生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

生理性的树突状抗原提呈细胞（称为PhDC）是启动抗原特异性T细胞免疫与耐受的免疫主控开关。本文阐述了一种高效制备PhDC的方法。目前树突状细胞的临床应用受到限制，原因在于制备过程中所使用的非生理性细胞因子方法。

我们的方法通过高效地利用血小板信号在人和小鼠中诱导单核细胞向树突状细胞（DC）转化，从而克服了该问题。这些血小板诱导的树突状细胞（PhDC）不依赖于体内无法实现的细胞因子条件，因此能够在已建立肿瘤的人和小鼠中诱导强烈的临床抗肿瘤T细胞反应。这种跨物种的血小板启动单核细胞向PhDC成熟的过程具有广泛的实验应用价值。

PhDC 可用于研究树突状细胞的生理学特性，促进对免疫原性癌症产生治疗性抗肿瘤免疫反应，并在个性化抗微生物疫苗开发中展现出潜力。该实验体系具有新颖性，其多个环节——如塑料培养室的包被、肿瘤细胞经 8-MOP/UVA 处理、流体条件控制以及单核细胞的释放——通过视觉化展示最为清晰。本实验操作将由本实验室技术员 Eve Robinson 进行演示。

为收集外周血单个核细胞，首先准备一个15毫升离心管，每取5至10只荷瘤小鼠的血液，加入4毫升淋巴细胞分离液。然后将从荷瘤小鼠收集的血液缓慢叠加于分离液上方。以1,000至1,500 × g离心20分钟，使外周血单个核细胞与红细胞分离。

离心结束后，收集上层血浆层，保留0.5毫升液体在白细胞层（buffy coat）上方，于4°C保存以备后续使用。接着，将白细胞层转移至一个含有PBS并定容至15毫升的洁净15毫升离心管中，在标准组织培养离心机中以250 × g离心10分钟，以收集外周血单个核细胞（PBMC）。离心结束后，小心吸去上清液，并轻弹管壁以重悬细胞沉淀。

然后向管中加入2毫升ACK红细胞裂解缓冲液，以去除PBMC中残留的红细胞。将PBMC置于冰上孵育10分钟。用PBS将管内体积补至15毫升，并在标准组织培养离心机中以250 × g离心10分钟，以收集PBMC。

小心地用移液枪吸去上清液，并轻弹管壁以松动沉淀。将沉淀重悬于 300 微升胎牛血清（FBS）中。为制备每处理组的 YUMM1.7 肿瘤细胞，首先将肿瘤细胞沉淀以每 300 微升含 250 万细胞的浓度重悬于 FBS 中。

关闭组织培养罩的灯光后，向YUMM1.7肿瘤细胞悬液中加入8-甲氧基补骨脂素，使其终浓度为100纳克/毫升。随后混匀细胞，用铝箔包裹细胞容器，并在37摄氏度下孵育20分钟。为预包被一块12孔组织培养板，每个五只小鼠的处理组对应的一个孔中加入1毫升胎牛血清，并将培养板置于4摄氏度冰箱中冷藏20分钟。

20分钟后，在组织培养罩内，从孔中移除FBS，并每孔加入300微升经补骨脂素处理的肿瘤细胞。随后将含细胞的培养板暴露于预热的UVA光源下，总照射剂量为每平方厘米4焦耳。为收集每孔中经8-甲氧基补骨脂素/UVA处理的肿瘤细胞，轻轻摇晃培养板并小心吹打，以确保完全回收细胞。

对每组五只小鼠进行穿膜免疫化板传代时，将300微升相应的外周血单个核细胞（PBMC）与300微升经8-甲氧基补骨脂素/UVA处理的肿瘤细胞混合于1.5毫升锥形管中，并混匀细胞。接着，打开穿膜免疫化（TI）板的入口和出口管路夹。使用10毫升注射器将胎牛血清（FBS）注入TI管路中，同时在填充过程中关闭夹子，以使FBS保留在管路内。

断开注射器。将P1000移液枪吸头牢固地插入TI板的进样口。将板倾斜45度角，缓慢加入PBMC和肿瘤细胞混合液，避免产生气泡。

在释放移液器活塞之前，先将移液器吸头从进样口取下。将剩余的细胞放回1.5毫升离心管中。将装有FBS的管路、装有细胞的TI板以及含有剩余细胞的1.5毫升离心管置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育一小时。

孵育结束后，松开夹子，通过重力作用排空TI管路。然后将P1000移液器吸头（压下活塞）插入板端口，以从TI板中移除细胞。将板倾斜至45度角，并用细胞悬液充满P1000移液器吸头。

