Name: 使用 PDMS 的高通量牵引力显微镜揭示了转化生长因子的剂量依赖效应 - 对中皮到中位过渡的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 了解使用PDMS制造的高通量牵引力显微镜技术，用于测量细胞收缩性变化。该方法可研究TGF-β在上皮-间质转化过程中对细胞收缩性的剂量依赖性影响。

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作者感谢 Tom Kodger、Michael Landry 和 Christopher J. Barrett 在微珠合成方面的协助。A.J.E. 感谢自然科学与工程研究理事会资助项目 RGPIN/05843-2014 和 EQPEQ/472339-2015、加拿大卫生研究院资助项目编号 143327、加拿大癌症协会资助项目编号 703930 以及加拿大创新基金会项目 #32749。R. Krishnan 感谢美国国立卫生研究院资助项目编号 R21HL123522 和 R01HL136209。H.Y. 得到魁北克健康研究基金会以及魁北克自然与技术研究基金会的支持。作者感谢 Johanan Idicula 在视频制作和稿件撰写方面的协助，以及 Zixin He 在视频准备过程中的帮助。

注意：以下方案将指导研究人员制备和使用如图1所示的多孔牵引力显微镜（TFM）培养皿。
1. PDMS硅胶基底的制备
<ol>
	<li>基于两种市售试剂盒的复合混合物制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅橡胶混合液。
	<ol>
		<li>将PDMS试剂盒的A组分和B组分（例如GEL-8100，参见材料表）按1:1的质量比加入50 mL离心管中。 
		注：混合过程在旋转混合仪上进行，转速应足够慢，使混合液在旋转过程中能够来回流动，以确保充分混合。</li>
		<li>根据所需基底模量，加入适量的固化剂。 
		注：加入混合液中的固化剂量取决于所需基底的模量，通常范围为0.1%至1.8%。具体交联剂浓度与所得模量的对应关系可参考表1和图3。</li>
		<li>在旋转混合仪上混合配方30–45分钟；确保转速足够慢，以实现充分混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>底层：在载玻片上涂覆PDMS基底
	<ol>
		<li>将图2所示的自制卡盘放置于匀胶机上。用乙醇或异丙醇清洁载玻片，并用无尘布擦干。将载玻片放入卡盘中，并开启真空以固定载玻片。</li>
		<li>在距离边缘约1 cm处施加未固化的PDMS，并向中心方向操作。施加足够量（3–4 mL）的PDMS，以确保整个表面被覆盖。 
		注：为确保PDMS在玻璃表面均匀铺展，可使用移液器吸头辅助将PDMS混合液从中心向边缘推开。</li>
		<li>将带有PDMS混合液的载玻片置于匀胶机上，按以下程序进行旋转。
		<ol>
			<li>为使未固化的PDMS在载玻片上铺展，以50 rpm/s的加速度从0加速至200 rpm，并在200 rpm下保持1分钟。</li>
			<li>为获得100 µm厚的PDMS层，以50 rpm/s的加速度加速至300 rpm，并在300 rpm下保持1分钟。若需其他厚度（非100 µm），则需采用相应的特定转速。</li>
			<li>结束时，以50 rpm/s的减速度降至0 rpm。关闭真空，小心取下载玻片，避免触碰涂覆表面。 
			注：必须包含加速和减速步骤，以确保获得光滑连续的表面。 
			警告：为防止样品飞出卡盘，应使用自制夹具固定载玻片，而不能仅依赖真空吸附和现有的平面卡盘。该夹具的详细结构和规格见图2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀胶后的样品置于烘箱中，在制造商推荐温度（100 °C）下加热2小时。 
		注：样品放置的烘箱表面应为实心平面（即非金属丝网架），且保持水平，以确保样品受热均匀和厚度一致。陶瓷板或不锈钢板是理想选择。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>上层微珠层
