荧光活化细胞分选分离人皮肤状和网状成纤维细胞

该协议通过基于细胞表面标记表达式的FAC排序，促进将功能上不同的成纤维细胞子集与人体皮肤分离。首次，可以直接从皮肤分离的子宫颈和卵泡成纤维细胞，而无需体外操作。与以前建立的使用外植培养物的隔离方法相比，这是一个巨大的进步。

皮肤成纤维细胞子集在恒态条件下具有不同的功能。有了这个工具，可以调查皮肤病理的功能差异，包括癌症或炎症性皮肤疾病。由于处理人体组织需要一些实践才能达到令人满意的细胞产量，我们想提供一个视觉演示，以促进和加快这个过程。

要准备全厚真皮，请将一块人皮放在厚厚的滤纸上，表皮朝下。用钳子紧紧地握住表皮，用手术刀刮掉皮下脂肪层。然后，将组织切成五毫米宽的条状，然后放入培养皿中。

要将真皮切成毛发和后半层，请将一块皮肤放在厚厚的滤纸上，表皮朝上。用钳子将皮肤紧紧地握在边缘，用电动皮马托米切出一块300微米厚的厚度。将第一层由表皮和辣椒真皮组成的转移到培养皿中。

然后，立即将表皮和真皮分开，或添加 1x PBS，防止组织干燥。接下来，将皮肤病调整到700微米的切割厚度，并切开剩余的真皮。将上部切片（定义为上半身真皮）放在单独的培养皿中。

随后，用头皮从残存的下皮毛层刮掉皮下脂肪层，然后丢弃它。在另一个培养皿中收集下重面真皮。立即进行酶消化程序，或加入1x PBS，防止组织干燥。

要进行酶消化，请将五毫米皮肤条或表皮/皮毛真皮与表皮朝上放在培养皿中，配以 10 毫升分离酶溶液。然后，在37摄氏度下孵育培养皿一小时。孵育后，将表皮/皮毛真皮转移到培养皿的盖子上。

用两个钳子将表皮与上皮分开，每个钳子都持有真皮的边缘。随后，尽可能彻底地将每个皮肤层切碎。碎片越小，组织消化越好。

然后，准备消化组合。将切碎的组织与10毫米的准备好的消化混合物转移到50毫米管。在37摄氏度的搅拌下孵育组织一小时。

在消化过程中多次反转管子。为了准备单细胞悬浮液，停止酶组织消化，在冰上消化的组织中加入10毫升的成纤维细胞介质。接下来，通过常规无菌不锈钢茶过滤器将每个管内的内容倒入，并在干净的培养皿中收集细胞悬浮液。

用介质清洗过滤器，用注射器柱塞边缘捣碎未消化的组织碎片。之后，通过70微米细胞过滤器将收集的细胞悬浮液移液到50毫升管中。用介质冲洗细胞过滤器，并收集流过同一管。

然后，在4摄氏度下以500倍g离心管，10分钟。取出上一提液，用五毫升的成纤维细胞介质清洗细胞颗粒。再次重复离心步骤。

之后，取出上流液，将颗粒重新在一毫升的 ACK 红细胞解液缓冲液中。在环境温度下将细胞留在解液缓冲液中约一分钟。然后，通过添加 9 毫升 1x PBS 和 10%FCS 来停止解解。

在4摄氏度下以500倍g再次离心管5分钟，随后丢弃上一代。在按照标准协议对细胞进行FAC分型染色后，将三个成纤维细胞亚群分类成单独的微离心管，其中填充了350微升裂解缓冲液，用于RNA分离，或350微升的成纤维细胞生长培养培养。立即反转管子，或将裂解缓冲液管放入液氮中，或将成纤维细胞生长介质管放在冰上。

在 FACS 之后，在 4 摄氏度下以 500 倍 g 旋转细胞，3 分钟。然后，在24井细胞培养皿中，在成纤维细胞生长培养培养皿中培养同样数量的细胞，并离开它们生长，直到达到70%的汇合。接下来，用脂肪细胞分化培养基代替培养细胞培养基，让细胞分化14天。

在分化第14天，用4%PFA修复细胞20分钟。用60%异丙醇清洗水井，让它完全蒸发。然后，用5毫升过滤的油红O染色细胞20分钟。

20分钟后，用蒸馏水清洗染色细胞四次。用倒置显微镜成像浸入水中的细胞，放大10倍，透光。该协议能够识别人体皮肤中的三个成纤维细胞种群，这些种群具有不同的皮内定位、基因表达特征和功能。

FAP阳性CD90-阴性在毛发真皮中丰富，而FAP阳性CD90阳性和FAP阳性CD90-正在重真真皮中更丰富。所有三个分类的亚人口在培养上显示典型的成纤维细胞形态七天。有趣的是，它们在脂肪发生测定中的行为不同。

在培养14天后，FAP阳性CD90阴性不区分为脂肪细胞，而FAP阳性CD90阳性和FAP阳性CD90-阳性容易发生。基因表达分析显示，FAP阳性CD90-阴性细胞表达通常归因于辣椒成纤维细胞（如CD26、NTN和PDPN）的高水平标记，而CD90-阳性细胞表达已知的关节标记，如CD36、平滑肌肉作用素和PPAR-伽马在高水平。我们的结论是，FAP阳性CD90-阴性细胞属于子宫颈，CD90阳性细胞属于后体血统。

如果皮肤碎片被彻底切碎并在足够的消化介质中孵育，消化效果最佳。皮肤成纤维细胞子集在功能上是多样化的。探索它们在疾病发病机制方面的功能将为新的诊断和治疗干预措施铺平道路。