Name: 公司重点调查的社区图书馆筛选确定关键 CTCF 边界 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 探索利用HOX基因座特异性sgRNA文库筛选技术，研究CTCF边界在基因调控中的作用机制。该方法通过CRISPR技术靶向CTCF结合位点，揭示非编码元件对HOX基因表达的影响，为早期胚胎发育和白血病研究提供新见解。

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作者还感谢 Nicholas Cesari 对手稿的编辑。本工作由美国国立卫生研究院资助（S.H.，项目编号 R01DK110108、R01CA204044）。

&#8203;1. 使用在线工具设计CTCF sgRNA文库
<ol>
	<li>使用基因扰动平台（GPP）设计工具（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design），设计靶向人类HOX基因座中CTCF结合位点的sgRNA。</li>
	<li>共合成1,070条sgRNA，包括靶向303个随机基因的sgRNA、60条阳性对照、500条非人类靶向对照，以及207条靶向CTCF元件或lncRNA基因的sgRNA（图1，表1）。每个靶向DNA元件由5–10条不同的sgRNA进行靶向。</li>
</ol>
2. sgRNA 文库克隆
<ol>
	<li>将合成的寡核苷酸克隆至CRISPR慢病毒骨架载体（lentiCRISPRv2）中。
	<ol>
		<li>用BsmBI限制性内切酶在37 °C下消化LentiCRISPRv2载体，持续2小时。</li>
		<li>BsmBI消化后，在琼脂糖凝胶上观察较大条带（约12,873 bp），然后使用凝胶回收试剂盒进行纯化。 
		注意：消化后凝胶上还会出现一个约2 kb的小片段，应忽略该片段。</li>
		<li>将合成的寡核苷酸与经消化的LentiCRISPR载体进行连接反应，体系包含150 ng经消化的LentiCRISPR DNA、1 µL 10 µM寡核苷酸、2 µL 10x T4连接酶缓冲液和1 µL T4连接酶，于16 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将慢病毒CRISPR/sgRNA文库转化至电转感受态细胞中进行扩增。
	<ol>
		<li>将电穿孔仪设置为1.8 kV、200 Ω和25 µF；同时将复苏用SOC培养基在37 °C水浴中预热，并将含氨苄青霉素的LB琼脂平板置于37 °C预热。</li>
		<li>将感受态细胞置于冰上解冻10分钟。</li>
		<li>在冰上准备好1.5 mL微量离心管和1 mm电穿孔杯。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，将1 µL浓度为10 ng/µL的文库质粒DNA加入25 µL感受态细胞中，轻轻弹击管底数次以混匀。</li>
		<li>待电穿孔杯充分冷却后，将DNA与感受态细胞的混合物转移至电穿孔杯中，轻敲杯壁两次，并用纸巾擦干外壁水滴，然后将电穿孔杯放入电穿孔模块并按下脉冲按钮。</li>
		<li>立即加入975 µL预热至37 °C的SOC培养基，用移液器吹打混匀后转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在37 °C旋转孵育1小时。</li>
		<li>取100 µL细胞悬液加入900 µL SOC培养基中稀释，取100 µL涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商提供的操作说明，使用大提柱从合并的菌落中提取质粒DNA。
	<ol>
		<li>刮取LB琼脂平板上的所有菌落，接种至2 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中作为起始培养物，并在37 °C剧烈振荡（~200 x g）条件下过夜培养。</li>
		<li>将起始培养物按1:500比例稀释至100 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，在37 °C剧烈振荡（~200 x g）条件下培养12–16小时。</li>
		<li>在4 °C条件下以6,000 x g 离心15分钟，收集菌体沉淀。</li>
		<li>用10 mL悬浮缓冲液重悬菌体沉淀。</li>
		<li>加入10 mL裂解缓冲液裂解悬浮的菌体沉淀，剧烈颠倒4–6次，室温孵育5分钟。</li>
		<li>加入10 mL预冷的中和缓冲液中和裂解液，轻轻颠倒离心管4–6次混匀，冰上孵育20分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以13,500 x g 离心30分钟，迅速将含有质粒DNA的上清液转移至新离心管中。</li>
		<li>重复步骤2.3.7，再次将含有质粒DNA的上清液迅速转移至新离心管中。</li>