	<ol>
		<li>按适当比例将微珠溶液加入剩余的PDMS混合液中。 
		注：该比例取决于微珠储备液的浓度以及样品上期望的微珠密度。典型终浓度为9.2 × 1011 个微珠/mL 和 0.05–0.2 个微珠/µm2，通常微珠过量优于不足。</li>
		<li>将微珠溶液与未固化的PDMS混合。可通过将离心管置于旋转混合仪上约30分钟、涡旋1–2分钟或超声处理30分钟实现混合，这些方法可联合使用。 
		注：在本应用中，我们发现超声处理有助于打破微珠聚集体，而旋转混合则有助于均匀分散。合成的定位标记微珠在储存过程中可能发生聚集。使用前可用正己烷重悬并进行超声处理。若存在大量大尺寸聚集体，可通过5 µm针头滤器过滤微珠悬液。此过滤步骤为可选；它有助于获得单分散微珠涂层，但可能导致部分微珠在滤膜中损失。</li>
		<li>从烘箱中取出载玻片，冷却至室温后置于匀胶机上。</li>
		<li>在已涂覆的样品表面加入3–4 mL含微珠的未固化PDMS混合液。 
		注：由于正己烷的存在，加入微珠后的混合液黏度较低。操作时切勿触碰基底表面，以免损伤已涂覆的PDMS层。此外，微珠混合液初始可能无法润湿表面；需注意防止混合液立即从已固化的PDMS表面流走。</li>
		<li>按以下程序对样品进行匀胶。
		<ol>
			<li>为铺展含微珠的未固化PDMS混合液，以100 rpm/s的加速度从0加速至500 rpm，并在500 rpm下保持1分钟。</li>
			<li>为获得一层薄的嵌入微珠的PDMS层（约1 µm），以200 rpm/s的加速度从500 rpm加速至5000 rpm，并在5000 rpm下保持10秒。</li>
			<li>结束时，以100 rpm/s的减速度降至0 rpm。关闭真空，小心取下载玻片，避免触碰涂覆表面。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀胶后的样品置于100 °C烘箱中加热1小时。 
		注：温度超过100 °C或加热时间超过1小时可能会降低微珠的荧光强度。务必确保烘箱温度设定为100 °C，不得更高。</li>
		<li>本步骤可在此暂停。如需储存样品，应覆盖表面以避免灰尘和光照。确保无任何物体接触表面。样品在室温下可长期稳定保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装培养板
	<ol>
		<li>将PDMS弹性体试剂盒的A组分（基础剂）和B组分（固化剂，例如Sylgard）按10:1的质量比加入50 mL离心管中。</li>
		<li>在旋转混合仪上混合30–45分钟。 
		注：对于一个培养板，混合5 mL基础剂与0.5 mL固化剂。可加入最多1 mL正己烷以降低混合液黏度。</li>
		<li>将混合液涂覆于分隔板底部并均匀铺展。 
		注：分隔板应倒置放置。</li>
		<li>将基底倒置放置于分隔板上。</li>
		<li>将样品倒置放入65 °C烘箱中加热2小时。</li>
		<li>从烘箱中取出样品，用70%乙醇或异丙醇清洁玻璃底部，以去除任何残留的PDMS。 
		注：本步骤可在此暂停。如需储存样品，可在基底上加盖，并用铝箔包裹整个装置以避光。样品在室温下可长期稳定保存。本方法所用分隔板为96孔格式；但研究人员可根据实验设计需求和可用分隔结构，采用其他格式（如384孔、2孔、4孔、8孔等）。可能需要进一步优化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 表面功能化
<ol>
	<li>将80 µL Sulfo-SANPAH分装液溶解于40 mL 0.1 M HEPES缓冲液（pH 7–9）中。 
	注意：通过将100 mg Sulfo-SANPAH粉末溶解于2 mL无菌二甲基亚砜（DMSO）中制备Sulfo-SANPAH分装液。通过将50 mL HEPES稀释至450 mL无菌去离子水中，并经0.22 µm孔径滤膜过滤，制备0.1 M HEPES缓冲液。</li>
