Name: 构建用于扩展视场单分子成像的高倾角扫描磁贴显微镜的指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习构建高倾角扫描磁贴显微镜用于扩展视场单分子成像。该方法采用单物镜设计，成像面积扩大40倍，背景噪声显著降低，可与商用显微镜系统兼容。

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本工作由美国国防高级研究计划局（DARPA）（项目编号：HR00111720066）和美国国家科学基金会（NSF）（项目编号：1805200）资助。我们感谢安道尔技术公司（Andor Technology）的Michael Serge慷慨出借sCMOS相机。

1. 设置显微镜、激光器和校准工具
<ol>
	<li>在搭建显微镜之前，准备好材料表中列出的所有必要组件，包括光学元件、光机械部件和电子元件。</li>
	<li>准备一个显微镜主体，主要由两部分组成：一个带有RMS螺纹接口的物镜支架，以及安装在铝块上的压电载物台（图1A）。 
	注：定制的显微镜主体可提高仪器使用的便利性和灵活性12。任何市售的显微镜主体均可用于HIST显微成像。</li>
	<li>合并多个激光光源并耦合至单模光纤
	<ol>
		<li>将405 nm、561 nm和638 nm激光器安装到光学平台上，并通过偏振分束器和长通二向色镜合并光束，如图1B所示。确保所有激光束均通过准直工具上的针孔。插入半波片以调节激光功率。 
		注：佩戴激光防护眼镜，并使用光束挡板吸收不需要的激光束，以保护眼睛。</li>
		<li>安装一个光纤耦合透镜（f = 4.5 mm）和由笼式系统固定的光纤适配器，并将其安装在z轴平移台上。</li>
		<li>将一根多模光纤（MMF，Ø 62.5 µm）连接至光纤适配器。调节每对转向镜和z轴平移台，直至各激光的耦合效率高于95%。输出光束具有近似高斯分布的光强轮廓，并带有散斑图案。</li>
		<li>移除多模光纤，换接单模光纤（SMF）。类似于多模光纤的操作，精细调节并最大化三种激光的耦合效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装一个准直光源，用于激发光路和检测光路中的光束准直。该装置由一个时间相干光源（561 nm）连接单模光纤、光纤适配器、消色差透镜（f = 60 mm）、光阑和一段Ø1&#34;管状间隔件组成，全部集成于笼式系统中（图1C）。使用剪切干涉仪调节光纤适配器与透镜之间的距离，以确保光束准直。</li>
	<li>准备一个光束准直工具（图1D）。该工具由一对铝制支架组成，支架上设有针孔，针孔高度距光学平台表面为2&#34;，可用于快速而精确的光束准直。</li>
	<li>组装一个双针孔系统，该系统由两端各一个Ø1&#34;磨砂玻璃准直盘、两个Ø1&#34;透镜套管（下方套管带有槽口）组成，如图1E所示。</li>
</ol>
2. 设置检测通路
<ol>
	<li>取下物镜，安装准直光源。调节物镜支架下方反射镜（M1）的旋钮，使显微镜出射光束在高度上大致与光学平台平行，并与平台上的螺纹孔对齐。各光学元件的详细位置参见图2。</li>
	<li>插入一个多波段二向色镜（DM），将光束反射90度。使用光阑的最大开孔，并确保光束通过二向色镜中心而不被遮挡。</li>
	<li>利用透过二向色镜的微弱光束来引导检测光路的对准。将一个sCMOS相机置入光束中，并通过两个反射镜（M2和M3）调节，确保光束准确照射到相机芯片的中心。</li>
	<li>在距离相机约300 mm处插入一个管镜（TL；f = 300 mm）。</li>
	<li>移除准直光源，调节管镜与相机之间的相对距离，直至相机清晰成像天花板上的图案。</li>
	<li>在管镜前插入一个多波段带通滤光片（BF），用于多色荧光成像。</li>
</ol>
3. 设置激发光路
<ol>
	<li>将准直光源重新安装到物镜支架上。放置折叠镜（M4），将显微镜输出的光束偏转90度。反复调节二向色镜和折叠镜的旋钮，直至光束穿过光束对准工具中的针孔。</li>
	<li>拆下准直光源并将其安装在实验台上，使光束朝向显微镜主体。使用光束对准工具和双针孔系统对光束进行准直。</li>
	<li>在距离物镜支架约400 mm处的光路中插入透镜L4（焦距f = 400 mm；直径Ø = 2&#34;）。安装物镜，并沿光轴调节L4的位置，直到在天花板上形成完美的艾里斑图案。 
	注意：插入透镜时，应保持光束通过透镜的位置不变。透镜L4具有SM2螺纹，可方便地将其安装或拆卸于60 mm SM2螺纹接杆板上。</li>
