Name: 一种新的生理免疫原树突状细胞生成方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学习利用TI设备通过血小板信号高效生成生理免疫原树突状细胞的方法。该技术适用于人类和小鼠，可诱导强效抗肿瘤T细胞反应，为癌症免疫治疗提供新策略。

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本工作获得了美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NIH-NCI）SPORE 项目资助 1 P50 CA121974（R. Edelson, M. Girardi）；美国国立卫生研究院癌症中心支持基金 3 P30 CA16359-28S1（R. Edelson, M. Girardi）；霍华德·休斯医学研究所培训奖学金（A. Vassall）；以及纽约心脏基金会（R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein）的资助。M. Bosenberg 还获得了 R01 CA196660-01 项目的部分支持。
作者感谢 Robert Tigelaar 博士在指导、建议和实验洞察方面提供的帮助。我们感谢弗劳恩霍夫生物医学工程研究所（Fraunhofer IBMT）的同事，特别是 Thorsten Knoll 博士，开发并提供了等效于 ECP 的 TI 反应室。Nicholas Theodosakis 在 YUMM 实验的初期阶段提供了帮助。我们感谢耶鲁大学 ECP 治疗中心的志愿献血者以及 Inger Christensen 及其专业团队在志愿者血液采集方面给予的支持。Wendell Yarbrough 博士和 Natalia Issaeva 博士慷慨地向我们提供了 SCC61 和 SCC61-E6/7 细胞系。在本项目的技术支持方面，我们感谢 Julia Lewis 博士在 FACS 实验方案方面的建议，以及耶鲁大学 FACS 核心实验室的 E. Menet、G. Tokmoulina 和 C. Cote。TI 板内细胞的显微动态图像由耶鲁大学医学院细胞生物学系及耶鲁 CINEMA 成像中心的 Felix Rivera-Molina 博士协助采集。影片制作由耶鲁大学医学院通讯办公室高级视频制作人 Andrew Osborne 监督完成。