	<li>向96孔板的每孔中加入200 µL稀释后的Sulfo-SANPAH溶液。</li>
	<li>将板置于适当距离和时间下暴露于紫外光（300–460 nm）照射。 
	注意：紫外照射后，溶液颜色应变深。紫外照射的距离和时间取决于紫外灯功率。在本实验中，我们在5 cm距离下照射10–15分钟。</li>
	<li>从各孔中移除Sulfo-SANPAH溶液，并向每孔中加入200 µL浓度为5 µg/mL的纤连蛋白（fibronectin）溶液。 
	注意：可根据研究需求选用其他指定蛋白进行表面包被。常用的蛋白包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。我们发现Sulfo-SANPAH法效果最佳；而等离子清洗虽有时用于PDMS处理，但不推荐使用，因其会形成二氧化硅层并明显损伤表面。</li>
	<li>将板在4 °C条件下孵育过夜。 
	注意：根据所用包被蛋白的不同，可采用不同的孵育方法。</li>
	<li>移除纤连蛋白溶液，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）&#160;洗涤每孔两次。</li>
	<li>为样品盖上盖子。</li>
	<li>向每孔中加入200 µL PBS。 
	注意：此处可暂停实验流程。包被纤连蛋白的样品可在4 °C保存最多2周。</li>
</ol>
3. 紫外线灭菌
<ol>
	<li>在生物安全柜中用紫外光对样本灭菌 30 分钟。 
	注意：过长的紫外照射时间可能对微珠荧光产生不利影响。后续所有步骤均须在无菌条件下进行。</li>
</ol>
4. 细胞培养
<ol>
	<li>从每个孔中移除 PBS，并向每个孔中加入 200 µL 悬浮于培养基中的细胞。
	<ol>
		<li>以所需的细胞密度接种细胞。细胞密度取决于具体的实验需求。对于单细胞研究，细胞之间应至少相距 50 µm，且成像窗口边缘附近的细胞不应纳入牵引力显微镜（TFM）测量范围。对于单层细胞，成像窗口的视野应被融合的细胞层完全覆盖。</li>
		<li>通过在 DMEM 中添加 5% 胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、10 µg/mL 胰岛素、1% 青霉素-链霉素、1 mM L-谷氨酰胺和 0.5 µg/mL 两性霉素 B，配制 NMuMG 细胞的完全生长培养基。</li>
		<li>通过将胰岛素溶于酸化水（130 mL 去离子水中加入 2.5 mL 冰醋酸）中，配制浓度为 10 mg/mL 的胰岛素储存液。将储存液保存于 4 °C。待溶液澄清后，经 0.22 µm 孔径滤器过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TGF-β 添加
	<ol>
		<li>配制 TGF-β 储存液：将 2 µg TGF-β 溶解于 100 µL 10 mM 柠檬酸（pH 3.0）中，使用 0.22 µm 孔径滤器过滤除菌。涡旋混匀后分装至所需体积，分装液储存于 -80 °C。</li>
		<li>将 1.5 µL TGF-β 储存液加入 10 mL 完全细胞培养基中，使培养基中 TGF-β 的终浓度为 3 ng/mL。 
		注：配制 10 mM pH 3.0 柠檬酸溶液时，将柠檬酸溶于水中，并通过加入 HCl 调节 pH 至 3.0。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据采集
<ol>
	<li>针对每个位置，至少获取一张标记微粒和细胞的图像。聚焦于微珠层。 
	注意：像素尺寸应根据标记微粒的大小及所采用的图像处理方法进行优化。在本应用中，作者使用10倍、0.4 NA的物镜，以1024 × 1024分辨率采集图像，像素大小为455 nm/像素。通常建议保持每个微珠至少约1–5个像素的分辨率；此处微珠为多分散性，单个尺寸为300–500 nm。用于牵引力显微镜（TFM）计算的图像中，荧光标记微珠必须处于清晰对焦状态。应优先保证微珠的对焦状态和成像质量，而非细胞本身的成像效果。不同通道之间不得存在串扰，尤其应避免在标记微珠的成像光谱中出现非标记微珠来源的荧光信号。</li>