	<li>卸下物镜，重新安装带有可调光阑的准直光源。使用名片追踪显微镜输出的光束路径。在光束尺寸最小且距离L4约400 mm的位置安装反射镜M5，该位置为共轭像平面（cIP）。</li>
	<li>安装反射镜M6，并将光束反射90度。使用光束对准工具反复调节M5和M6的位置。</li>
	<li>在距离M5约150 mm处插入透镜L3（焦距f = 150 mm）。使用剪切干涉仪确保输出光束的准直性。</li>
	<li>暂时移除L4，并追踪光束以确定L3的焦点位置。在此位置放置一个单轴检流计镜，该位置为共轭后焦平面（cBFP）。向检流计镜施加0伏电压，并旋转其支架，使其将光束反射90度。</li>
	<li>放置折叠镜M7。以与步骤3.6相同的方式正确放置透镜L2（焦距f = 100 mm）。</li>
	<li>从物镜支架上移除准直光源。安装准直透镜L1（焦距f = 100 mm）、光纤适配器和光阑。将单模光纤连接至适配器，并使光束通过成像系统。</li>
	<li>重新插入L4，并精细调节系统，直到在天花板上出现完美的艾里斑图案。</li>
</ol>
4. 设置柱面透镜
<ol>
	<li>在L1后插入一个柱面透镜（CL1，f = 400 mm），并确保该柱面透镜沿x轴方向聚焦光束。</li>
	<li>在光路中插入另一个柱面透镜（CL2，f = 50 mm）。使用剪切干涉仪确保输出光束为准直光束。 
	注意：两个柱面透镜之间的距离为450 mm。输出光束的压缩比为8，在天花板上形成一个拉长的椭圆形艾里斑图案。</li>
</ol>
5. 测试平铺成像
<ol>
	<li>制备三维水凝胶样品。将20 nm的Crimson荧光微球与水凝胶溶液混合，该溶液包含12%丙烯酰胺:双丙烯酰胺（29:1）、0.2%（v/v）TEMED和0.2%（w/v）过硫酸铵，溶剂为0.75x TAE缓冲液。将50 µL混合溶液注入流动池中，操作方法见其他文献11。10分钟后，三维水凝胶样品即可用于成像。</li>
	<li>将样品放置于样品台上。打开638 nm激光器，并将激光功率调节至&#60;1 mW，以用于样品激发。</li>
	<li>运行相机控制软件。在相机采集设置面板中，将触发模式设为内部，然后点击采集视频，进入自由运行模式。</li>
	<li>轻微调整相机位置，使得当施加0伏电压至检流计镜（galvo mirror）时，图像位于相机视野中央。</li>
	<li>旋转镜片M5的水平调节旋钮，以实现高度倾斜的照明。 
	注意：随着照明角度的增加，由于光束变薄，水凝胶图像比正置照明（Epi）图像更清晰。然而，图像位置基本保持不变。</li>
	<li>记录拼接图像。计算有效照明宽度11。例如，图3显示的有效照明宽度为12 µm。</li>
</ol>
6. HIST 成像
<ol>
	<li>准备一个连接了接线端子板的数据采集板。使用导线将 USER 1 BNC 接口与 P0.0 相连。将 USER 1 用作 sCMOS 相机外部触发的数字输出。将模拟输出 AO0 连接到检流计镜驱动器。</li>
	<li>使用自定义程序（图 4A）从 P0.0 生成 TTL 脉冲序列，并设置周期时间为 400 ms，t_ON 为 2 ms。使用数字示波器检查 USER 1 BNC 端子输出的脉冲信号，然后将 BNC 电缆连接至相机的外部触发端口。 
	注意：本文所使用的控制软件可根据请求提供。当以不同相机帧率成像时，应相应调整周期时间。</li>
	<li>通过自定义程序启动检流计镜扫描。将 Vmin 调整为 -500 mV，Vmax 调整为 500 mV，以实现全视场成像。请注意，在此操作条件下，3D 水凝胶样品仍表现出类似于落射照明（Epi illumination）的高背景信号。</li>
	<li>更改相机采集设置。
	<ol>
		<li>在触发模式中选择外部，在 LightScan Plus 下拉菜单中选择向下（顺序），如图 4B 所示。 
		注意：在此设置下，除非触发信号开启，否则相机不会进行成像。</li>
		<li>点击扫描速度控制以调节窗口高度和每行曝光时间，并将数值分别设置为180 行和28 ms。 
		注意：当拼接宽度（Weff）为 180 行（12 µm），每行积分时间（Tint）为 28 ms 时，行间延迟时间（TD）确定为 TD = Tint/Weff = 0.156 ms。对于 2,048 × 2,048 像素的图像，总采集时间为 2,048 × TD + Tint = 346 ms，对应约 ~2.9 fps。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻微调整 Vmax 和 Vmin 以获得更清晰的图像。</li>
	<li>通过打开3D stack ON 并指定堆栈数量和步进大小，使用自定义程序获取 3D 堆栈图像。</li>
</ol>