将细胞放回原来的1.5毫升离心管中。运行TI板时，将出口管连接至TI板，并将TI板固定到板运行系统中。接着，使用1毫升注射器从1.5毫升离心管中吸取600微升PBMC和肿瘤细胞混合液。

将注射器连接到入口管上，打开夹子，缓慢注入液体，直至液体到达管路末端。将入口管的游离端连接到 TI 板上，并继续轻柔地加载剩余体积。完成后关闭入口夹。

取下一个毫升注射器，将入口管路连接至注射泵。将出口管路固定至一个洁净的1.5毫升离心管，用于收集细胞。调节注射泵流速至0.09毫升每分钟。

使用TI板运行平台将TI板向注射泵一侧倾斜约30度。小心松开入口管路的夹子。启动注射泵，并仔细观察TI板的填充过程。

当TI板完全充满后，在液体排空时将其向相反方向倾斜约30度。当液体中的所有细胞均进入1.5毫升锥形收集管后，停止泵送。清洗TI板时，将入口管路从注射泵上断开，并连接至一支装有600微升胎牛血清（FBS）的一毫升注射器。

填充至胎牛血清完全加载。然后断开注射器，并将管路连接至注射泵。调节注射泵流速为 0.49 毫升每分钟。

松开入口夹，运行TI板，将洗涤液收集到同一个1.5毫升锥形管中。在TI板排空的整个过程中，轻轻弹动或轻敲TI板，以帮助解离并洗脱任何贴壁细胞。将收集用的1.5毫升锥形管从TI板装置上断开。

将收集管在台式微量离心机中以250 × g离心8分钟，弃去上清液。为进行PBMC与抗原的过夜共孵育，首先将PBMC和肿瘤细胞沉淀重悬于2毫升透明RPMI培养基中，该培养基需添加15%同源小鼠血清。然后将细胞接种至35毫米非组织培养处理的无菌培养皿中，在标准组织培养条件下过夜孵育。

第二天，使用组织培养刮刀小心地将贴壁细胞从培养皿底部刮下。刮取过程中旋转培养皿，以确保细胞收集均匀。将细胞收集至15毫升离心管中。

向培养皿中加入 2 毫升 PBS，重复刮取步骤，将细胞收集到同一离心管中。用 1 毫升 PBS 冲洗 35 毫米培养皿，并将冲洗液加入同一离心管中。在标准组织培养离心机中以 250 × g 离心 10 分钟，以收集细胞。

小心地用移液枪吸去上清液，然后轻弹管壁以重新悬浮沉淀。在两年内进行的九次独立实验的累积肿瘤生长数据中观察到，与对照组小鼠相比，接受治疗的小鼠中 YUMM1.7 肿瘤生长显著减少，涉及超过100只小鼠。单次实验中个体动物的代表性肿瘤生长曲线反映了该系统中的变异性。

当从PBMC组分中去除单核细胞或血小板，或省略血小板孵育步骤时，治疗效果将不再出现。若缺乏免疫细胞或抗原来源，或存在错配抗原（例如使用MC38结肠癌细胞治疗YUMM1.7肿瘤），该治疗均无效。为获得免疫诱导效果，还必须避免PBMC暴露于8-甲氧基补骨脂素。

通过FACS分析人CD11c+细胞中相应IgG对照的指定标志物变化，比较了新鲜分离的PBMC、TI处理的PBMC、未经血小板过境的TI处理PBMC、在血小板过境前去除血小板的PBMC，或上述两种处理方式，结果显示树突状细胞（DC）的活化依赖于PBMC中血小板的存在以及TI介导的血小板过境。TI活化的人DC能够有效加工并交叉提呈肽抗原，或来自经8-甲氧基补骨脂素处理的人肿瘤细胞的抗原，从而在体外实验中以TI和血小板依赖的方式激活人抗原特异性T细胞系。T细胞应答的特异性取决于所加工抗原的来源。

在诱导抗肿瘤免疫反应时，必须对每种肿瘤细胞系的凋亡进行滴定，以最大程度地增强其免疫原性。由于所诱导的免疫反应将特异性针对免疫原性抗原，因此有可能对每种系统进行详细解析。每一种实验性或临床肿瘤，以及每一种抗微生物免疫反应，都将提供独特而有价值的信息。

每种个体人类癌症都具有其独特的肿瘤特异性抗原谱。PhDC 能够完成肿瘤抗原的必要分选与呈递，而无需事先在实验室中鉴定这些抗原。请注意，8-MOP 和 UVA 光线属于致癌物。

处理 8-MOP 和使用 UVA 光源时，应佩戴适当的防护装备并遵循安全操作规程。