	<li>记录完所有感兴趣的位置后，向每孔中加入解离溶液，以获取标记微粒的无受力参考图像。
	<ol>
		<li>配制细胞解离溶液：混合含有2% Triton X-100、50 mM叠氮化钠和500 mM氢氧化钾的水溶液。 
		注意：以上溶液仅为有效解离溶液的示例。研究人员可根据需要选用其他类型的解离溶液，以将细胞从基底表面解离下来。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 图像分析
<ol>
	<li>根据需要进行适当图像分析。 
	注意：分析软件为实验室自行开发。图像分析可使用自制软件或在线可用的软件完成。</li>
</ol>
7. 微珠合成
注意：以下实验方案基于 Klein 等人10所描述的合成方法。
<ol>
	<li>在通风橱内，安装带有水冷回流冷凝器的三颈烧瓶。 
	警告：合成操作必须在通风良好的化学通风橱中进行。</li>
	<li>向烧瓶中加入 0.5 mL PDMS 稳定剂和荧光染料。</li>
	<li>其中一个颈口安装带有氮气进气针和出气针的橡胶隔垫，另一个颈口安装可用于注射器加料的橡胶隔垫。</li>
	<li>向烧瓶中加入 100 mL 无水正己烷（总体积为 250 mL），并加入一根小型磁力搅拌子。</li>
	<li>将烧瓶置于 75 °C 的矿物油浴中，并通入氮气鼓泡除氧 1 小时。</li>
	<li>向一个 25 mL 的圆底烧瓶中加入 6 mL 甲基丙烯酸甲酯。</li>
	<li>向该圆底烧瓶中加入 0.100 g 偶氮二异丁腈（AIBN），并通入氮气鼓泡除氧 1 小时。 
	注意：使用前需将甲基丙烯酸甲酯通过预装柱以去除抑制剂。随后将甲基丙烯酸甲酯与 AIBN 的混合物加入三颈烧瓶中。</li>
	<li>溶液最初变浑浊，随后呈乳白色。待溶液变浑浊后，继续反应 3 小时。</li>
	<li>反应 3 小时后，将烧瓶置于冰水浴中冷却。</li>
	<li>用粗孔滤纸对溶液进行减压过滤。</li>
	<li>将滤液离心，并将沉淀颗粒重新悬浮于正己烷中。 
	注意：所加入正己烷的体积取决于所需微球溶液的浓度。超声处理有助于微球颗粒在正己烷溶液中的再分散。作者制备的微球粒径呈多分散性，直径约为 300–500 nm。由于位移测定采用互相关图案追踪法，因此无需单分散微球。</li>
</ol>
8. 流变学测量方案
注意：流变学测试并非每位研究人员或实验所必需，但对于量化新型PDMS配方的模量而言是必要的。在本方案中，我们采用剪切流变仪来测量交联剂、频率和应变对PDMS样品模量的影响。根据可用的工具和专业知识，也可使用其他多种力学分析方法来测定模量。此外，使用本方案的研究人员可选择采用我们已发表的模量数据，详见表1、图3和图4。
<ol>
	<li>使用带有直径为25 mm平行板几何结构的流变仪。也可使用其他几何结构。</li>
	<li>启动系统并校准设备及测量系统（平行板，d = 25 mm）。测量零间隙后，开始加载PDMS样品。</li>
	<li>一旦混合了PDMS弹性体和交联剂，立即将混合物移取到流变仪的下板上。
	<ol>
		<li>将转子下移，使其完全接触PDMS样品的顶部。</li>
		<li>小心修剪下板上多余的样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在应变扫描测试中，对不同交联密度的每种组分施加逐渐增加的应变，以确保在所有剪切测量过程中聚合物结构保持在线性粘弹性范围内。 
	注意：细胞研究中相关的应变值通常在0.1–10%范围内。我们发现PDMS在高达约100%应变时仍保持线性。</li>
	<li>在时间扫描测试中，以1 Hz频率和0.5%振荡剪切应变，在100 °C下测量PDMS网络的动态剪切储能模量（G'）和损耗模量（G′′）。</li>
	<li>为确定最终PDMS网络的粘弹性及时间依赖性，进行频率扫描测试，频率范围为0.1–100 Hz，振荡剪切应变为0.5%。</li>
</ol>

