通过和频产生振动光谱揭示聚合物与生物大分子的界面分子级结构

和频生成振动光谱经过拟合以研究具有界面选择性的界面。然而，当存在另一个界面时，菲涅耳系数法有助于消除干涉效应的影响。SFG 的主要优势在于其界面选择性和亚单层灵敏度。

这种非侵入性光学技术适用于研究多种界面，如固-液、固-固、液-液、固-气和液-气界面。我们建议初学者在光学和SFG领域专家的指导下，对SFG系统进行大量操作练习。没有捷径可走。

SFG 尚未被普遍认为是一种强大的技术，因此我们希望吸引更多观众的兴趣，并鼓励更多研究人员应用这一技术。首先，准备约五毫升的聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（PHEMA）的无水乙醇溶液，其质量分数为 2% 或 4%。使用前将溶液在实验室中放置三天。

接下来，将四个红外级氟化钙直角棱镜浸入分析纯无水甲苯中，至少浸泡12小时。然后将棱镜放入30毫升乙醇中，用脱脂棉擦拭表面约10分钟。用超纯水冲洗棱镜2分钟，并用氮气吹干。

接下来，将棱镜放入氧气等离子体清洗机中并抽真空。用氧气等离子体处理棱镜4分钟，并将其保留在腔室内直至使用。薄膜制备应在等离子体处理后1小时内进行。

在本研究中，为了选择性地检测屏障界面，根据菲涅耳系数模型的计算结果选择合适的薄膜厚度至关重要。准备PHEMA薄膜时，将一块洁净的棱镜固定在匀胶机的棱镜架上，并在棱镜表面滴加一滴PHEMA的乙醇溶液。以1,500 RPM的转速运行匀胶机1分钟，以制备PHEMA薄膜。

以相同方法对其他经等离子体处理的棱镜涂覆PHEMA。将薄膜置于设定为80°C的真空烘箱中退火至少10小时。进行实验时，将涂有PHEMA的棱镜面浸入去离子水中。

等待10至20分钟，然后使用和频产生光谱在水相和棱镜界面处评估界面PHEMA结构。操作FGS系统时，切勿让光束直接进入眼睛。开始制备丝素蛋白溶液时，将三升0.02摩尔的碳酸钠水溶液加热至沸腾。

将7.5克家蚕（Bombyx mori）丝茧加入该溶液中，边搅拌边煮沸30分钟。将纤维物质转移至洁净容器中，用2至3升去离子水搅拌清洗8至10分钟，重复三次，以去除不需要的丝胶蛋白分子。将纤维物质置于60°C的真空烘箱中干燥至少15小时。

接下来，将一克干燥的脱胶丝素蛋白溶解于四毫升 9.3 摩尔的溴化锂水溶液中。在 60 摄氏度下搅拌该溶液两小时。然后将丝素蛋白溶液置于截留分子量为 3,500 道尔顿的透析袋中。

将溶液在1升去离子水中透析三天，每天换水三次。透析完成后，将丝素蛋白溶液在4°C下保存。接下来，采用先前所述的方法清洗氟化钙棱镜，并用3.5%（质量分数）的聚苯乙烯溶液在其表面涂覆一层薄的聚苯乙烯膜。

将聚苯乙烯包被的棱镜与丝素蛋白溶液接触，并利用SFG光谱法检测聚苯乙烯-丝素蛋白界面。开始制备寡核苷酸双链时，将10纳摩尔的相应单链寡核苷酸溶解于0.5毫升超纯水中。对互补的寡核苷酸进行同样操作。

将溶液混合，得到浓度为10纳摩尔/毫升的双链寡核苷酸溶液。然后，将2毫克DPPC、2毫克氘代DPPC与1毫升氯仿混合，制备脂质溶液。接着，按照先前所述方法清洗并进行等离子体处理氟化钙棱镜。

将该棱镜连接到朗缪尔-布洛杰特槽的样品支架上。用去离子水填充槽体，并以每分钟一毫米的速度将棱镜的一个面缓慢浸入水中。在水面上注入数微升脂质溶液，等待表面压力稳定在约12毫牛顿每米。

然后以每分钟5毫米的速度开始压缩脂单层。当表面压力达到34毫牛顿每米时，以每分钟1毫米的速度将棱镜从槽中提起。接下来，准备500微升双链寡核苷酸溶液与脂质溶液的混合物，摩尔比为1:100。

然后将朗缪尔-布洛杰特槽替换为一个装有去离子水的圆柱形聚四氟乙烯容器。将寡核苷酸-脂质混合物注入水中，直至表面压力达到 34 毫牛顿每米。将涂有脂质单层的棱镜表面与寡核苷酸-脂质混合物接触，以形成最终样品。

利用FSG光谱法评估手性和非手性水分子的振动信号。在本示例中，PHEMA水凝胶与氟化钙棱镜界面在SFG光谱中显示出清晰且尖锐的峰，这归因于氟化钙与水凝胶之间形成的光滑界面。

水凝胶与周围水之间的界面呈现出更宽且强度较弱的特征，这是因为水分子能够扩散进入水凝胶的本体内部。当丝素蛋白浓度高于临界重叠浓度时，在溶液-聚苯乙烯界面处，除非添加甲醇作为诱导剂，否则未检测到手性二级结构。而在临界重叠浓度以下，即使不添加甲醇，也能检测到手性和频振动信号，表明在溶液-聚苯乙烯界面处形成了有序的二级结构，且该过程无需外界辅助。

在双链寡核苷酸锚定的脂质双层样品中，改变钙离子浓度对主要对应于小沟中手性脊水合层的手性水信号没有显著影响。相比之下，钙离子浓度显著影响了主要对应于双链链周围及脂质双层周围水层的非手性水信号。总体而言，这表明水层的手性脊结构可能保护寡核苷酸免受钙离子的影响。

计算菲涅耳系数并选择合适的薄膜厚度可以解决干涉问题。如果考虑多次反射和折射，则可以调节界面处的正确电场分布。此外，还有其他方法可用于制备具有所需厚度的薄膜，例如阶梯涂覆法和化学气相沉积法。

检测与粘附、白化、摩擦及其他性能相关的表面和界面结构，有助于研究人员理解其潜在机制，并开发新型功能材料。该方法还可应用于其他需要研究不同界面的体系。然而，光束传播所经过的介质必须是透明的。