本文所述所有小鼠实验方法均已获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合国家动物保健指南。所有人类研究均使用健康志愿者捐献的血液进行，且已获得书面知情同意。人体血液研究遵循公认的伦理准则（例如《赫尔辛基宣言》、CIOMS、贝尔蒙报告、美国通用规则），并经耶鲁大学人类研究审查委员会在方案编号0301023636下批准。
注意： 以下是描述用于小鼠同系肿瘤抗肿瘤治疗的转免疫化方案。
1. 同源 YUMM1.7 肿瘤移植
<ol>
	<li>根据目标肿瘤细胞系的特点，按照既定方案将同源肿瘤植入小鼠侧 flank 部位。 
	注意：以下方案描述的是 YUMM1.7 C57BL/6 小鼠黑色素瘤肿瘤模型。YUMM1.7 黑色素瘤细胞由耶鲁大学 Dr. Bosenberg 惠赠18。</li>
	<li>解冻一管冻存细胞，并在细胞传代一次后使用。将新鲜解冻的 YUMM1.7 细胞培养于添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素和 1% 非必需氨基酸的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 混合营养液（DMEM/F12）中，在标准组织培养条件下（37 °C，5% CO2）进行培养。
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到 60‒70% 时，加入足够量的胰蛋白酶-EDTA 溶液覆盖细胞培养皿或培养瓶底部（例如，T75 培养瓶加 4 mL），以消化收集细胞。</li>
		<li>将细胞培养容器在室温下静置 3‒4 分钟，期间轻轻敲击容器底部或侧壁，以促进细胞脱落。</li>
		<li>当大部分细胞已脱落时，按每 4 mL 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）加入 1 mL 胎牛血清（FBS）终止反应。用移液器将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养瓶，并将冲洗液一并加入同一收集管中。最后用 PBS 补充至总体积 15 mL。</li>
		<li>取少量细胞悬液进行细胞计数。</li>
		<li>在标准组织培养离心机中以 250 × g 离心 10 分钟，收集肿瘤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 YUMM1.7 细胞重悬于 PBS 中，调整细胞密度至 1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将 1 × 105 个 YUMM1.7 肿瘤细胞悬浮于 100 μL PBS 中，皮下注射至 4 至 6 周龄野生型雄性 C57BL/6J 受体小鼠的右侧 flank 部位；注射前根据机构指南对小鼠进行麻醉处理（例如，使用 3‒5% 异氟烷吸入麻醉，通过后肢足垫夹捏反射消失确认麻醉效果）。</li>
	<li>通过每隔一周使用游标卡尺测量肿瘤的垂直直径和高度，监测肿瘤体积。YUMM1.7 肿瘤体积计算公式为：（肿瘤长度 × 宽度 × 高度）/ 2。</li>
	<li>当肿瘤刚刚可触及时，开始进行跨免疫治疗；对于 YUMM1.7 肿瘤，通常为肿瘤植入后第 7‒10 天。</li>
</ol>
2. 用于跨免疫的外周血单个核细胞的采集
<ol>
	<li>通过面颊取血法从每只荷瘤小鼠采集 100‒150 μL 血液。</li>
	<li>在采集血液的同时，将每组处理小鼠（每组 5 只实验小鼠 + 5 只对照小鼠）的血液汇集至一个含有 5,000 U/mL 肝素的 15 mL 离心管中。每采集 100 μL 血液使用 10 μL 10% 肝素。 
	注意：采集过程中需频繁混匀离心管，以防止血液凝固。虽然对照组荷瘤小鼠可与实验组同时取血，但为了确保与处理组条件一致，“对照”血液可根据研究者判断选择弃去，或与处理组血液合并，以增加处理组实验所需的外周血单个核细胞（PBMC）数量。</li>
	<li>每 5‒10 只取血小鼠准备一个含 4 mL 淋巴细胞分离液（见材料表）的 15 mL 离心管。将采集自荷瘤小鼠的血液缓慢铺加在分离液上层。以 1,000‒1,500 x g 离心 20 分钟，以分离外周血单个核细胞（PBMC）与红细胞。</li>
	<li>离心结束后，收集上层血浆层，保留约 0.5 mL 液体在白膜层上方，其余血浆储存于 4 °C 以备后续使用（步骤 7.1）。</li>
	<li>将白膜层转移至洁净的 15 mL 离心管中，加入 PBS 至总体积 15 mL，然后在标准组织培养离心机中以 250 x g 离心 10 分钟，以收集 PBMC。</li>
	<li>小心用移液器吸除上清液，并通过轻弹管底重悬沉淀。切勿倾倒，因沉淀较软，易造成损失。向管中加入 2 mL ACK 红细胞裂解缓冲液（见材料表），以去除 PBMC 中残留的红细胞。冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 加至 15 mL，然后在标准组织培养离心机中以 250 x g 离心 10 分钟，收集 PBMC。</li>
	<li>小心用移液器吸除上清液，并通过轻弹管底重悬沉淀。切勿倾倒，因沉淀较软，易造成损失。 
	注意：在此步骤中，可根据实验需要对纯化的 PBMC 进行进一步处理。可根据需要耗竭或分离 PBMC 中的不同组分（如血小板、单核细胞及其他免疫细胞类型）。此外，也可按照步骤 3.3‒3.8 的操作，将 PBMC 替代 YUMM1.7 细胞，用 8-MOPA 处理 PBMC（可在第 4 节之前或之后进行，即在过板前或第 2 节之后、第 5 节之前）。此操作将削弱治疗的免疫原性，转而促进免疫耐受。</li>
	<li>对于每个处理组（每组 5 只实验小鼠 + 5 只对照小鼠），将 PBMC 沉淀重悬于 300 μL FBS 中。</li>
</ol>
3. 肿瘤细胞的8-MOP/UVA处理
<ol>
	<li>按照步骤 1.2–1.3 所述培养并收集 YUMM1.7 肿瘤细胞，以制备经 8-MOPA 处理的肿瘤细胞抗原来源。</li>
	<li>每 5 只小鼠为一个处理组，准备 2.5 × 106 个 YUMM1.7 肿瘤细胞。对于每个处理组，将细胞沉淀重悬于 FBS 中，终体积为 300 μL，细胞浓度为 2.5 × 106 个细胞/300 μL（约 8.33 × 106 个细胞/mL）。</li>
	<li>关闭组织培养超净台的照明灯，向 YUMM1.7 肿瘤细胞悬液中加入 8-MOP（见材料表），使终浓度为 100 ng/mL。 
	注意：8-MOP 是一种光活化型 DNA 损伤剂和致癌物。操作和分装时应谨慎，避免接触暴露的皮肤，并妥善丢弃废弃物。</li>
	<li>充分混匀细胞，用锡箔纸包裹细胞容器，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。</li>
	<li>通过向每个处理组（每组 5 只小鼠，含 2.5 × 106 个 YUMM1.7 肿瘤细胞）对应的 12 孔组织培养板孔中加入 1 mL FBS 进行预包被，并将加样后的培养板置于 4 °C 冰箱中冷藏 20 分钟。</li>
	<li>打开 UVA 光源以预热。 
	注意：UVA 光线具有致癌性。使用 UVA 光源时应迅速而谨慎操作，保护皮肤免受照射，并使用面罩或护目镜保护面部和眼睛。</li>
	<li>20 分钟后，将冷藏的 12 孔板（步骤 3.5）移至组织培养超净台内，吸去各孔中的 FBS，并向每孔加入 300 µL（含 2.5 × 106 个细胞/孔）经 MOP 处理的肿瘤细胞（来自步骤 3.4）。</li>
	<li>将含有细胞的培养板暴露于预热的 UVA 光源下，总照射剂量为 4 J/cm2。 
	注意：此处所述的 8-MOP 浓度和 UVA 剂量是针对 YUMM1.7 肿瘤细胞系校准的。对于每个实验用肿瘤细胞系，应进行 8-MOP/UVA 剂量梯度测试，以确定足以在暴露后 1 周内导致 100% 肿瘤细胞死亡的有效杀伤剂量。这一点在小鼠体内肿瘤免疫（TI）实验中至关重要，因为细胞将通过眶后途径重新注射（步骤 6.1），若存在未受损的肿瘤细胞，可能在受处理动物眼中形成肿瘤。作为参考，大多数肿瘤细胞系的有效剂量范围通常为 UVA 4–8 J/cm2，8-MOP 100–200 ng/mL。</li>