<ol><li>Harris, A., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+in+locomoting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Traction forces in locomoting cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).</li>
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<li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li>
</ol>

AJE 和 RK 对 Live Cell Technologies 公司拥有利益关系，该公司生产本文所述的材料。

该方法成功的关键在于制备出厚度均匀且恒定的样品，厚度约为 100 µm。应谨慎选择模量，以准确考察目标生物系统的物理意义。在制备顶层时，应优化示踪荧光微粒的浓度，以实现对位移和牵引力应力的精确分析。分析单个孤立细胞时，所需的示踪层密度高于测量汇合单层细胞时的需求。此外，基底表面应稳定且均匀地包被黏附分子（如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白），以确保细胞能够正常附着于基底表面。安装多孔分隔器时需格外小心，应避免滑动放置，以防密封用的 PDMS 胶被涂抹到培养表面；同时，其外边缘必须与玻璃尺寸精确对齐，以防止边缘孔位发生泄漏。
为防止小室发生泄漏，需在小室分隔处涂抹适量的PDMS胶以固定其位置。但若使用过量，则会覆盖细胞培养表面。
在旋涂过程中需要加入足量的PDMS。固化时，烘箱和支架必须保持水平。PDMS不足或烘箱不水平可能导致PDMS厚度不均。
微珠密度需要优化以确保准确分析。当微珠密度不足时，需增加微珠在基准PDMS混合物中的浓度。此外，还需加入足量的混合物用于旋涂。为确...

