子成像
- 光学工程
背景
- HIST 显微镜使用单个物镜。
- 它可与商用显微镜系统兼容。
- 该系统显著提高了成像面积并降低了背景信号。
- 传统方法通常需要复杂的装置和特殊腔室。
研究目的
- 提供构建HIST显微镜的详细指南。
- 展示其在单分子成像中的有效性。
- 突出其相较于传统成像技术的优势。
使用的方法
- 组装光学元件，包括激光器和透镜。
- 调节反射镜和透镜以实现最佳光束准直。
- 使用振镜进行扫描并采集图像。
- 利用含有荧光微球的三维水凝胶样品进行测试。
主要结果
- HIST 显微镜实现了大 40 倍的成像面积。
- 成像中表现出背景噪声的显著降低。
- 成功捕获了单分子的高质量图像。
- 与传统成像技术进行了清晰的对比。
结论
- HIST 显微镜是单分子成像领域研究人员的一种重要工具。
- 其设计简化了搭建过程，同时增强了成像能力。
- 该方法可轻松整合到现有的显微镜系统中。
常见问题
行业高管相关性
高倾角扫描瓦片（HIST）显微技术解决了单分子成像中的一个关键瓶颈问题：在较厚的生物样本中实现大视野和高信背比成像。通过实现40倍更大的成像面积并提供均匀照明，且无需使用特殊样品腔室，HIST技术可支持发现生物学研究中的可扩展靶点验证和机制性风险排除。该技术与商用系统的兼容性，降低了企业研发在获取分子靶点结合预测可信度过程中面临的技术应用门槛。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在类原生三维环境中可视化单分子动态，实现对治疗假设的探究。
- 操作价值：降低背景噪声，提高对靶点结合读数和信号通路解析的可信度。
- 预测价值：通过在与疾病相关的系统中对分子相互作用进行定量、高对比度成像，支持功能性靶点验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为厚细胞或类组织模型中的检测方法开发提供标准化、可重复的荧光读数。
- 操作价值：兼容sCMOS相机和基于振镜的扫描系统，可实现高通量筛选的准备就绪。
- 可扩展性：大视野允许每幅图像进行多重靶标分析，提高检测效率和数据密度。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过在从细胞到组织切片的不同尺度上实现一致的单分子监测，将发现研究与临床前研究衔接起来。
- 机制性降风险：均匀照明和背景信号降低，提高了生物标志物定位和靶点调控研究的可靠性。
- 基于风险评估的推进：高信噪比支持在复杂模型中基于可靠的分子表型分析做出推进或终止决策。
流程与工作流整合
HIST显微镜技术适用于从早期靶点假设验证到先导物识别及临床前验证的整个发现过程，特别是在需要通过定量单分子检测来阐明作用机制的情况下。
- 发现生物学：通过直接可视化三维水凝胶或组织模拟物中单分子行为，支持假设检验与通路解析。
- 筛选：凭借均匀照明、大视野以及与自动振镜扫描和相机触发的兼容性，实现检测就绪。
- 分析：提供定量因变量测量（例如分子密度、共定位、结合动力学），为比较实验条件提供关键数据。
- 转化研究：通过在不同样本厚度下保持一致的成像性能，促进从发现研究到临床前研究的连续性。
- 企业级复用：设计为模块化、可适应的平台，可在多个项目中重复使用，减少重复的光学系统搭建工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低机制模糊性并实现高对比度单分子检测，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过同步振镜扫描和共聚焦狭缝背景抑制，实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期降低靶点假设的风险，实现更优的立项/终止决策、资本利用效率以及减少后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于来自复杂生物系统的可靠、定量的分子成像数据，实现风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备光学调准、激光安全和振镜控制系统方面的专业知识。
- 需要稳定的隔振平台、精密平移台以及同步的数据采集硬件。
- 为获得可重复的结果，需在不同团队间对激发光功率、扫描参数和相机设置进行标准化。
- 适应性考虑因素包括样品折射率匹配以及针对不同激发波长选择合适的柱面透镜。
- 实际限制：性能依赖于振镜扫描与相机读出之间精确同步的维持，以保证光学切片效果。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Preliminary Setup
1:11
Setting up the Detection Path
2:14
Setting up the Excitation Path and the Cylindrical Lenses
4:59
Testing Tile Imaging
5:53
Highly Inclined Swept Tile (HIST) Imaging
6:52
Results: Highly Inclined Swept Tile Microscopy of Labeled DNA and RNA
7:38
Conclusion