	<li>从每个孔中收集经 8-MOPA 处理的肿瘤细胞，轻轻旋转培养板并小心移液，以确保完全回收细胞。</li>
</ol>
4. 细胞的TI培养板传代
<ol>
	<li>对于每组5只小鼠，取300 μL相应PBMC（来自步骤2.11）与300 μL 8-MOP，加入一个1.5 mL锥形管中混合A经处理的肿瘤细胞（来自步骤 3.9）。混匀细胞。</li>
	<li>使用10 mL注射器向TI管路的“入口”和“出口”端注液（参见 
	材料表用含FBS的培养基填充管道。打开管夹以充满导管，充满后关闭管夹，再断开注射器，以确保FBS保留在导管内。</li>
	<li>使用 P1000 移液器将外周血单个核细胞与肿瘤细胞混合液（来自步骤 4.1）加入 TI 培养板中（参见 材料表）。将培养板以45°角持握° 角度适当，将移液器吸头牢固插入TI板进样口，缓慢加样，避免产生气泡。</li>
	<li>移液前先将吸头从进液口取出，再松开移液器活塞。孔板容量为 450 μL；将剩余细胞转移回 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>将装有FBS的管路、含有细胞的TI板以及装有剩余细胞的1.5 mL离心管一同置于37℃细胞培养箱中孵育 °在37°C孵育1小时。孵育结束后，通过重力排空TI导管，松开夹具。</li>
	<li>使用 P1000 移液器吸取 TI 平板中的细胞，将移液器吸头插入平板孔中时保持按钮完全按下。将平板保持在 45 度角° 角度并装满 P1000 移液枪吸头。将细胞放回原来的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>运行TI板时，将出口管连接至板上，并将TI板固定到板运行系统中。</li>
	<li>使用1 mL注射器从1.5 mL离心管中吸取600 μL PBMC与肿瘤细胞混合液，排除注射器中的气泡，将注射器连接至夹子打开的入口导管，缓慢注入液体直至充满导管末端。</li>
	<li>将入口管的自由端连接到TI板上，并继续轻柔地加载剩余体积。关闭入口夹。</li>
	<li>取下1 mL注射器，将入口管路连接至注射泵。将出口管路固定至洁净的1.5 mL离心管，用于收集细胞。</li>
	<li>将注射泵流速调节至 0.09 mL/min，但暂不启动泵。将 TI 板倾斜约 30°° 朝向注射泵一侧，使用TI板运行平台或任何其他方法（例如，在板的一端下方放置一个小的扁平物体）。</li>
	<li>小心松开入口管路上的夹子。启动注射泵，仔细观察TI板的填充过程，若发现气泡阻碍液体流动，可轻弹管路或TI板以排除气泡。</li>
	<li>当TI板完全装满后，将其倾斜约30° 在排空时沿相反方向进行。当所有细胞和液体均转移至1.5 mL锥形收集管中时，停止泵运行。</li>
	<li>洗涤TI板时，将入口管路从注射泵上断开，连接至装有600 μL FBS的1 mL注射器，然后按照步骤4.8‒4.9的程序进行操作。</li>
	<li>将注射泵流速调节至0.49 mL/min，松开入口夹，按照步骤4.12‒4.13所述运行TI板，将洗涤液收集至同一支1.5 mL离心管中。整个过程中需轻轻弹动或轻敲TI板，以帮助解离并洗脱任何贴壁的细胞。</li>
	<li>将收集用的1.5 mL离心管在台式微量离心机中以250 x g离心 g 8 分钟。弃去上清液。</li>
</ol>
5. 自体小鼠血清的制备用于过夜培养基
<ol>
	<li>采用机构批准的任何方法（例如眼眶取血、尾静脉取血、颊部取血或经心脏穿刺终末放血），从 10‒12 周龄的 C57BL/6J 小鼠采集血液，不使用任何抗凝剂。每需要 300 μL 血清，预计采集 1 mL 血液。 
	注意：实验中每 5 只小鼠的处理组需要 300 μL 血清。</li>
	<li>将血液在 4 °C 下静置过夜，使其凝固。</li>
	<li>以 3,000 x g 离心 15 分钟，沉淀凝固的血液。小心收集上层含血清的液体。 
	注意：血清可立即用于配制过夜细胞孵育培养基（步骤 6.1），也可保存以供后续实验使用。如需保存血清，应分装后于 -20 °C 冻存。</li>
</ol>
6. PBMC与抗原的过夜共孵育
<ol>
	<li>将外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤细胞沉淀（步骤 4.5）重悬于 2 mL 无色 RPMI 培养基中，其中含 15% 自体小鼠血清（按步骤 5 制备）。接种于 35 mm 非组织培养处理的无菌培养皿中，在标准组织培养条件下（37 °C，5% CO2）孵育过夜。 
	注意：若将 PBMC 与非细胞抗原（如肽段、纳米颗粒、蛋白质等）联合使用，则省略本方案的第 3 部分，直接从第 2 部分进入第 4 部分，并在本步骤 6.1 中将目标抗原加入 TI 培养皿中传代的 PBMC，进行过夜共孵育。</li>
	<li>次日，使用组织培养刮刀小心地将贴壁细胞从培养皿底部刮下，同时旋转培养皿以确保细胞收集均匀。将细胞收集至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>向培养皿中加入 2 mL PBS，重复刮取步骤，并将细胞收集至同一离心管中。用 1 mL PBS 冲洗 35 mm 培养皿，并将冲洗液加入同一离心管。</li>
	<li>在标准组织培养离心机中以 250 × g 离心 10 分钟以收集细胞。小心吸除上清液，并通过轻弹管底重悬细胞沉淀。切勿倾倒，因沉淀较松散，易造成损失。</li>
</ol>
7. 将TI处理的细胞重新注射到荷瘤小鼠体内
<ol>
	<li>将自体血浆（步骤 2.4 中制备）在 750 × g 条件下离心 15 分钟，以沉淀任何颗粒物。将细胞沉淀（来自步骤 6.4）重悬于 600 μL 自体血浆或 PBS 中。</li>
	<li>将细胞以每只小鼠 100 μL 的剂量注射至适当麻醉（例如，3‒5% 异氟烷吸入麻醉气体，通过后肢足垫夹捏反射消失确认麻醉效果）的荷瘤实验小鼠眶后静脉丛。如需要，可向对照组荷瘤小鼠单独注射 100 μL 自体血浆或 PBS。</li>
	<li>对于荷 YUMM1.7 肿瘤的小鼠，每周进行两次治疗（步骤 2–7.2），持续 3 周，共 6 次治疗。每周一和周四采集并处理荷瘤小鼠的外周血单个核细胞（PBMC）（方案第 2–4 节），并在过夜孵育后（方案第 5–7 节）于周二和周五重新输注。 
	注意：该治疗方案是针对 YUMM1.7 肿瘤在小鼠体内特定生长动力学而设计的。对于生长速度较慢或较快的其他肿瘤模型，可能需要调整治疗次数——分别相应增加或减少治疗频率。</li>
	<li>通过每两周一次的肿瘤直径和高度测量（最好在治疗给药时进行，即每周二和周五），使用游标卡尺监测肿瘤体积。当对照组肿瘤体积达到机构指南和规程允许的最大尺寸时，终止实验。</li>
</ol>
8. 人类血液小体积样本处理方案的调整
<ol>
	<li>通过从人血中分离外周血单个核细胞（PBMC）来调整本方案以适用于人源细胞。使用肝素作为抗凝剂，并采用任何常用的PBMC分离方案。</li>
	<li>为获得最佳实验结果，确保分离得到的PBMC组分中含有生理数量的血小板。使用标准血液学计数仪在PBMC分离前后监测血小板计数。</li>
	<li>若使用人源细胞抗原，参照第3节中针对YUMM1.7细胞的步骤处理人源抗原细胞，并相应滴定8-MOP和UVA的剂量。</li>
	<li>执行第4节中所述的板传代步骤，每块TI板最多使用3 × 107个PBMC。</li>
	<li>按照第6节所述方法，将PBMC与所选的细胞或其他抗原共培养过夜，但在步骤6.1中，用15%人AB血清替代自体小鼠血浆作为过夜培养基成分。</li>
	<li>将所得细胞用于任何所需的检测。例如，与抗原特异性T细胞共培养，以观察由TI处理细胞引发的抗原特异性T细胞反应。</li>
</ol>