肌动蛋白-肌球蛋白收缩力是细胞主动力学的核心要素，影响着细胞从运动、增殖到干细胞分化的多种行为。在组织中，收缩力驱动了从胚胎发育过程中的极性分离，到气道收缩以及心脏活动等多种生理过程。关键的是，细胞要产生张力，必须首先黏附于其细胞外环境。通过这种黏附，细胞的收缩力会对其周围环境产生牵引力。牵引力显微镜技术（Traction Force Microscopy, TFM）已发展出多种形式，成为在不同条件下定量测量各类细胞产生牵引力的重要方法。
牵引力显微技术（TFM）领域在创新和应用方面取得了广泛进展，其成果为生物学研究开辟了融入力学和物理力作用的新视角。从早期使用产生皱褶的硅胶基底1开始，研究人员已采用多种技术来测量细胞牵引力。这些方法不断得到改进，目前分辨率已达到数微米级别2。然而，一个主要问题逐渐显现，即使用现有的硅胶材料难以制备出具有合适低模量的基底。为解决这一问题，聚丙烯酰胺被引入作为替代材料，因其易于制备模量在1–20 kPa范围内的基底3。我们近期在TFM中采用了高度顺应性的硅胶材料4，使我们能够实现与聚丙烯酰胺相当的模量范围，同时兼具硅胶材料惰性强、机械稳定性好的优势。
TFM 方法已实现了重要的力学生物学发现，然而其复杂性始终是一个持续存在的缺陷，通常限制了这些方法仅被工程学或物理科学领域的研究人员使用。这归因于&#160;在很大程度上&#160;由于量化收缩力需要进行详细的校准和复杂的计算，因此存在较大难度。另一个重要挑战在于，TFM 方法通量普遍较低，因而难以同时研究多种不同条件或群体。5这已成为一个瓶颈，阻碍了薄膜显微镜技术从专业的生物物理领域向更广泛的生物学和药理学领域的推广应用。&#160;应用。
我们近期开发了一种多孔格式的牵引力显微镜（TFM）板，可使研究人员并行开展TFM测量，从而更快地量化收缩性指标，同时探索不同化合物的影响，并减少试剂用量4。该方法在多种力学生物学研究中具有广泛的应用价值，从评估化合物对细胞活性的影响，到量化分化或疾病过程中的收缩性变化均可适用。
生物医学研究中将极大受益于牵引力显微镜（TFM）的一个领域，是物理信号如何影响癌细胞恶性表型的研究。转移是导致90%癌症相关死亡的原因，其特征是癌细胞离开原发肿瘤部位并定植于继发部位。细胞要穿过组织并在血管系统内外迁移，必须发生显著的形态改变，以挤过这些物理屏障，同时产生足够的力，沿细胞外基质拉动自身或在其他细胞间移动。这些力通过局灶性黏附相互作用传递到基底2,3，并可利用TFM进行量化。尽管癌症在生物化学上具有高度异质性，已知的突变和蛋白质变化种类不断增多，但仍观察到一些共通的物理特性改变；在包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌在内的多种癌症中，转移性细胞施加的牵引力已被证实是非转移性细胞的2-3倍6,7,8。这些结果提示，转移进展与细胞施加的牵引力之间可能存在强烈相关性；然而，细胞收缩力随时间变化的详细动态仍难以观测。
上皮-间质转化（EMT）是一种细胞通过减少黏附连接和紧密连接介导的细胞间黏附，从而获得更强迁移性和侵袭性的过程。除了参与伤口愈合和发育过程等生理功能外，EMT 还在肿瘤转移过程中被癌细胞所利用，因此成为研究该过程的一个有用模型系统。利用 TGF-β，我们可在&#160;小鼠乳腺上皮细胞（NMuMG）9中诱导 EMT，直接量化转化过程中的物理变化，并表征 TGF-β 对 EMT 及细胞收缩力的时间和剂量依赖性效应。本文通过测量诱导 EMT 过程中细胞收缩力的变化，展示了该方法的应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GEL-8100</td><td>Nusil Technology</td><td>GEL-8100</td><td>高纯度介电性软硅胶凝胶套件</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装剂透明 0.5 kg 套件</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>固化剂</td></tr><tr><td>定制切割玻璃&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific Company</td><td></td><td>109.6 mm&amp;plusmn; × 72.8 mm&amp;plusmn; × 1 mm 厚度</td></tr><tr><td>Target 2TM 尼龙注射器滤器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F2513-4</td><td></td></tr><tr><td>96 孔条板蛋格式条带支架</td><td>Corning</td><td>2572</td><td></td></tr><tr><td>带角切口的聚苯乙烯通用微孔板盖&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3099</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EA95</td><td>0.95</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td>ACS 试剂，&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;&amp;ge;99.5%&lt;/font&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;表面涂层&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH 交联剂</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>溶液，经无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>PBS，1×</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>pH 7.4，不含钙和镁</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM，1×</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>优质，内毒素 &amp;nbsp;&amp;lt;1，血红蛋白 &amp;lt;25</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent</td><td>330-050-EL</td><td>1 M，游离酸</td></tr><tr><td>重组人胰岛素</td><td>Wisent</td><td>511-016-CM</td><td>USP 级</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>100×，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td>200 mM 溶液，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Wisent</td><td>450-105-QL</td><td>250&amp;mu;g/mL，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>重组人 TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>HEK293 表达来源</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020</td><td>冰醋酸，&amp;ge;99.85%</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275&amp;nbsp;</td><td>ACS 试剂，&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>NMuMG</td><td>ATCC</td><td>CRL-1636</td><td>小鼠乳腺细胞系</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC190385000</td><td>99%，超纯，ACROS Organics</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>ACS 试剂，&amp;ge;85%，颗粒状</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>实验室级</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微珠合成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-二十八烷基-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>468495-100MG</td><td>97%</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M55909-500ML</td><td>含 &amp;le;30&amp;nbsp;ppm MEHQ 作为抑制剂，99%</td></tr><tr><td>抑制剂去除柱</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>306312-1EA</td><td>预装柱，用于去除氢醌和单甲醚氢醌</td></tr><tr><td>甲基丙烯酰氧基丙基封端聚二甲基硅氧烷</td><td>Gelest&amp;nbsp;</td><td>DMS-R31 (25,000 g/mol)</td><td>聚二甲基硅氧烷稳定剂，25,000 g/mol，1,000 cSt</td></tr><tr><td>2,2&amp;prime;-偶氮双(2-甲基丙腈)（AIBN）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>441090-25G</td><td>98%</td></tr><tr><td>正己烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>296090-2L</td><td>无水，95%</td></tr><tr><td>己烷，异构体混合物</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>227064-1L</td><td>无水，&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;定性滤纸，1 号</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>WHA1001055</td><td>圆形，直径 55&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laurell WS-650Mz-23NPPB</td><td>Laurell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVP 手持式紫外灯 UVGL-58 型</td><td>VWR</td><td>21474-622</td><td></td></tr><tr><td>流变仪</td><td>Anton Paar</td><td>MCR 302 WESP</td><td></td></tr></tbody></table>