		<li>用10 mL平衡缓冲液对层析柱进行平衡处理，依靠重力流使液体完全通过柱体。</li>
		<li>将上清液加入层析柱中，依靠重力流使其进入树脂。</li>
		<li>用2次30 mL洗涤缓冲液清洗层析柱。</li>
		<li>用15 mL洗脱缓冲液洗脱DNA。</li>
		<li>向洗脱的DNA中加入10.5 mL室温异丙醇以沉淀DNA，混匀后立即在4 °C条件下以15,000 x g 离心30分钟，小心倾去上清液。</li>
		<li>用5 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在15,000 x g 条件下离心10分钟，弃去透明上清液。</li>
		<li>重复步骤2.5.14两次。</li>
		<li>在15,000 x g 条件下离心10分钟，小心倾去上清液，避免扰动DNA沉淀。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥5–10分钟，然后用适量缓冲液（TE缓冲液，pH 8.0）溶解DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 高滴度sgRNA文库慢病毒的制备
<ol>
	<li>细胞准备：在T-25培养瓶中，使用添加10%（体积比）胎牛血清（FBS）和1%（体积比）青霉素-链霉素（PS）抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养HEK293T细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>慢病毒包装：将步骤2中获得的20 µg纯化文库载体、15 µg包装质粒（psPAX2）和10 µg包膜质粒（pMD2.G）共同转染HEK293T细胞，转染后48小时收集病毒。</li>
	<li>病毒收集：转染48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45 µm低蛋白结合PVDF膜过滤上清液。</li>
	<li>病毒浓缩：使用浓缩装置将慢病毒上清液浓缩50倍，并在步骤5中检测病毒的感染复数（MOI）。</li>
	<li>病毒保存：将浓缩后的病毒分装，储存于-80 °C超低温冰箱中。</li>
</ol>
4. 优化嘌呤霉素浓度
<ol>
	<li>白血病细胞培养：在T-125培养瓶中，使用添加了10%（体积比）胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素（PS）抗生素的RPMI 1640培养基培养MOLM13 AML细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中。
	 
	注意：细胞通常每4–5天传代一次，传代比例为1:4或1:6，切勿使细胞融合度超过70%。</li>
	<li>以每毫升1.0 × 104个细胞的密度，将MOLM13细胞接种于12孔板中，每孔总体积为2 mL（共2.0 × 104个细胞）。</li>
	<li>时间进程实验：以逐渐增加的浓度（0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.5 µg/mL、1.0 µg/mL和2.0 µg/mL）的嘌呤霉素处理MOLM13细胞，持续7天
	<ol>
		<li>在第0天设置未加嘌呤霉素处理的MOLM13细胞，并从第0天至第7天设置3个未加嘌呤霉素处理的重复孔作为对照。</li>
		<li>分别用0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.5 µg/mL、1.0 µg/mL和2.0 µg/mL的嘌呤霉素处理细胞，每个实验条件设置3个重复孔。</li>
		<li>每天检测活细胞比例，并绘制包含所有条件的第0天至第7天的存活曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>存活曲线：使用台盼蓝染色，每日计数细胞活力，获得各嘌呤霉素浓度下的存活曲线。</li>
	<li>优化最低嘌呤霉素浓度：通过台盼蓝染色确定最低嘌呤霉素浓度，使所有MOLM13细胞在5–7天内完全死亡。</li>
</ol>
5. 在 MOLM13 白血病细胞中对慢病毒文库进行滴定
<ol>
	<li>AML 细胞准备：用转导培养基（RPMI 1640、10% FBS、1% PS 和 8.0 µg/mL 包被培养基）收集 MOLM13 AML 细胞，细胞密度为 1.5 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将 MOLM13 细胞接种至 12 孔板中，每孔接种 1.5 × 106 个细胞。</li>
	<li>解冻慢病毒：从 -80 °C 冰箱中取出浓缩的慢病毒，置于冰上解冻。</li>