<ol><li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li>
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耶鲁大学拥有理查德·埃德尔森教授树突状细胞研究衍生的专利，这些专利已授权给一家耶鲁大学的初创公司Transimmune AG。理查德·埃德尔森和迈克尔·吉拉迪担任Transimmune AG的科学顾问，而奥尔加·索博列夫是Transimmune AG的员工。然而，Transimmune AG目前尚无任何商业化产品，仅以合作方式生产本文中所使用的Transimmune培养板。未来，这三位作者有可能从这些研究成果的商业化中获益。

上述微型化装置和实验方案首次实现了在小鼠实验系统及少量人血液样本中对ECP机制的高效实验室研究。这是一项重大进展；例如，我们首次利用该技术在小鼠模型中证明了转免疫疗法对实体瘤的有效性11，为未来在人类肿瘤学中的类似应用开辟了可能性。
在开发出本文所述的转免疫化装置和方法之前，人们无法全面研究ECP的所有方面。在小鼠模型中，尽管可以通过在培养皿中处理细胞在一定程度上模拟治疗中的8-MOPA环节12,20，但该方法无法整合板通道过程，而板通道已被证明可提供动态的血小板相互作用，对ECP生理条件下树突状细胞（DC）的激活至关重要14。而在人类研究中，流动组分虽完全具备，却缺乏选择性地将特定细胞组分暴露于8-MOPA或保护其免受其影响的能力21,22。这阻碍了对ECP机制的全面理解，以及其在免疫激活或免疫耐受方面的优化。此外，临床ECP设备所需的血量较大，限制了科学研究的开展。本文首次描述的微型化ECP装置和方案，使得高效、完全灵活且可调节的实验室ECP建模成为可能。此外，TI板还允许通过显微镜实时观察和监测板内细胞间的相互作用。
为了确保该方案在体内和离体系统中均能成功，关键在于所处理的外周血单个核细胞（PBMC）必须含有能够被激活为功能性树突状细胞（DC）的单核细胞。为使这一激活过程顺利进行，还必须确保PBMC组分中含有生理数量的健康且可激活的血小板，并严格遵循TI血小板传代方案。为了引导新激活的DC产生特异性免疫反应，必须为其提供抗原。我们发现，用于诱导抗肿瘤免疫最有效的方法是将新激活的DC与含有抗原并经8-MOPA处理的肿瘤细胞共孵育过夜。这种方法的额外优势在于，无需预先了解肿瘤抗原的具体信息，即可由DC自行选择抗原，从而引发免疫原性抗肿瘤反应。然而，在已知抗原的情况下，我们在离体系统中使用游离肽段作为共孵育抗原也取得了一定成效。对于具有免疫原性的应用，DC本身应避免接触8-MOPA。最后，在体内实验中，应选用具备抗肿瘤免疫能力的动物模型。跨免疫化（Transimmunization）的作用机制是生成活化的、抗原特异性的DC，这些DC在体内启动天然免疫和适应性免疫应答。若经处理的小鼠体内自然杀伤细胞（NK）、CD4或CD8 T细胞功能受损或缺失，将会影响该方案的效果5,11。
尽管本文所述方案是一种已在小鼠实体同基因肿瘤模型中优化的原理验证性方法，但它仍揭示了诸多研究机遇。目前，体外光化学疗法（ECP）在肿瘤学中的作用机制才刚刚开始被阐明，对其深入理解仍有广阔空间。更广泛而言，能够生成生理活化的小鼠和人树突状细胞（DCs），并选择性地引导其产生抗原特异性免疫应答，这一能力在癌症之外也具有多种潜在应用。此外，若能采用类似方法，却将树突状细胞导向抗原特异性免疫耐受——正如ECP本身所表现出的诱导耐受效果所示——同样具有广泛的医学意义。通过本方法，我们希望为所有对生理性树突状细胞治疗感兴趣的研究者提供可用的工具，并开辟一条富有成效的研究路径。