使用pdms的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

细胞收缩力在生物学的诸多方面至关重要，驱动着从运动、分裂到组织收缩和机械稳定性的各种过程，是多细胞动物生命的核心要素之一。在贴壁细胞中，肌动球蛋白收缩表现为细胞对其基质施加的牵引力。细胞收缩力的失调出现在多种病理状态中，使得收缩力成为利用生物物理指标进行诊断的有前景靶点。此外，新的治疗策略可基于纠正细胞收缩力的明显功能障碍而建立。这些应用，&#160;然而，需要对这些力进行直接量化。
我们开发了基于硅胶弹性体的并行多孔板格式牵引力显微镜技术（TFM）。与常用的水凝胶聚丙烯酰胺（PAA）不同，我们采用硅橡胶材料，特别是聚二甲基硅氧烷（PDMS），从而制备出稳定且惰性的基底，其储存期无限，无需特殊储存条件。与基于微柱PDMS、模量处于GPa范围的方法不同，此处使用的PDMS具有高度顺应性，模量范围约为0.4 kPa至100 kPa。我们通过在空间上将这些大尺寸整体基底划分为生化上相互独立的孔，构建了一个高通量TFM平台，形成一种可与现有多种多孔板系统兼容的多孔板牵引力筛选平台。
在本论文中，我们利用这种多孔牵引力系统研究上皮细胞向间充质细胞的转变（EMT）；通过将 NMuMG 细胞暴露于 TGF-β 以诱导 EMT，并量化 EMT 过程中的生物物理变化。我们测量了细胞收缩力随 TGF-β 处理浓度和时间的变化。我们的研究结果展示了并行化牵引力显微技术在疾病生物物理学研究中的应用价值。

在添加TGF-β之前，汇合的单层细胞呈鹅卵石样形态，排列紧密。经TGF-β处理后，细胞形态变得更加细长，细胞面积增大，并获得更明显的间充质样表型。利用由柔软PDMS弹性体制造的多孔装置，研究了共17种不同条件下细胞的物理特性。细胞分别接受四种不同浓度的TGF-β（0.5、1、2和4 ng/mL）以及四种不同孵育时间（12、24、48、96 h）处理，结果总结于图5中。经TGF-β处理的细胞所产生的牵引应力和应变能均大于未添加TGF-β培养的细胞。孵育96小时的TGF-β处理组细胞表现出最大的牵引应力和应变能。随着TGF-β浓度的升高，细胞施加的应力和应变能也随之增大。在较长的孵育时间下，牵引力和应变能的差异更为显著。
基底表面必须光滑，并均匀涂覆配体（如纤连蛋白或胶原蛋白）。表面划痕和/或配体涂层不均匀可能导致细胞贴附异常，从而造成牵引力测量不准确。图...

我们介绍一种使用硅橡胶（PDMS）制备的高通量牵引力检测方法。该新型检测方法适用于研究细胞收缩力在多种生物学、生物医学过程及疾病中的物理变化。我们通过检测上皮-间质转化过程中TGF-β依赖性的收缩力增强，展示了该方法的应用价值。