<ol><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li>
<li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+structural+biology%3A+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li>
<li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047(2011).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641(2015).</li>
<li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123(2018).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li>
<li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li>
<li>Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li>
</ol>

中佛罗里达大学已就本文所述工作提交了专利申请。

本方案中有两个关键步骤。第一步是在步骤 3.3 中正确放置透镜 L4，确保入射光束穿过透镜中心，并在天花板上形成完美的艾里斑图案。L4 的位置决定了所有其他光学元件的位置，包括 M5、L3、GM 和 L2。第二个关键步骤是同步过程。为了抑制离焦背景信号，应使有效检测宽度等于拼接区域宽度的活性像素与光束扫描实现同步。因此，有必要测量拼接光束的有效照明宽度（步骤 5.6），并据此在步骤 6.4 中设置相机参数。
在使用非常大的视场进行成像时，该方法在某一侧的背景信号相较于另一侧有所增加。这归因于在不同成像位置处照明角度存在轻微差异。通过使用第二个振镜代替M5，可以缓解这一问题，如先前研究所示，通过同步调节位置和扫描角度即可实现11。除了使用现成的消色差双胶合透镜外，采用远心扫描镜头也将有所帮助。然而，在成像面积小于&#60;8,080 µm2时，单个振镜扫描已足够。HIST显微技术在成像深度上存在一定的限制，但在使用12 µm宽的拼接光束和NA为1.45的油浸物镜时，仍可在深度达约15 µm处获得良好的信背比（SBR）11。
在本实验方案中，我们采用8倍的光束压缩比来生成平铺光束。在HIST显微镜中，使用更薄的照明光束可实现更高的信背比（SBR），这可能有助于组织中的单分子成像11。然而，这种情况下需考虑因激发光强度增加而导致的光漂白效应，而当前的光束压缩比在三维成像中相比正置显微镜（Epi）表现出更弱的光漂白11。与采用两个正交物镜的光片显微镜相比，HIST显微镜结构简单，易于实现，并且兼容常规的样品制备方法。HIST显微镜具有更高的信背比和更大的视场（FOV），适用于研究多个细胞中单个生物分子之间的相互作用与动态行为，也可进一步用于超分辨率成像和单分子追踪。