体外光化学疗法（ECP）是一种成熟的免疫治疗方法，已在全球众多大学医学中心广泛应用。ECP的临床应用得益于其独特的选择性、安全性以及双向疗效，这些特性与生理免疫系统本身相似，提示ECP可能与机体免疫系统协同作用。ECP在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中可选择性地针对恶性细胞产生免疫应答。1,2，并在移植、自身免疫及移植物抗宿主病（GvHD）情境中对特定抗原选择性诱导免疫耐受3,4ECP 的免疫原性体现在其对 CTCL 中完整 CD8+ T 细胞区室的依赖性5而特异性则体现在ECP具有非常有利的不良反应谱，在移植和移植物抗宿主病（GvHD）情况下无脱靶性免疫抑制作用，在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中亦未增加机会性感染风险，尽管在此过程中可能伴随恶性T细胞的清除而丢失部分非致病性T细胞克隆。
鉴于体外光化学疗法（ECP）的临床重要性，深入理解其作用机制有望将ECP的治疗范围扩展至更广泛的癌症和免疫性疾病，这一前景已引发国际关注。为此，已举办并报道了两次国家级认证的研讨会：一次是美国国立卫生研究院（NIH）主办的科学现状专题研讨会6，另一次是美国血液净化学会（ASFA）的共识会议7，旨在加快明确ECP抗肿瘤和诱导免疫耐受效应中的主要细胞贡献者。
迄今为止，尽管已有大量发表的研究试图阐明ECP的作用机制，但科学进展仍面临两大主要障碍。首先，在实验研究环境中，由于缺乏能够完全反映ECP的细胞效应和体内效应、并适用于动物模型的微型ECP装置，对ECP机制的研究受到限制。其次，在临床环境中，对ECP处理样本的深入实验室分析也受到限制，原因是可供研究的经ECP处理的患者免疫细胞数量有限；这些细胞的获取依赖于治疗中心的可及性，且受到患者输注时间安排以及伦理上对完整保留患者回输白细胞样本要求的制约。
为克服阻碍ECP研究进展的障碍，我们着手开发一种微型ECP装置，以尽可能模拟该疗法的关键要素。标准ECP治疗包括将患者经白细胞单采术富集的白细胞，通过一个厚度为1 mm、可透过长波紫外线（UVA）的透明塑料板6,8。在此板中，白细胞暴露于8-甲氧基补骨脂素（8-MOP）——一种光激活剂，在UVA照射下短暂转化为活性形式（8-MOPA），该活性形式可通过与姐妹DNA链上的嘧啶碱基发生双价结合，实现DNA交联9,10。处理后的8-MOPA作用白细胞被收集，并通过静脉回输给患者。
由于ECP本身是一种双向疗法，在癌症治疗中具有免疫激活作用，而在移植、自身免疫和移植物抗宿主病（GvHD）环境中则具有诱导免疫耐受的作用。为了明确区分，我们将模型中ECP的免疫激活模式命名为“跨免疫化”（transimmunization），而将诱导耐受的模式命名为“跨耐受化”（transtolerization）。我们首先聚焦于跨免疫化模式的研究。我们近期报道了一种可微型化且可放大的从小鼠到人体的ECP装置，即跨免疫化（TI）室或跨免疫化板，及其相应操作方案，该系统可在癌症背景下重现人ECP装置的细胞水平及体内效应11。
为了使体内转免疫模型尽可能接近临床实际情况，我们在皮下接种的同系小鼠肿瘤生长至可触及后，才启动免疫治疗，从而在已建立的肿瘤模型中验证该方案的疗效。类似于皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中的体外光化学疗法（ECP），在黑色素瘤YUMM1.7模型中验证概念可行性的转免疫方案使用来自荷瘤动物的外周血单个核细胞（PBMC）。这些细胞在流动条件下通过TI板。尽管可以在微型腔室中对细胞进行8-MOPA处理，但更推荐单独进行该步骤，以确保仅有目标细胞类型暴露于8-MOPA。早期研究表明，ECP的耐受性效应由经8-MOPA损伤的抗原呈递细胞介导12，而免疫激活效应则需要8-MOPA对靶向肿瘤细胞的损伤11。在转免疫方案中，可根据需要选择性地将肿瘤细胞或免疫细胞暴露于8-MOPA。由于已有研究显示，延长8-MOPA损伤的肿瘤细胞与ECP诱导的树突状细胞（DC）之间的接触时间，可显著增强临床ECP的免疫治疗能力13，因此我们在方案中加入了过夜共孵育步骤。经过过夜孵育后，将处理过的细胞回输至荷瘤动物体内。
该系统在已建立同系肿瘤的小鼠中可靠地抑制了肿瘤生长，并启动了特异性的抗肿瘤免疫反应11，使我们能够解析ECP临床抗肿瘤疗效的作用机制。在多项研究中，我们已证明ECP免疫反应是通过TI板中体外血小板活化启动的14,15。活化的血小板随后促进单核细胞向树突状细胞的成熟转化14，从而产生生理状态的树突状细胞（DCs）。新形成的单核细胞来源的树突状细胞能够交叉呈递来自8-MOPA损伤肿瘤细胞的内化抗原，以激活抗原特异性T细胞反应16。然而，正如先前所提示12,17，8-MOPA对新生树突状细胞自身的损伤可能抵消甚至逆转抗肿瘤效应11，这为ECP耐受性提供了机制上的解释。
TI 培养板还被用于从人外周血单个核细胞（PBMC）中生成生理活化的树突状细胞（DC）。与小鼠研究类似，人源 TI 培养板衍生的 DC 依赖于在血小板存在下经培养板传代而生成，其表型与临床 ECP 培养板中产生的 DC 完全相同，并且能够高效地加工和交叉呈递人肿瘤抗原，从而激活人 T 细胞11,16。
在揭示ECP免疫治疗机制的过程中，我们因此发现了一种快速生成具有所需抗原特异性的生理性小鼠和人树突状细胞的方法，且这些细胞可进行功能调控。该创新性的TI装置及实验方案在ECP研究与治疗以及癌症免疫治疗领域具有重要的潜在价值，并可广泛应用于任何需要生理性、功能性树突状细胞的研究领域，无论其目标是诱导免疫还是诱导耐受。我们希望本论文能为对这些研究方向感兴趣的科研人员提供必要的技术工具。

