公司重点调查的社区图书馆筛选确定关键 CTCF 边界
2019年3月31日
一个 crisprsgrna 文库已被应用于蛋白质编码基因的询问。然而, sgRNA 文库揭示 CTCF 边界在基因调控中的作用的可行性仍未得到探讨。在这里, 我们描述了一个Hox位点特定的 sgRNA 库, 以阐明在hox位点中 ctcf 边界的功能。
我们的池sgRNA称为库筛选，是一种强大的遗传方法，用于识别和评估整个基因组中非编码元素的生物功能。这种技术使我们能够检查破坏相关结合位点、色边界或其他调控元素对靶向基因表达的影响。我们的方法可用于识别CTCF，长非编码RNA和增强剂的作用，在早期胚胎发育HOX基因调控中的作用，以及某些具有异常HOX基因特征的白血病。
从针对 CTCF 绑定位点设计的 sgRNA 开始此过程。在细胞制备中克隆sgRNA库，如文本协议中所述。为了包装扁病毒，用20微克的纯化库载体、15微克的包装质粒和10微克的包络质粒，在采集病毒前48小时进行共传递 HEK293 T细胞。
48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45微米低蛋白结合PVDF膜进行过滤。接下来，使用浓缩器将扁病毒上经剂集中50倍。将浓缩病毒储存在零下80摄氏度的冰柜中。
在12孔板的单独井中工作，将MOLM13细胞与各种剂量的浓缩扁病毒混合，共6组。立即将这些混合物以1000倍g离心，在33摄氏度下进行两小时。将12个井板在37摄氏度和5%的二氧化碳下将转回孵化器4小时。
轻轻吸吸上一提液，而不干扰细胞调色板，并重新悬浮带新鲜补充的RPMI 1640中等的换能细胞。然后将重新悬浮的细胞转移到T25烧瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，不产生紫霉素。48小时后，这些细胞分成两个烧瓶，一个实验组用每毫升一微升的紫菜素治疗5天，一个对照组5天不进行紫辛治疗。
通过将用紫霉素治疗的活细胞数除以不进行普霉素治疗的细胞数，测量优化的MOI值。要通过池库对细胞进行转导，在6井板中感染150万个MOLM13细胞，在介质中感染0.3 MOI的sgRNA池扁病毒。使用没有扁病毒感染的细胞作为控制。
立即将六个井板以1000倍g离心，在33摄氏度下两小时旋转细胞。然后，将板在摄氏37度的5%二氧化碳中转移回孵化器4小时。在不干扰细胞调色板的情况下轻轻吸进上一提液，用新鲜介质重新悬浮转导细胞。
然后，将细胞转移到T25烧瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，不产生霉素。48小时后，用每毫升一微克的紫菜素治疗细胞5天。两天后交换新鲜介质，并保持最佳的细胞密度。
用限制稀释方法在96个井板中播种单克隆。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育这些单克隆。培养他们 3 - 4 周。
计算 sgRNA 集成 MOLM13 细胞与 0.4% Trypan Blue 溶液染色，然后将每井 10，000 个活细胞转移到 96 井 PCR 板。将板以 1000 次 g 离心五分钟，然后用移液器彻底取出和丢弃上清液。避免干扰单元格调色板。
洗涤后，如文本中描述的，将50微升的细胞解解主混合添加到每个井中。上下移位五次以重新挂起单元格调色板。在室温下孵育混合物10分钟。
然后，将混合物转移到37摄氏度5分钟，然后将75摄氏度再转5分钟。现在向含有RT qPCR反应混合物的PCR孔中加入一微升的细胞来亚酸盐。这种混合物包括标记基因向前和反向底转，逆转录酶和一步反应混合。
在50摄氏度下运行逆转录反应10分钟，然后聚合激活，DNA变性在95摄氏度下运行1分钟。执行RT PCR 与 40 周期的 PCR 反应，如文本协议中详细说明。验证HOXA9通过桑格测序减少的表达克隆，并执行PCR与MOLM13基因组DNA如文本协议所述。
使用 PCR 纯化套件提取和纯化 PCR 产品。使用 T4 结扎缓冲液、T 向量 DNA、PCR DNA 和 T4 连接酶将纯化 PCR 产品放入 T 向量中。将结扎混合物放入16摄氏度的孵化器中过夜。
将结扎混合物转移到 DH5 alpha 能力细胞和 LB 安西林抗生素加糖板上的板中。在37摄氏度下孵育板。从 LB 板中选取单个克隆，然后通过基因分型和桑格测序进行验证。
在 0.2 毫升 PCR 管中设置具有 200 毫微克的异质混合物组，以及 200 毫微克的测试 PCR amplicons。包括仅含有 400 纳米的参考 PCR 安普利森的同性混合物组作为控制。在充满800毫升水的一升烧杯中，在95摄氏度下单独孵育杂合和同质混合物，5分钟。
然后，将混合物逐渐冷却至室温至退火，形成异质或同性。现在，用一微升的英德尔突变检测核酸酶和两个微升的核酸酶反应缓冲液，在42摄氏度下分别消化400纳米的退火杂质和同质复性混合物，60分钟。使用阿加罗斯凝胶电泳分析消化的样品。
异质混合物DNA应切割成小片段，同质DNA不应切割。基于HOXA9基因的表达水平与对照细胞的比较，用RT qPCR方法确认了针对MOLM13阳性克隆的sgRNA。在筛选的528个存活克隆中，有10个克隆在HOXA9水平上表现出50%以上的降幅。
与HOXA9集成的sgRNA减少，HOXA9不变，HOXA9增加克隆，进一步通过PCR扩增sgRNA和桑格序列的鉴定得到进一步确认。在显示HOXA9水平降低的10个克隆中，有6个包含针对CBS79站点的sgRNA，由桑格测序确定。集成sgRNA阳性克隆的内德尔突变由基于PCR的基因分型和核酸酶消化确定。
位于HOXA7和HOXA9基因之间的CTCF位点的异质缺失由基于PCR的基因分型识别。HOXA9 减少的克隆 5、6、28 和 121 在 CBS79 边界位置显示删除。通过核酸酶消化分析分析的CBS79位点内突变也观察到类似的结果。
执行此程序时，重要的是使等量的异质复性与同性，以便通过核酸酶消化分析检测 sgRNA 诱导的内德尔突变。我们的方法能够利用选定的标记，对目标基因进行下一代测序，以发现该基因对白血病生成的影响。总的来说，我们的方法可以防止RPC在正常生物过程中对著名的遗传不规则元素进行功能校正和减少，并在死后基因组计划误差中减少白血病。
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概述
本研究探索了使用HOX基因座特异性sgRNA文库来研究CTCF界限在基因调控中的作用。该方法旨在增强对非编码元件及其对HOX基因表达影响的理解。
研究的主要组成部分
科学领域
- 基因调控
- CRISPR技术
- HOX基因功能
背景
- CTCF是染色质结构和基因表达的关键调控因子。
- 了解CTCF界限可以提供对基因调控机制的洞察。
- HOX基因在发育和疾病中起着关键作用。
- 先前的研究尚未充分探索CTCF对HOX基因座的影响。
研究目的
- 阐明CTCF界限在HOX基因调控中的功能。
- 评估使用sgRNA文库的可行性。
- 调查对早期胚胎发育和白血病的影响。
使用的方法
- 设计靶向CTCF结合位点的sgRNA。
- 将sgRNA文库克隆到细胞制剂中。
- 使用HEK293 T细胞包装慢病毒。
- 筛选对基因表达的影响。
主要结果
- 成功设计和实施了HOX基因座特异性sgRNA文库。
- 确定了CTCF在调控HOX基因表达中的作用。
- 对非编码元素在基因调控中的功能提供了洞察。
- 在理解具有异常HOX特征的白血病方面的潜在应用。
结论
- 该研究证明了sgRNA文库在基因调控研究中的实用性。
- CTCF界限显著影响HOX基因表达。
- 研究结果可能对发育生物学和癌症研究有更广泛的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Disrupting CTCF-mediated chromatin boundaries in HOX loci enables functional interrogation of noncoding regulatory elements that drive oncogenic gene expression in leukemia models. This approach supports target validation by linking specific boundary elements to disease-relevant transcriptional outputs, providing mechanistic de-risking for therapeutic hypotheses involving chromatin architecture. The sgRNA library screening strategy offers a scalable method to prioritize regulatory elements with predictive confidence in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies CTCF boundary elements as critical regulators of HOXA9 expression in MLL-rearranged AML models.