单分子荧光成像在揭示生物分子的超微结构、动态行为及数量的众多生物学研究中发挥着重要作用1,2,3。然而，在细胞或组织内部研究单分子一直具有挑战性。共聚焦显微镜虽具备较高的光学切片能力4，但由于激发光强度高导致严重的光漂白，或成像速度较慢，因而不适用于单分子成像。宽场显微镜使用较弱的照明，但其信噪比（SBR）较差5。光片显微镜则能够实现良好的光学切片效果和较低的光漂白6；然而，其可用的数值孔径（NA）受到正交放置物镜要求的严重限制7。此外，它还需要特殊的照明装置和样品腔室8,9。
由于这些原因，高倾角层光显微技术（highly inclined and laminated optical sheet, HILO）已被广泛应用于三维单分子成像10。当一束倾斜的光束穿过两种介质的界面（例如玻璃与水）时，光束会根据斯涅尔定律发生折射。重要的是，折射后的光束会变得更薄，其厚度可表示为 dz = R/tan(θ)，其中 R 为倾斜光束的直径，θ 为透射光束的折射角。这种简单的实现方式带来了良好的光学切片能力。然而，该关系式表明，实现薄层照明（即高切片能力）需要较小的 R 和/或较大的 θ。例如，当 R = 20 µm 且 θ = 72 度时，可得到 dz = 6.5 µm。由于在对细胞深层成像时，折射角的增大受到实际限制，且需避免全内反射的发生，因此照明光束的直径与光束厚度之间存在强耦合关系。正因如此，HILO 成像的视场范围（FOV）相对较小，极大地限制了其在多细胞成像中的应用。
最近，我们通过高度倾斜扫描光片（HIST）显微技术，以一种非常简单的方式解决了这一问题，其中视场（FOV）与光束厚度实现了有效解耦11。首先，利用一对柱面透镜生成在一个方向上拉长的光束，该光束被称为“光片”（tile），可产生厚度约为 dz ~ 4 µm 的薄层照明，同时其视场达到 130&#160;x 12 µm2。随后，通过旋转的检流计镜（galvo mirror）将该光片在样品上进行扫描。与此同时，荧光图像被记录在科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机上，该相机通过工作在卷帘快门（rolling shutter）模式，高效滤除离焦背景，起到可调谐共焦狭缝检测的作用。通过这种方式，HIST 显微技术实现了比 HILO 成像更大的视场（~130&#160;x 130 µm2）和更薄的照明层，同时支持单分子成像。我们将这一新型成像技术应用于细胞中单探针检测RNA转录本，以及小鼠脑组织中少数探针的检测，具有研究基因表达与疾病的重要潜力。与其他方法不同，HIST 仅使用一个高数值孔径物镜，无需额外的照明器或远程检测物镜，且完全兼容倒置显微镜。这些优势，结合大视场和高对比度，将使 HIST 显微技术成为生物学与医学研究中的重要工具。下文将详细介绍 HIST 显微镜的仪器搭建方法，以及其性能测试与校准步骤。