<table><tbody><tr><td>8-MOP（UVADEX 20 μg/mL，10 mL）</td><td>Therakos, Inc</td><td>仅限处方使用，NDC 编号：64067-0216-01</td><td>实验步骤3和8——小鼠和人细胞的8-MOP/UVA处理</td></tr><tr><td>AB型血清</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>14-498E</td><td>第8.5步 - 人外周血单个核细胞的过夜培养</td></tr><tr><td>ACK红细胞裂解缓冲液</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td>实验步骤2 - 小鼠外周血单个核细胞制备</td></tr><tr><td>带主动排废功能的麻醉台式 V1 系统</td><td>VetEquip</td><td>901820</td><td>步骤1和7——小鼠皮下肿瘤移植与TI给药</td></tr><tr><td>自体小鼠血浆</td><td>在实验室中制备</td><td>n/a</td><td>按照方案第2.4步制备，随后使用&amp;nbsp; 7.1 - 小鼠TI治疗给药</td></tr><tr><td>自体小鼠血清</td><td>在实验室中制备</td><td>n/a</td><td>按方案第5步制备，用于第6.1步——小鼠PBMC的过夜培养</td></tr><tr><td>C57Bl/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>0000664</td><td>实验步骤1、2、5和7——小鼠肿瘤注射、血液/血清采集及治疗回输</td></tr><tr><td>脸颊采血 GoldenRod 采血针，5 μm</td><td>Medipoint</td><td>9891620</td><td>实验步骤2 - 小鼠外周血单个核细胞制备</td></tr><tr><td>澄清的RPMI</td><td>Gibco（LifeTech 品牌）</td><td>11835-030</td><td>第6步和第8步——小鼠/人外周血单个核细胞的过夜培养</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco（LifeTech 品牌）</td><td>11330-032</td><td>步骤1和2——YUMM1.7细胞培养</td></tr><tr><td>EasyGrip 培养皿，35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>步骤5和8——小鼠/人外周血单个核细胞的过夜培养</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL 圆底离心管</td><td>DOT 科学</td><td>1700-GMT</td><td>步骤 1-8</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清，热灭活）</td><td>SAFC 生物科学</td><td>12306C-500mL</td><td>步骤1-4——YUMM1.7细胞培养、8-MOP/UVA处理细胞、TI平板</td></tr><tr><td>Hemavet 950FS 血液分析仪</td><td>Drew Scientific</td><td>HV950FS</td><td>第8.2步 - 监测人血小板数量</td></tr><tr><td>肝素 5,000U/mL</td><td>麦克森包装服务</td><td>949512</td><td>第2步和第8步——小鼠和人外周血单个核细胞（PBMC）的制备</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>雅培实验室</td><td>5260-04-05</td><td>步骤1和7——小鼠皮下肿瘤移植与TI给药</td></tr><tr><td>Lympholyte M 淋巴细胞分离液</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5035</td><td>实验步骤2 - 小鼠外周血单个核细胞制备</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco 由 LifeTech 提供</td><td>11140-050</td><td>步骤1和2——YUMM1.7细胞培养</td></tr><tr><td>PBS（1× DPBS，不含 Ca²⁺，不含 Mg²⁺）</td><td>Gibco by LifeTech</td><td>14190-144</td><td>步骤1-7</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco（LifeTech 品牌）</td><td>15140-122</td><td>步骤1和2——YUMM1.7细胞培养</td></tr><tr><td>聚丙烯15 mL锥形管</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>步骤 1-8</td></tr><tr><td>可编程双通道注射泵</td><td>New Era泵系统公司</td><td>型号 NE-4000</td><td>第4步和第8步：运行TI板</td></tr><tr><td>眶后注射针头，27G x 1/2</td><td>BD 生物科学</td><td>305109</td><td>第7步——小鼠TI治疗给药</td></tr><tr><td>10 mL 注射器（LUER-LokTip）</td><td>BD 生物科学</td><td>309604</td><td>步骤4、8——运行TI板</td></tr><tr><td>1 mL 注射器（滑动式针头）</td><td>BD 生物科学</td><td>309659</td><td>步骤 1、4、7、8</td></tr><tr><td>TI 培养皿及管路套装</td><td>Transimmune AG</td><td>非商业供应&amp;nbsp;</td><td>请联系 Prof. R. Edelson 或 Transimmune 以合作方式获取该设备。</td></tr><tr><td>TI平板运行平台</td><td>Transimmune AG</td><td>非商业供应&amp;nbsp;</td><td>请联系 Prof. R. Edelson 或 Transimmune 以合作方式获取该设备。</td></tr><tr><td>组织培养瓶，T75（75 cm²）</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>步骤1、2、6和8——小鼠与人类细胞培养</td></tr><tr><td>组织培养板，12孔</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td>第3步和第8步——小鼠与人源细胞的8-MOP/UVA处理</td></tr><tr><td>组织培养刮刀</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td>第6步和第8步——小鼠/人外周血单个核细胞的过夜培养</td></tr><tr><td>0.25% (1x) 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco（LifeTech 品牌）</td><td>25200-056</td><td>步骤1和2——YUMM1.7细胞培养</td></tr><tr><td>25G × 5/8 肿瘤注射针</td><td>BD 生物科学</td><td>305122</td><td>实验步骤1 - 小鼠皮下肿瘤接种</td></tr><tr><td>UVA 照射仪</td><td>强生公司</td><td>非商业供应&amp;nbsp;</td><td>该装置由 J 专门研发&amp;供 R. Edelson 教授实验室使用。实验室提供多台设备供合作使用；如需使用，请联系 R. Edelson 教授。其他UVA照射仪可商业购得，但我们未进行过测试。</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto 2 成像系统</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>荧光成像仪器</td></tr></tbody></table>

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

体外光化学疗法（ECP）是一种广泛用于皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的癌症免疫疗法，在全球超过350家大学医学中心应用。尽管ECP具有明确的临床疗效和优异的安全性，但其作用机制尚未完全阐明，部分原因在于缺乏可用于实验室研究的ECP模型。为克服这一障碍，并建立一个简单、用户友好的ECP研究平台，我们开发了一种小型化的临床ECP白细胞处理装置，适用于小鼠模型及少量人血液样本的研究。该装置被称为转免疫化（Transimmunization, TI）室或TI板。在一系列关键实验中，该微型装置被用于制备一种细胞疫苗，在多种同基因小鼠肿瘤模型中持续诱导出治疗性的抗肿瘤免疫反应。通过从实验体系中逐一去除特定因素并评估其对免疫反应的贡献， 体内 抗肿瘤反应，我们进一步阐明了ECP免疫潜力的关键机制驱动因素。综上所述，我们的研究结果表明，ECP的抗肿瘤效应由树突状细胞（DC）启动，这些树突状细胞在TI板中通过血液单核细胞与血小板的生理相互作用自然产生，并负载了来自肿瘤细胞的抗原，而这些肿瘤细胞的凋亡性细胞死亡通过光激活型DNA交联剂8-甲氧基补骨脂素联合UVA照射（8-MOP）进行精确调控A。当回输至小鼠体内时，这种细胞疫苗可诱导出特异且可转移的抗肿瘤T细胞免疫反应。我们验证了TI室同样适用于人血液处理，所获得的人树突状细胞在活化状态和表型特征上与临床ECP室所获得的细胞完全相当。本文所述方案旨在用于小鼠和人类的ECP研究，以及利用8-MOP可控地生成凋亡肿瘤细胞A以及快速制备适用于多种应用的生理性人和小鼠单核细胞来源的树突状细胞。

