使用PDMS的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应
2019年6月1日
我们介绍一种使用硅橡胶（PDMS）制备的高通量牵引力检测方法。该新型检测方法适用于研究细胞收缩力在多种生物学、生物医学过程及疾病中的物理变化。我们通过检测上皮-间质转化过程中TGF-β依赖性的收缩力增强，展示了该方法的应用价值。
我们的实验室致力于研究力学生物学，该领域关注细胞如何产生力学作用以及如何受到力学因素的影响。量化力学生物学的一种方法是测量细胞收缩力。在贴壁细胞中，收缩力表现为细胞对基底施加的牵引力。我们使用一种通常称为牵引力显微镜（traction force microscopy，TFM）的方法来量化这些力。TFM 已被应用于多种不同的技术方案中，但其共同特点是：该技术通常是逐个进行的、较为缓慢的实验流程，一般在单个培养皿（如图中所示）中完成。这限制了我们每次只能评估一种细胞群体或一种实验条件。尽管细胞培养技术已在此前有所改进，例如发展出了多孔板培养方式，但我们想到：如果能够以同样的高通量以及同样高效的时间和试剂利用率来实现 TFM，岂不是非常理想？这正是我们的解决方案。因此，我们开发了一种 96 孔牵引力测定培养皿。它的外观与传统的 96 孔组织培养板非常相似，但使用这种培养皿，我们不仅可以同时检测 96 种不同的细胞培养条件，还能定量分析它们的细胞收缩力。相比单皿方法，该方案显著提高了实验通量，使我们能够系统地研究多种细胞状态及其收缩反应。在癌症转移过程中，癌细胞从原发部位迁移至继发部位，导致疾病在体内扩散。这种转移行为是造成约 90% 癌症相关死亡的原因。上皮性癌细胞获得更强迁移和侵袭能力的机制之一，是经历上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。在 EMT 过程中，细胞变得更加具有迁移性和侵袭性，并改变其物理行为。为了更深入理解这些物理行为的变化，我们利用柔软的硅胶基底来测量小鼠乳腺细胞在 TGF-β 诱导 EMT 后收缩力的变化。在本研究中，我们探讨了不同浓度和孵育时间的 TGF-β 对细胞物理行为的影响。聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是一种高度柔韧的橡胶材料，其杨氏模量最低可达约 0.6 千帕。通过调节交联剂（如 SYLGARD 184）的浓度，也可以调控该材料的刚度。为了测量 PDMS 的力学性能，我们使用流变仪进行测试。将 PDMS 的 A 组分与 B 组分按 1:1 的质量比混合，并加入规定质量百分比的固化剂后，将配制好的混合物加载到流变仪的测量板上。需确保样品量足够，完全覆盖转子区域。必须保证转子边缘完全接触样品，不留任何空隙。多余的样品应小心修剪并从板上擦拭干净。通过在 0.5% 振荡剪切应变条件下进行时间和频率扫描，测量各样品的储能模量及黏弹性随时间的变化特性。[Newsha] 此图是时间扫描测试的一个示例，用于测量在施加 0.5% 振荡剪切应变和 100 °C 温度条件下聚二甲基硅氧烷的流变行为。
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概述
本研究介绍了一种使用硅橡胶（PDMS）制备的高通量牵引力测定方法，旨在研究细胞收缩力在多种生物过程中的物理变化。通过测量上皮-间质转化过程中TGF-β依赖性的收缩力增强，验证了该方法的应用价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物力学
- 生物医学工程
背景
- 细胞收缩力在多种生物学过程中至关重要。
- 了解收缩力的变化可为疾病机制提供深入见解。
- 传统方法可能在通量和灵敏度方面存在不足。
- PDMS 是一种用于构建检测体系的多功能材料。
研究目的
- 建立一种高通量检测方法，用于测量细胞收缩力。
- 评估转化生长因子-β（TGF-β）在上皮-间质转化过程中对细胞收缩力的影响。
- 提供一种可靠的方法，用于研究细胞在不同条件下的行为特征。
使用的方法
- 使用PDMS制备牵引力测定实验。
- 测量细胞对TGF-β刺激的收缩力反应。
- 高通量分析以评估多个样本。
- 评估上皮-间充质转化动态过程。
主要结果
- 成功测量了细胞收缩力的变化。
- 证实了TGF-β依赖性收缩力的增加。
- 验证了基于PDMS检测方法的有效性。
- 为细胞转变过程的力学机制提供了见解。
结论
- PDMS 牵引力测定法在研究细胞收缩性方面具有良好的效果。
- 上皮-间质转化过程中收缩性增强的现象已得到证实。
- 该方法可广泛应用于多种生物学和生物医学研究。
常见问题
行业应用价值
这种高通量牵引力显微镜平台能够以可扩展的格式对细胞收缩力进行定量评估，支持在早期发现阶段进行机制性风险降低。该方法通过将TGF-β诱导的上皮-间质转化与可测量的生物物理变化相联系，为纤维化和转移研究中的靶点验证提供了预测价值。基于PDMS的系统具有良好的重复性和与现有多种孔板实验流程的兼容性，可增强在发现生物学和检测开发流程中的企业级重复使用。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究TGF-β在EMT过程中作为细胞收缩力调节因子的作用，支持靶点假设的验证。
- 操作价值：提供剂量依赖性和时间分辨的收缩力数据，有助于优先筛选纤维化和癌症通路中的机制性靶点。
- 预测价值：量化与EMT相关的生物物理表型，助力临床前靶点选择和通路风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供定量、与基底无关的收缩力测量，用于力学生物学筛选中的检测标准化。
- 操作价值：兼容96孔板格式，可并行筛选化合物文库或细胞因子剂量。
- 检测就绪性：采用稳定、惰性的PDMS基底，弹性模量可调（0.4–100 kPa），且可长期保存，减少批次间差异。
转化与临床前研究
- 转化连续性： 将 TGF-β 剂量和持续时间与收缩力输出相关联，支持与生物标志物一致的 EMT 前临床模型。
- 机制性降风险： 可在体内验证之前，在疾病相关系统中评估收缩力变化作为功能性读出指标。
- 风险调整式推进： 通过将分子干预与生物物理表型调控相关联，支持决策推进或终止项目。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，可提供有助于早期决策的生物物理检测结果。
- 发现生物学：支持对 TGF-β 信号通路在细胞力学和收缩性方面作用的假设验证。
- 筛选：可在多孔板体系中实现高通量、可重复的牵引力定量分析，用于剂量-效应关系研究。
- 分析：生成收缩性相关指标（力的大小、分布），可用于比较不同 TGF-β 浓度及作用时间下的生物学效应。
- 转化研究：将体外 EMT 诱导过程与可量化的生物力学变化相联系，增强临床前模型的相关性。
- 企业级复用：建立可重复使用的牵引力检测平台，适用于肿瘤学和纤维化研究中多种细胞类型及力学生物学靶点的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低力生物学表型的模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的PDMS基底和多孔板兼容性，增强实验的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现并行条件测试并减少每个数据点的试剂消耗，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于致病转化过程中定量的收缩力变化，促进经风险调整的靶点优先排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、TFM图像分析和PDMS基底制备方面的专业知识。
- 依赖流变仪对基底进行表征，并依赖荧光显微镜进行牵引力定量。
- 需要在不同孔之间标准化接种密度、基底功能化处理和成像条件。
- 应用于不同细胞类型时，可能需要优化基底刚度和黏附配体。
- 实际限制因素包括基底厚度的均匀性，以及PDMS在特定波长下的潜在自发荧光。