<table><tbody><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A-ML</td><td>准直器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L1，L2</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td>TL</td></tr><tr><td>1&quot; 宽带介质镜</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02-10</td><td>M1~M7</td></tr><tr><td>1&quot; 柱面透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1363RM-A</td><td>CL1</td></tr><tr><td>1&quot; 柱面透镜</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM-A</td><td>CL2</td></tr><tr><td>1&quot; 方形运动学安装座</td><td>Edmund Optics</td><td>58-857</td><td>用于二向色镜安装</td></tr><tr><td>1&quot; 螺纹笼式钢板</td><td>Thorlabs</td><td>CP02</td><td>用于固定其他透镜</td></tr><tr><td>2&quot; 消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-150-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>2&quot; 消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-400-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>2&quot; 螺纹笼式钢板</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>用于固定 L4</td></tr><tr><td>2&quot; 螺纹笼状钢板</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01T</td><td>用于固定 L3</td></tr><tr><td>2% 丙烯酰胺溶液</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>64085292</td><td>水凝胶组分</td></tr><tr><td>20 nm 荧光微球</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F8782</td><td>用于成像测试</td></tr><tr><td>30 毫米笼式直角运动学镜片支架</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>用于目标 &amp;和相机安装</td></tr><tr><td>30 mm 笼式系统虹膜</td><td>Thorlabs</td><td>CP20S</td><td></td></tr><tr><td>3轴NanoMax平台</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>伯乐（Bio Rad）</td><td>64148001</td><td>水凝胶组分</td></tr><tr><td>405 nm 激光器</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE 缓冲液</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0743</td><td>水凝胶组分</td></tr><tr><td>561 nm 激光器</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-DPL</td><td></td></tr><tr><td>638 nm 激光器</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td>水凝胶组分</td></tr><tr><td>光束准直工具</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC终端接线块</td><td>自然仪器</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>带M9 × 0.5内螺纹的笼板</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>用于固定非球面透镜</td></tr><tr><td>笼具系统杆</td><td>Thorlabs</td><td>SR系列</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养 &amp;和 smFISH</td><td></td><td></td><td>参见参考文献[11]</td></tr><tr><td>双面胶带&amp;nbsp;</td><td>透明胶带</td><td>515182</td><td>流室</td></tr><tr><td>环氧树脂&amp;nbsp;</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td>流室</td></tr><tr><td>检流计镜</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211</td><td>GM</td></tr><tr><td>Galvo 系统线性电源</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td></td></tr><tr><td>半波片</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-405/561/633</td><td>功率调节</td></tr><tr><td>长通二向色镜</td><td>染色</td><td>T550lpxr</td><td>用于激光的组合</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12549-3</td><td>流室</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>赫希特助手</td><td>990/5024</td><td>流室</td></tr><tr><td>安装式磨砂玻璃对准盘</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td><td>双针孔系统</td></tr><tr><td>安装式罗切斯特非球面透镜</td><td>Thorlabs</td><td>A230TM-A</td><td></td></tr><tr><td>多波段二向色镜</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635-t3</td><td>DM；3 mm 厚度</td></tr><tr><td>多波段滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677-25</td><td>BF</td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>M31L02</td><td>MMF</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ML</td><td>水凝胶组分</td></tr><tr><td>NI-DAQ 板卡</td><td>自然仪器</td><td>PCI-6733</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; 运动学镜架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>用于固定镜子</td></tr><tr><td>物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>PLANAPO N 60X</td><td>60倍 1.45数值孔径油镜</td></tr><tr><td>底座固定夹叉</td><td>纽波特</td><td>9916</td><td></td></tr><tr><td>基座立柱柱</td><td>Thorlabs</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>压电控制器</td><td>Thorlabs</td><td>BPC303</td><td></td></tr><tr><td>偏振分束器</td><td>Thorlabs</td><td>PBS251</td><td>用于激光的组合</td></tr><tr><td>RMS-SM1 转接器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A3TS</td><td>物镜</td></tr><tr><td>杆状体支架</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转笼架&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/CRM1/CRM1P</td><td>对于HWP &amp;和圆柱透镜安装</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Andor</td><td>Zyla-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>剪切干涉仪</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td>光束准直测试</td></tr><tr><td>单模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>SMF</td></tr><tr><td>SM1透镜套管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1S25</td><td>对于双针孔系统</td></tr><tr><td>SM1螺纹槽式透镜管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L30C</td><td>双针孔系统</td></tr><tr><td>载物台安装</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺纹光纤适配器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td></td></tr><tr><td>Z轴平移支架</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>光纤耦合</td></tr></tbody></table>

构建高倾斜扫描瓦片显微镜以实现大视野单分子成像的指南

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

单分子成像技术极大地推动了我们对生物学研究中分子机制的理解。然而，在较厚的细胞和组织中获取大视野、高对比度图像一直具有挑战性。本文介绍了可克服这一难题的高度倾斜扫描平铺（HIST）显微技术。通过一对柱面透镜产生拉长的激发光束，并利用快速振镜在大成像区域上进行扫描。采用4f光路结构来布置光学元件。使用科学级互补金属氧化物半导体相机检测荧光信号，并通过与光束扫描同步的动态共焦狭缝抑制离焦背景信号。本文提供了使用所有基本组件构建HIST显微镜的逐步操作指南。