- Operational Value: Enables pooled screening of noncoding elements to functionally annotate genetic regulatory regions in disease contexts.
- Scientific Value: Links chromatin boundary disruption to oncogenic chromatin domain formation and ectopic HOX gene expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative HOXA9 expression readouts via RT-qPCR to assess phenotypic impact of sgRNA-mediated boundary disruption.
- Operational Value: Uses nuclease digestion and heteroduplex analysis to validate indel mutations at targeted CTCF sites with single-clone resolution.
- Scientific Value: Confirms genotype-phenotype correlation by Sanger sequencing of sgRNAs in clones showing >50% HOXA9 reduction.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates relevance of CTCF boundaries in maintaining leukemogenic HOX expression signatures, supporting preclinical target prioritization.
- Operational Value: Provides a reusable screening platform for annotating noncoding elements in disease-relevant genomic loci beyond HOX clusters.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by validating causal roles of specific boundary elements in disease-associated gene dysregulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling systematic functional screening of noncoding regulatory elements, with outputs informing lead identification and preclinical validation decisions in chromatin-modifying target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chromatin boundary function in gene regulation through pooled genetic screening.
- Screening: Delivers assay-ready clonal lines with validated sgRNA integration and quantifiable HOXA9 expression changes.
- Analytics: Generates quantitative PCR-based expression data and genotyping outputs to correlate genetic perturbations with phenotypic effects.
- Translational Research: Connects boundary element function to leukemogenic phenotypes in MLL-rearranged AML models, enabling risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable lentiviral sgRNA library framework for screening regulatory elements in other disease-associated loci.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic linkage of noncoding elements to oncogenic gene expression.
- Operational Value: Standardized workflow for lentiviral delivery, clonal isolation, and molecular validation of sgRNA effects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in regulatory element function prior to therapeutic investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin architecture targets based on functional validation in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, CRISPR screening, and molecular cloning for library generation and validation.
- Dependent on HEK293T cells for viral packaging and MOLM13 cells for screening in AML models.
- Necessitates standardized puromycin selection and clonal dilution methods to isolate single-cell-derived populations.
- Relies on RT-qPCR, Sanger sequencing, and nuclease digestion assays for on-target validation and mutation detection.
- Limited by transfection efficiency and MOI optimization to ensure representative library coverage and avoid clonal bias.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
The High Titer sgRNA Library Lentivirus Generation
1:44
Titration of Lentiviral Library in MOLM13 Leukemia Cells
2:59
Transduction of the Pooled CRISPR-Cas9 KO Library
4:20
Screening of the Pooled CRISPR-Cas9 KO Library with One-Step RT-qPCR
5:41
Verification of Integrated sgRNAs Positive Clones through Genotyping and Sanger Sequence
6:37
Detection of sgRNAs Induced Indel Mutation by Nuclease Digestion Assay
7:48
Results: Pooled CRISPR-Cas9 KO Library Screening and Identification
9:19
Conclusion