使用PDMS的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应

细胞收缩力在生物学的多个方面至关重要，可驱动从运动和分裂到组织收缩等一系列过程……

我们的实验室致力于研究力学生物学，该领域关注细胞如何产生力学作用以及如何受到力学因素的影响。量化力学生物学的一种方法是测量细胞收缩力。在贴壁细胞中，收缩力表现为细胞对基底施加的牵引力。我们使用一种通常称为牵引力显微镜（traction force microscopy，TFM）的方法来量化这些力。TFM 已被应用于多种不同的技术方案中，但其共同特点是：该技术通常是逐个进行的、较为缓慢的实验流程，一般在单个培养皿（如图中所示）中完成。这限制了我们每次只能评估一种细胞群体或一种实验条件。尽管细胞培养技术已在此前有所改进，例如发展出了多孔板培养方式，但我们想到：如果能够以同样的高通量以及同样高效的时间和试剂利用率来实现 TFM，岂不是非常理想？这正是我们的解决方案。因此，我们开发了一种 96 孔牵引力测定培养皿。它的外观与传统的 96 孔组织培养板非常相似，但使用这种培养皿，我们不仅可以同时检测 96 种不同的细胞培养条件，还能定量分析它们的细胞收缩力。相比单皿方法，该方案显著提高了实验通量，使我们能够系统地研究多种细胞状态及其收缩反应。在癌症转移过程中，癌细胞从原发部位迁移至继发部位，导致疾病在体内扩散。这种转移行为是造成约 90% 癌症相关死亡的原因。上皮性癌细胞获得更强迁移和侵袭能力的机制之一，是经历上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。在 EMT 过程中，细胞变得更加具有迁移性和侵袭性，并改变其物理行为。为了更深入理解这些物理行为的变化，我们利用柔软的硅胶基底来测量小鼠乳腺细胞在 TGF-β 诱导 EMT 后收缩力的变化。在本研究中，我们探讨了不同浓度和孵育时间的 TGF-β 对细胞物理行为的影响。聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是一种高度柔韧的橡胶材料，其杨氏模量最低可达约 0.6 千帕。通过调节交联剂（如 SYLGARD 184）的浓度，也可以调控该材料的刚度。为了测量 PDMS 的力学性能，我们使用流变仪进行测试。将 PDMS 的 A 组分与 B 组分按 1:1 的质量比混合，并加入规定质量百分比的固化剂后，将配制好的混合物加载到流变仪的测量板上。需确保样品量足够，完全覆盖转子区域。必须保证转子边缘完全接触样品，不留任何空隙。多余的样品应小心修剪并从板上擦拭干净。通过在 0.5% 振荡剪切应变条件下进行时间和频率扫描，测量各样品的储能模量及黏弹性随时间的变化特性。[Newsha] 此图是时间扫描测试的一个示例，用于测量在施加 0.5% 振荡剪切应变和 100 °C 温度条件下聚二甲基硅氧烷的流变行为。

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科研

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Bioengineering

生物工程

使用 PDMS 的高通量牵引力显微镜揭示了转化生长因子的剂量依赖效应 - 对中皮到中位过渡的影响

本文描述了一种在三维胶原凝胶中定量检测转化生长因子（TGF）-β诱导侵袭的实验方法。该方法利用代表乳腺癌不同发展阶段的MCF10A系列细胞系，也可适用于其他细胞系，并可用于研究其他潜在的侵袭激活剂或抑制剂。...

用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

本文描述了一种在多种细胞类型中诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）的简便方法，并包含了通过免疫细胞化学分析处于EMT状态细胞的方法。...

上皮间质转化的诱导与分析

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT...

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。...

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

本文介绍一种基于过表达miR-200家族成员与grainyhead样2（GRHL2）来诱导肉瘤细胞发生间充质-上皮转化（MET）的细胞培养方法。该方法适用于深入理解表型可塑性对癌症侵袭性及治疗反应的生物学影响。...

肉瘤细胞中诱导间充质-上皮转化

体外诱导内皮-间充质转化（EndMT）的实验方案，可用于研究参与EndMT的细胞信号通路。在此实验模型中，通过TGF-β处理MS-1内皮细胞以诱导EndMT。...

转化生长因子-β信号诱导的内皮-间充质转化的分子分析

本文介绍了一种基于力学的实验方案，用于破坏缝隙连接蛋白 connexin...

通过连接蛋白43结构破坏干扰内皮细胞生物力学

我们描述了一种系统性工作流程，通过研究TGF-β信号通路中涉及的蛋白和基因表达，来探究TGF-β信号传导及TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。该方法包括蛋白质印迹（Western...

研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

我们描述了通过观察细胞形态变化以及利用免疫荧光染色检测内皮-间质转化（EndMT）相关标志物表达变化，来研究TGF-β2诱导内皮细胞发生EndMT的方法。同时介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术，并用于敲除编码Snail的基因，以探究其在TGF-β2诱导EndMT过程中的作用。...

TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

TGT 表面是一种用于研究生长因子与整合素串扰的创新平台。该平台采用灵活的探针设计、特异性的黏附配体以及对刺激条件的精确调控，可对 EGFR 与整合素之间的相互作用进行可靠的定量评估。研究结果表明，EGFR...

用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

了解使用PDMS制造的高通量牵引力显微镜技术，用于测量细胞收缩性变化。该方法可研究TGF-β在上皮-间质转化过程中对细胞收缩性的剂量依赖性影响。

使用PDMS的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应

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