例如，在三维水凝胶中，使用638 nm激发波长对带有Atto647N标记的单链DNA进行了成像。DNA通过丙烯酰基团在凝胶聚合过程中锚定于水凝胶网络上。图像采集位置位于表面以上5 µm处，如图5a所示。与宽场（Epi）图像相比，HIST图像的背景信号显著更低，HIST图像的信背比计算为1.9 ± 0.7，而大多数单分子荧光点在宽场成像中几乎无法检测到。
采用4种FISH探针进行单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）。图5b展示了在成像缓冲液中对A549细胞进行标记的EEF2（真核翻译延伸因子2）的smFISH图像（样品制备方法详见我们之前的工作11）。图像数据来自对应于5 µm厚度的20个z轴层叠图像的最大强度投影。与落射荧光（Epi）图像相比，HIST图像不仅显著提高了信背比（SBR），而且照明更加均匀。Epi成像的曝光时间为400 ms，HIST成像每行的积分时间为32 ms，两者的照明功率均为物镜前测量的7.5 mW。Epi和HIST的成像速度均为2.5 fps。
<img alt="用于光子吸收、发射研究的光学实验装置，包含棱镜、激光光源和透镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1．显微镜主体、激光器及准直工具。 （A）物镜与样品 holder。（B）激光系统的照片。LP，长通二向色镜；λ/2，半波片；PBS，偏振分光棱镜。（C）准直光源。（D）带有两个可插入小孔的光束准直工具。（E）双小孔系统。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜的光学装置，包括反射镜、透镜、相机；带有标注组件的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2。高倾斜扫描平铺（HIST）显微镜的详细装置。 HIST显微镜系统的照片（A）和示意图（B）。BF，多通带滤光片；CL1-2，柱面透镜；DM，二向色镜；GM，振镜；BF，带通滤光片；M1-7，反射镜；L1-4，透镜；SMF，单模光纤；TL，管镜；cIP，共轭像平面；cBFP，共轭后焦平面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示与光学分析相关的x轴标准偏差的显微镜图像和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3．压缩比为8的平铺照明。 （A）三维水凝胶中20 nm微珠的荧光图像。比例尺，20 µm。 （B）沿A图y方向的标准偏差投影，经10个数据点平滑处理。红色箭头指示有效照明宽度为12 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于压电装置设置和顺序扫描模式下三维图像堆栈成像的振镜控制示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4．控制与成像软件的前面板。（A）一个自行开发的LabView程序同步控制振镜扫描、sCMOS相机的图像采集启动以及压电载物台的移动。（B）相机采集设置控制面板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦荧光显微镜与HIST显微镜下的细胞成像对比，显示细胞核的可视化效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5. （A）在三维水凝胶中，使用Epi和HIST照明对Atto647N标记的DNA进行成像的结果。（B）利用4种FISH探针在A549细胞上通过Epi和HIST显微镜对EEF2进行的单分子FISH成像。DAPI染色显示为蓝色。比例尺，20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文详细描述了如何构建一种高度倾斜扫描瓦片（HIST）显微镜，并介绍了其在单分子成像中的应用。