我们近期开发了一种从小鼠到人类均可扩展使用的微型ECP装置——TI板（图1A），并设计了相应的治疗方案。该装置与方案可重现免疫性ECP的关键细胞和体内特征，称为“跨免疫化”（transimmunization）。
原理验证性小鼠体外免疫化方案11（图1B）包括将荷瘤小鼠的外周血单个核细胞（PBMC）与经8-MOPA处理后发生凋亡的肿瘤细胞共同通过体外免疫化（TI）板进行循环。值得注意的是，TI室为透明结构，尺寸与标准显微镜载玻片一致，可在实验过程中的任意时间点方便地观察TI板内细胞间的相互作用（视频1）。TI板中活化的免疫细胞与经8-MOPA处理的凋亡肿瘤细胞共同孵育过夜，以促进肿瘤细胞的摄取、加工以及肿瘤抗原向树突状细胞（DCs）的传递。次日，将共孵育后的细胞混合物回输至荷瘤动物的血液循环中。对照组动物接受相同的采血操作，以排除淋巴细胞减少对肿瘤生长可能产生的影响，但仅回输PBS。实验期间持续监测所有动物的肿瘤生长情况。
在使用YUMM1.7同源小鼠黑色素瘤模型的研究中18，跨免疫治疗方案每周重复两次，持续三周，每只动物共接受六次治疗（图1B）。所有接受治疗的动物（>100只）均表现出良好的耐受性，并且在经过两年内开展的9次独立实验观察发现，与对照组动物相比，治疗组动物的YUMM1.7肿瘤生长 consistently 受到抑制（Figure 2A,B）。结果展示了所有实验中跨免疫治疗组与对照组动物的累积肿瘤生长数据（图2A），以及单次实验中个别动物的代表性肿瘤生长曲线，以反映该系统的变异性（图2B）。
我们发现，该方案的成功关键取决于处理后的PBMC中存在单核细胞、PBMC组分中存在血小板，以及TI血小板过夜培养步骤。当省略血小板过夜培养步骤，或从PBMC组分中去除血小板或单核细胞时，治疗效果便不再出现（图3A）。该治疗还要求存在凋亡的肿瘤细胞。在缺乏免疫细胞或抗原来源的情况下，或存在不匹配抗原时（例如，使用MC38结肠癌细胞治疗携带YUMM1.7肿瘤的小鼠），该疗法无效（图3B）。要获得免疫诱导效果，还必须避免PBMC接触8-MOPA。暴露于8-MOPA的PBMC不仅会消除甚至可能逆转抗肿瘤免疫反应（图3C），还会抑制未暴露细胞的免疫诱导潜能，例如在一项实验中，等量的8-MOPA暴露和8-MOPA保护的PBMC共同使用时，未观察到任何抗肿瘤效应（图3C）。
使用人外周血单个核细胞（PBMC），TI室及跨免疫化方案可成功将单核细胞活化为树突状细胞（DC），其细胞表面及细胞内活化标志物与临床ECP板所获得的活化效果无差异。表1）。与小鼠研究中一样，DC 活化（图 4A）以及通过转免疫化生成的树突状细胞处理和呈递抗原的能力（图4B,C) 的效果在很大程度上依赖于PBMC中血小板的存在以及TI血小板的传代。经Transimmunization激活的人树突状细胞能够有效加工并交叉提呈肽类抗原（图4B），或来自完整8-MOP的抗原A-暴露的人类肿瘤细胞，用于在体外实验中激活人类抗原特异性T细胞系（图4C），以TI和血小板依赖的方式（图4B、C).
<img alt="用于同基因小鼠肿瘤过程的聚苯乙烯转免疫化板及TI处理示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：转免疫化（TI）装置与实验流程示意图。（A）转免疫化治疗装置（TI板）的结构示意图及规格。（B）转免疫化治疗实验流程的示意图。简而言之，将同基因肿瘤细胞皮下（s.c.）接种至实验动物；对可触及肿瘤的动物，每周两次采血，从血液中分离外周血单个核细胞（PBMC），在存在8-MOP/UVA处理的肿瘤细胞条件下，使PBMC流经自体血小板包被的TI板，随后将PBMC与肿瘤细胞共同孵育过夜，再将细胞静脉回输至同一只荷瘤动物体内。整个实验过程中定期测量肿瘤体积。本图经11修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤体积比较图，PBS 对比转免疫治疗；30 天内治疗效果显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：转免疫治疗控制 YUMM1.7 黑色素瘤同源肿瘤的生长。（A）接种 1 × 105 个 YUMM1.7 肿瘤细胞的 C57BL/6 小鼠随时间变化的 YUMM1.7 肿瘤体积，接受六次转免疫治疗（黑线）或六次对照治疗（灰线）。数据汇总自两年内进行的九次独立实验。（B）单次代表性 YUMM1.7 转免疫实验的数据，每条线代表一只小鼠的肿瘤生长情况。（A 和 B）所有实验中的“PBS 对照”小鼠与实验动物接受相同的采血时间表，但接受六次无菌 PBS 再输注。误差线表示标准误（SEM），使用 Sidak 多重比较检验计算每个时间点的 p 值；**，p = 0.0013；****，p &lt; 0.0001。本图经修改自11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤体积增长曲线；免疫化、耗竭与对照实验；YUMM1.7分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：跨免疫化（transimmunization）依赖于TI血小板通过PBMC组分中的单核细胞和血小板，以及抗原匹配肿瘤细胞经8-MOPA处理和PBMC免受8-MOPA处理。（A）接种了1×105个YUMM1.7肿瘤细胞的C57BL/6小鼠的YUMM1.7肿瘤体积随时间变化曲线，分别接受六次跨免疫化治疗（实心黑线）、六次对照治疗（实心灰色线），或在血小板通过步骤前使用抗CD11b和抗CD41耗竭试剂盒分别耗竭PBMC中的单核细胞或血小板后的TI治疗，或省略血小板通过步骤（虚线）。（B）接种了1×105个YUMM1.7肿瘤细胞的C57BL/6小鼠的肿瘤体积随时间变化曲线，分别接受六次跨免疫化治疗（实心黑线）、六次对照治疗（实心灰色线）、单独PBMC（虚线）、单独经8-MOPA处理的YUMM1.7细胞，或使用经8-MOPA处理的MC38肿瘤细胞进行TI治疗（虚线）。（C）接种了1×105个YUMM1.7肿瘤细胞的C57BL/6小鼠的肿瘤体积随时间变化曲线，分别接受六次跨免疫化治疗（实心黑线）、六次对照治疗（实心灰色线）、六次在血小板通过步骤前立即对PBMC整体暴露于8-MOPA的TI治疗、六次在血小板通过步骤后立即对PBMC整体暴露于8-MOPA的TI治疗，或六次将血小板通过后的TI细胞与等量经8-MOPA照射整体处理的PBMC以1:1混合后的治疗（虚线）。（A、B和C）所有实验中，“PBS对照”小鼠与实验动物同步采血，但接受六次无菌PBS再输注。数据来自代表性实验。误差条表示标准误（SEM），各时间点P值采用Sidak多重比较检验计算；*，p &lt; 0.05；**，p &lt; 0.01；***，p &lt; 0.001；****，p &lt; 0.0001；NS = 差异无统计学意义。本图经修改自11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="ICAM1、PLAUR、CCL2、CCL5、IFNγ 水平的柱状图；血小板耗竭效应的研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59370/59370fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：TI 方案结合 TI 培养室可快速诱导人外周血单个核细胞（PBMC）中树突状细胞（DC）的成熟、特异性活化谱型及T细胞活化能力，该过程依赖于血小板过柱步骤及血小板的存在。 
A. 对新鲜分离的人 PBMC（“对照”）、经 TI 方案处理的 PBMC（“TI”）以及在血小板过柱步骤中省略该步骤、或使用抗-CD41 磁珠试剂盒在过柱前耗竭血小板、或同时执行上述两种操作的 TI 处理 PBMC 中 CD11c+ 细胞表达所示标志物的流式细胞术分析。数据汇总了来自三位献血者的六次独立实验。柱状图表示均值，误差线表示标准误（SEM）。每次比较的 P 值通过配对 t 检验计算；*，p &lt; 0.05；**，p &lt; 0.01。图中各面板经修改自11。 B. 含血小板或经血小板耗竭的 TI 处理人 PBMC 分别与无关肽段（SIINFEKL）或头颈部鳞状细胞癌相关 HPV E7 蛋白的长肽段共孵育过夜。随后将 PBMC 用于刺激一条特异性针对 E7 肽段的人 CD8 T 细胞系。T 细胞活化程度通过培养 5 天后 IFNγ 的产生量进行测定。（C）含血小板或经血小板耗竭的 TI 处理人 PBMC 与经 8-MOPA 处理的头颈部鳞状细胞癌细胞系 SCC61 共孵育过夜，该细胞系分别表达（SCC61 HPV E6/7）或不表达（SCC61 无 HPV）抗原性 HPV E6 和 E7 蛋白19。随后将 PBMC 用于刺激一条特异性针对 E7 肽段的人 CD8 T 细胞系。T 细胞活化程度通过培养 5 天后 IFNγ 的产生量进行测定。（B 和 C）数据展示的是每组三个重复的代表性实验结果。柱状图表示均值，误差线表示标准误（SEM）。每次比较的 P 值通过 Sidak 多重比较检验计算；***，p &lt; 0.001；****，p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/59370fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标志物</td>
			<td>参数</td>
			<td>未处理组</td>
			<td>采用TI方案的ECP板</td>
			<td>采用TI方案的TI板</td>
			<td>ECP与TI的p值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>100.1 ± 42.4</td>
			<td>439.8 ± 152.5</td>
			<td>417.7 ± 152.2</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80</td>
			<td>Δ %</td>
			<td>3.9 ± 1.1</td>
			<td>22.3 ± 7.2</td>
			<td>24.5 ± 7.2</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>0.3 ± 0.2</td>
			<td>53.3 ± 9.7</td>
			<td>51.4 ± 17.4</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.8 ± 1.7</td>
			<td>103.9 ± 23.4</td>
			<td>87.1 ± 17.6</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLAUR</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>54.5 ± 12</td>
			<td>721.4 ± 183.6</td>
			<td>528.7 ± 135.5</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM1</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>12.2 ± 1.6</td>
			<td>179.6 ± 28.5</td>
			<td>192.5 ± 25.4</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITGB5</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>53.6 ± 25.7</td>
			<td>97.1 ± 31.6</td>
			<td>103.8 ± 32.8</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL2 (MCP-1)</td>
			<td>Δ %</td>
			<td>0.6 ± 0.5</td>
			<td>70.1 ± 6.7</td>
			<td>55.2 ± 8.9</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL5</td>
			<td>Δ %</td>
			<td>0.7 ± 0.4</td>
			<td>39.1 ± 7.2</td>
			<td>41.5 ± 4.7</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL16</td>
			<td>Δ %</td>
			<td>0.3 ± 0.2</td>
			<td>28.0 ± 8.8</td>
			<td>35.3 ± 11.7</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD105 (endoglin)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>3.6 ± 0.3</td>
			<td>124.3 ± 25.4</td>
			<td>141.8 ± 33.2</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD112 (nectin 2)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.9 ± 1.8</td>
			<td>47.3 ± 5.2</td>
			<td>50.9 ± 9.2</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD120a (TNFR-1)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>10.1 ± 2.6</td>
			<td>2.2 ± 1.4</td>
			<td>1.8 ± 1.1</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD137L (4-1BBL)</td>
			<td>Δ MFI</td>
			<td>2.9 ± 1.5</td>
			<td>1.0 ± 0.4</td>
			<td>1.2 ± 0.6</td>
			<td>NS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：使用TI室的TI方案可快速诱导树突状细胞成熟，其效果与使用临床ECP室的TI方案相当。 对“未经处理”的新鲜分离外周血单个核细胞（PBMC）、经临床ECP板按TI方案处理后并经一夜孵育分析的PBMC（“ECP板加TI方案”），以及按TI方案处理后并经一夜孵育分析的PBMC（“TI板加方案”）中活的人CD11c+细胞内所示标志物相对于相应IgG对照的变化进行流式细胞术（FACS）分析。对于整个细胞群体均发生变化的标志物（如HLA-DR），数据以平均荧光强度（MFI）的变化表示；而对于仅部分细胞表达的标志物（如CCL2），则以活CD11c+ PBMC中标志物阳性细胞百分比的差异表示。数据汇总了来自三位献血者的六次独立实验结果，每个标志物的数据均表示为平均值±均值标准误（SEM）。各组间比较的P值采用配对t检验计算；NS = 差异无统计学意义。本表经11修改。
<img alt="血小板沉积显微图像；初始暴露、静态孵育、细胞排列研究。" src="/files/ftp_upload/59370/59370mov1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：TI 板内血小板与免疫细胞相互作用的活细胞成像。 
外周血单个核细胞（PBMC）按上述第 2 节方案制备，并按照第 4 节所述方法暴露于转免疫化板（TI plate），但第 4.2.3 步的静态孵育时间由 1 小时缩短至 30 分钟。在 TI 实验过程中，TI 板（尺寸与标准显微镜载玻片相同）被安装至荧光成像系统的载物台夹片中，在加样（4.2.2）、孵育（4.2.3）和灌流（4.3.5）阶段，于 37 °C 条件下以 40 倍放大倍数对板内细胞进行实时成像。使用“自动扫描程序”软件连续采集图像并生成视频。视频下方的图注标明了细胞所处的实验步骤。视频中的箭头和圆圈及其对应图注标示出感兴趣的细胞和区域。视频右下角始终显示 10 μM 比例尺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59370/Video1.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>