单分子成像技术极大地推动了我们对生物学研究中分子机制的理解。然而，要获得……

我们的方法能够实现比传统方法大40倍的成像区域来观察单个分子，且背景信号显著降低。与其他技术不同，我们的方法仅使用一个物镜，无需特殊的样品腔室，并且可轻松兼容商用显微镜系统。在收集必要组件后，即可开始构建该系统。此处，实验台上已预先放置了多个元件。一个铝制基座上安装有显微镜主体，配备压电载物台和样品 holder。实验台上还放置了三台激光器以及用于合束的光学元件。将合并后的光束尽可能高效地耦合到单模光纤中。作为最后的初步步骤，在笼式系统中组装一个准直光源。该光源包含一个临时的相干光源，连接至单模光纤、光纤适配器、消色差透镜和光阑。从检测光路开始操作。首先，将准直光源放置在显微镜主体的物镜端口处。调节物镜下方的反射镜，使输出光束大致呈水平方向，并与实验台上的孔洞对齐。在光路中插入二向色镜，并将光束反射90度。添加反射镜以调节透射光束的光路，使其进入sCMOS相机。通过反射镜调节，确保光束照射到芯片的中心位置。接下来，将一支焦距为300毫米的管镜插入到距离相机约一个焦距的位置。从显微镜主体上移除准直光源。然后调节管镜的位置，以确定其焦平面。当相机能够清晰分辨天花板上的图案时，停止调整。检测光路在此示意图中展示。请注意，在多色荧光成像中，管镜前方增加了多通带滤光片。返回显微镜主体。将准直光源重新安装到物镜支架中。在二向色镜之后，在反射光束的光路中放置一个折叠镜，以将光束偏转90度。将准直光源从显微镜主体上取下并放置在附近。接着，在距离反射镜约一个焦距的位置插入一个焦距为 400 毫米的透镜。在显微镜主体上安装物镜。然后沿光轴方向调整反射镜的位置，观察物镜上方的天花板，当其上形成完美的艾里斑图案时停止调整。接着取下物镜，重新安装带有打开光圈的准直光源。确定光束在距反射镜约400毫米处沿光路的最小位置。确定该点后，在此处安装一个反射镜，作为共轭像平面。此时装置的状态如本示意图所示。刚刚添加的镜子标记为 M5。再插入另一面镜子，将光束反射 90 度，并在其后安装一个焦距为 150 毫米的透镜。该透镜应距离共轭像平面 150 毫米。接下来，暂时移除激发光路中的第一个透镜。通过此配置找到第二个透镜的焦平面位置。将单轴振镜置于该焦平面上，作为共轭的后焦平面。向振镜施加零伏电压，并旋转其支架，使其将光束反射90度。接下来，在光路中放置一个折叠反射镜，将光束以90度角反射。将透镜放置在距离共轭后焦平面100毫米的光路位置。再次从显微镜支架上移除准直光源。沿光路在最后一个准直透镜之前插入一个焦距为400毫米的柱面透镜。然后使用带有光纤适配器和单模光纤的另一个100毫米准直透镜，并配合使用光阑。接着，利用光阑、光纤和透镜将一束准直光通过成像系统。使用它来聚焦光束。在第一个透镜前方450毫米处插入一个50毫米的柱面透镜。这是包含检测和激发光路的最终装置的示意图。三束激光的输出通过单模光纤耦合进入光路。测试时制备一个三维水凝胶样品，该样品由20纳米的深红色微球与水凝胶混合而成。在装置位置将水凝胶样品放入样品 holder 中。为激发样品，打开 638 纳米激光器，并将其功率调节至小于 1 毫瓦。将相机控制软件设置为内部触发模式，然后采集视频。此时，振镜电机上施加的电压为零。调整相机位置，使图像位于镜头中心。接下来，调节位于共轭像平面的反射镜。旋转镜面的水平旋钮，以实现高度倾斜的照明。记录图块图像，如同3D水凝胶中含20纳米微珠的示例荧光图像所示。比例尺为20微米。在设置好硬件和软件以驱动振镜扫描后，继续进行下一步操作。这是用于该系统的振镜扫描软件。通过将 Vmin 设置为负500毫伏，实现全视场成像。然后将 Vmax 设置为 500 毫伏。接下来，切换到相机采集软件，在触发模式中选择外部触发。在 LightScan PLUS 下拉菜单中选择“向下下一个”，然后单击扫描速度控制。现在可以设置某些控制参数。在窗口高度下输入 180 行。在“曝光”中输入28毫秒。完成后，返回镜面控制软件。在镜面控制软件中打开3D层叠功能，设置层叠数量和步长大小。单击“拍摄视频”以开始录制图像。这是单链标记DNA的落射照明成像示例。相比之下，高倾斜扫描平铺技术生成了此图像。HIST 图像与 Epi 图像相比，背景信号更弱。DNA 位于三维水凝胶中，激发波长为 638 纳米。这是一张标记的真核翻译延伸因子 2 的 Epi 图像。HIST 图像的信噪比得到改善，且照明更加均匀。两者的照明功率均为 7.5 毫瓦。成像速度均为每秒2.5帧。保持较大的倾斜角度，并将扫描镜与相机读出同步，这一点至关重要。这可确保在图像采集过程中具有较高的信噪比。我们预计，HIST显微技术将有助于多个应用领域，包括在更深层组织中实现超分辨率成像，以及在较厚的组织切片中进行高通量基因表达谱分析。

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