转免疫化（TI）装置或培养板及相关实验方案已在实验条件下开发，用于模拟体外光化学疗法（ECP）的关键特征，从而生成生理活化且可调控的树突状细胞（DCs），用于癌症免疫治疗。

体外光化学疗法（ECP）是一种广泛用于皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的癌症免疫疗法，已在全球350多家大学……

生理性的树突状抗原提呈细胞（称为PhDC）是启动抗原特异性T细胞免疫与耐受的免疫主控开关。本文阐述了一种高效制备PhDC的方法。目前树突状细胞的临床应用受到限制，原因在于制备过程中所使用的非生理性细胞因子方法。我们的方法通过高效地利用血小板信号在人和小鼠中诱导单核细胞向树突状细胞（DC）转化，从而克服了该问题。这些血小板诱导的树突状细胞（PhDC）不依赖于体内无法实现的细胞因子条件，因此能够在已建立肿瘤的人和小鼠中诱导强烈的临床抗肿瘤T细胞反应。这种跨物种的血小板启动单核细胞向PhDC成熟的过程具有广泛的实验应用价值。PhDC 可用于研究树突状细胞的生理学特性，促进对免疫原性癌症产生治疗性抗肿瘤免疫反应，并在个性化抗微生物疫苗开发中展现出潜力。该实验体系具有新颖性，其多个环节——如塑料培养室的包被、肿瘤细胞经 8-MOP/UVA 处理、流体条件控制以及单核细胞的释放——通过视觉化展示最为清晰。本实验操作将由本实验室技术员 Eve Robinson 进行演示。为收集外周血单个核细胞，首先准备一个15毫升离心管，每取5至10只荷瘤小鼠的血液，加入4毫升淋巴细胞分离液。然后将从荷瘤小鼠收集的血液缓慢叠加于分离液上方。以1,000至1,500 × g离心20分钟，使外周血单个核细胞与红细胞分离。离心结束后，收集上层血浆层，保留0.5毫升液体在白细胞层（buffy coat）上方，于4°C保存以备后续使用。接着，将白细胞层转移至一个含有PBS并定容至15毫升的洁净15毫升离心管中，在标准组织培养离心机中以250 × g离心10分钟，以收集外周血单个核细胞（PBMC）。离心结束后，小心吸去上清液，并轻弹管壁以重悬细胞沉淀。然后向管中加入2毫升ACK红细胞裂解缓冲液，以去除PBMC中残留的红细胞。将PBMC置于冰上孵育10分钟。用PBS将管内体积补至15毫升，并在标准组织培养离心机中以250 × g离心10分钟，以收集PBMC。小心地用移液枪吸去上清液，并轻弹管壁以松动沉淀。将沉淀重悬于 300 微升胎牛血清（FBS）中。为制备每处理组的 YUMM1.7 肿瘤细胞，首先将肿瘤细胞沉淀以每 300 微升含 250 万细胞的浓度重悬于 FBS 中。关闭组织培养罩的灯光后，向YUMM1.7肿瘤细胞悬液中加入8-甲氧基补骨脂素，使其终浓度为100纳克/毫升。随后混匀细胞，用铝箔包裹细胞容器，并在37摄氏度下孵育20分钟。为预包被一块12孔组织培养板，每个五只小鼠的处理组对应的一个孔中加入1毫升胎牛血清，并将培养板置于4摄氏度冰箱中冷藏20分钟。20分钟后，在组织培养罩内，从孔中移除FBS，并每孔加入300微升经补骨脂素处理的肿瘤细胞。随后将含细胞的培养板暴露于预热的UVA光源下，总照射剂量为每平方厘米4焦耳。为收集每孔中经8-甲氧基补骨脂素/UVA处理的肿瘤细胞，轻轻摇晃培养板并小心吹打，以确保完全回收细胞。对每组五只小鼠进行穿膜免疫化板传代时，将300微升相应的外周血单个核细胞（PBMC）与300微升经8-甲氧基补骨脂素/UVA处理的肿瘤细胞混合于1.5毫升锥形管中，并混匀细胞。接着，打开穿膜免疫化（TI）板的入口和出口管路夹。使用10毫升注射器将胎牛血清（FBS）注入TI管路中，同时在填充过程中关闭夹子，以使FBS保留在管路内。断开注射器。将P1000移液枪吸头牢固地插入TI板的进样口。将板倾斜45度角，缓慢加入PBMC和肿瘤细胞混合液，避免产生气泡。在释放移液器活塞之前，先将移液器吸头从进样口取下。将剩余的细胞放回1.5毫升离心管中。将装有FBS的管路、装有细胞的TI板以及含有剩余细胞的1.5毫升离心管置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育一小时。孵育结束后，松开夹子，通过重力作用排空TI管路。然后将P1000移液器吸头（压下活塞）插入板端口，以从TI板中移除细胞。将板倾斜至45度角，并用细胞悬液充满P1000移液器吸头。将细胞放回原来的1.5毫升离心管中。运行TI板时，将出口管连接至TI板，并将TI板固定到板运行系统中。接着，使用1毫升注射器从1.5毫升离心管中吸取600微升PBMC和肿瘤细胞混合液。将注射器连接到入口管上，打开夹子，缓慢注入液体，直至液体到达管路末端。将入口管的游离端连接到 TI 板上，并继续轻柔地加载剩余体积。完成后关闭入口夹。取下一个毫升注射器，将入口管路连接至注射泵。将出口管路固定至一个洁净的1.5毫升离心管，用于收集细胞。调节注射泵流速至0.09毫升每分钟。使用TI板运行平台将TI板向注射泵一侧倾斜约30度。小心松开入口管路的夹子。启动注射泵，并仔细观察TI板的填充过程。当TI板完全充满后，在液体排空时将其向相反方向倾斜约30度。当液体中的所有细胞均进入1.5毫升锥形收集管后，停止泵送。清洗TI板时，将入口管路从注射泵上断开，并连接至一支装有600微升胎牛血清（FBS）的一毫升注射器。填充至胎牛血清完全加载。然后断开注射器，并将管路连接至注射泵。调节注射泵流速为 0.49 毫升每分钟。松开入口夹，运行TI板，将洗涤液收集到同一个1.5毫升锥形管中。在TI板排空的整个过程中，轻轻弹动或轻敲TI板，以帮助解离并洗脱任何贴壁细胞。将收集用的1.5毫升锥形管从TI板装置上断开。将收集管在台式微量离心机中以250 × g离心8分钟，弃去上清液。为进行PBMC与抗原的过夜共孵育，首先将PBMC和肿瘤细胞沉淀重悬于2毫升透明RPMI培养基中，该培养基需添加15%同源小鼠血清。然后将细胞接种至35毫米非组织培养处理的无菌培养皿中，在标准组织培养条件下过夜孵育。第二天，使用组织培养刮刀小心地将贴壁细胞从培养皿底部刮下。刮取过程中旋转培养皿，以确保细胞收集均匀。将细胞收集至15毫升离心管中。向培养皿中加入 2 毫升 PBS，重复刮取步骤，将细胞收集到同一离心管中。用 1 毫升 PBS 冲洗 35 毫米培养皿，并将冲洗液加入同一离心管中。在标准组织培养离心机中以 250 × g 离心 10 分钟，以收集细胞。小心地用移液枪吸去上清液，然后轻弹管壁以重新悬浮沉淀。在两年内进行的九次独立实验的累积肿瘤生长数据中观察到，与对照组小鼠相比，接受治疗的小鼠中 YUMM1.7 肿瘤生长显著减少，涉及超过100只小鼠。单次实验中个体动物的代表性肿瘤生长曲线反映了该系统中的变异性。当从PBMC组分中去除单核细胞或血小板，或省略血小板孵育步骤时，治疗效果将不再出现。若缺乏免疫细胞或抗原来源，或存在错配抗原（例如使用MC38结肠癌细胞治疗YUMM1.7肿瘤），该治疗均无效。为获得免疫诱导效果，还必须避免PBMC暴露于8-甲氧基补骨脂素。通过FACS分析人CD11c+细胞中相应IgG对照的指定标志物变化，比较了新鲜分离的PBMC、TI处理的PBMC、未经血小板过境的TI处理PBMC、在血小板过境前去除血小板的PBMC，或上述两种处理方式，结果显示树突状细胞（DC）的活化依赖于PBMC中血小板的存在以及TI介导的血小板过境。TI活化的人DC能够有效加工并交叉提呈肽抗原，或来自经8-甲氧基补骨脂素处理的人肿瘤细胞的抗原，从而在体外实验中以TI和血小板依赖的方式激活人抗原特异性T细胞系。T细胞应答的特异性取决于所加工抗原的来源。在诱导抗肿瘤免疫反应时，必须对每种肿瘤细胞系的凋亡进行滴定，以最大程度地增强其免疫原性。由于所诱导的免疫反应将特异性针对免疫原性抗原，因此有可能对每种系统进行详细解析。每一种实验性或临床肿瘤，以及每一种抗微生物免疫反应，都将提供独特而有价值的信息。每种个体人类癌症都具有其独特的肿瘤特异性抗原谱。PhDC 能够完成肿瘤抗原的必要分选与呈递，而无需事先在实验室中鉴定这些抗原。请注意，8-MOP 和 UVA 光线属于致癌物。处理 8-MOP 和使用 UVA 光源时，应佩戴适当的防护装备并遵循安全操作规程。

novel-protocol-for-generating-physiologic-immunogenic-dendritic-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一种新的生理免疫原树突状细胞生成方法

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。...

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

本视频展示了如何从人单核细胞诱导生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞（DC）。通过将单核细胞与生长因子和细胞因子共同孵育，可获得未成熟DC。在免疫调节分子的作用下，未成熟DC可进一步分化为耐受性DC和成熟DC。...

从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

在同源免疫活性宿主中评估，基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗相较于使用异质性整体肿瘤细胞致敏的传统DC疫苗，显示出显著更强的抗肿瘤免疫反应。...

利用黑色素瘤和鳞状细胞癌干细胞生成一种新型树突状细胞疫苗

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

本文介绍了一种体内增强肠道归巢调节性T细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为能够局部从头合成高浓度的活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。...

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。...

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

我们描述了一种评估药物制剂能否将未经处理的单核细胞来源的树突状细胞转化为耐受性树突状细胞的方法 体外...

一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

学习利用TI设备通过血小板信号高效生成生理免疫原树突状细胞的方法。该技术适用于人类和小鼠，可诱导强效抗肿瘤T细胞反应，为癌症免疫治疗提供新策略。

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

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