	<li>在不同的孔中将 MOLM13 细胞与不同剂量的浓缩慢病毒混合，包括 0、1、2.5、5、7.5 和 10 µL（共 6 组）。</li>
	<li>立即在 33 °C 条件下以 1,000 ×g 离心 2 小时，随后将 12 孔板转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中继续孵育 4 小时。</li>
	<li>孵育 4 小时后，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，收集感染后的细胞。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，用新鲜培养基（RPMI 1640、10% FBS 和 1% PS）重悬转导后的细胞，然后转移至 T-25 培养瓶中，在 37 °C 培养 48 小时，不添加嘌呤霉素。</li>
	<li>48 小时后，将细胞分至两个培养瓶（2 组）：实验组加入 1 µg/mL 嘌呤霉素处理 5 天，对照组不加嘌呤霉素处理 5 天。</li>
	<li>按照步骤 4 进行为期 5 天的嘌呤霉素筛选，浓度为 1 µg/mL，直至所有未转导的对照组细胞全部死亡。每 2 天更换一次新鲜培养基。</li>
	<li>通过将经嘌呤霉素处理后存活的细胞数量除以未接受嘌呤霉素处理的细胞数量，计算获得用于转导的最佳感染复数（MOI）值。</li>
</ol>
6. 混合CRISPR-Cas9基因敲除文库的转导
<ol>
	<li>慢病毒感染：在6孔板中，用0.3 MOI的sgRNA混合慢病毒在培养基（RPMI 1640，10% FBS，1% PS，以及8 µg/mL涂布培养基）中感染1.5 × 106个MOLM13细胞，并将未感染慢病毒的细胞作为对照。</li>
	<li>立即在33 °C下以1,000 ×g离心6孔板2小时以促进病毒感染（spinfection），随后将培养板转移至37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养4小时。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心感染后的细胞5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，用新鲜培养基（RPMI 1640，10% FBS和1% PS）重悬转导后的细胞，然后转移至T-25培养瓶中，在不含嘌呤霉素的条件下于37 °C培养48小时。</li>
	<li>48小时后，用1 µg/mL嘌呤霉素处理细胞，持续5天。2天后更换新鲜培养基，并维持细胞在最佳密度。</li>
	<li>采用有限稀释法将单克隆细胞接种至96孔板中，在37 °C、5% CO2条件下培养，持续培养3–4周。</li>
	<li>当单个细胞增殖形成细胞群体后，将一半细胞转移至24孔板中，在嘌呤霉素筛选条件下继续培养，并在下一步中对这些克隆进行验证；保留剩余细胞。</li>
</ol>
7. 使用一步法 RT-qPCR 筛选混合型 CRISPR-Cas9 基因敲除文库
<ol>
	<li>通过一步法逆转录聚合酶链式反应（one-step RT-qPCR）检测标志基因 HOXA9 的表达水平，评估sgRNA整合克隆筛选的有效性。 
	注意：HOXA9 在白血病发生过程中于 MOLM13 AML 细胞中高表达22,23。</li>
	<li>计数sgRNA整合的MOLM13细胞，并将每孔1 × 104个细胞转移至96孔PCR板中。</li>
	<li>以1,000 ×g离心5分钟，然后用移液器彻底移除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用125 µL PBS缓冲液洗涤细胞，再以1,000 ×g离心5分钟。随后用移液器移除120 µL上清液，每孔保留约5 µL PBS。</li>
	<li>向每孔加入50 µL细胞裂解主混合液，其中包含48 µL细胞裂解缓冲液、1 µL蛋白酶K溶液（10 mg/mL）和1 µL DNase溶液（1 mg/mL）。然后用移液器吹打5次，充分重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将混合物在室温孵育10分钟，随后在37 °C孵育5分钟，最后在75 °C孵育5分钟。</li>
	<li>将细胞裂解物储存于-80 °C冰箱中。</li>
	<li>一步法RT-qPCR反应体系的配制：将一步法反应混合液及其他反应组分在4 °C解冻，短暂离心以收集管底液体，避光置于冰上，轻轻混匀并短暂离心。</li>
	<li>向含有RT-qPCR反应混合液的PCR孔中加入1 µL细胞裂解物，反应体系包括：标志基因的正向引物（300 nM）和反向引物（300 nM）各1 µL、逆转录酶（10 U/µL）0.125 µL，以及一步法反应混合液（2×）5 µL。</li>
	<li>用光学透明封膜密封各孔，轻轻涡旋振荡以混匀反应组分。</li>
	<li>将96孔PCR板放置于实时荧光定量PCR仪中。</li>
	<li>运行逆转录反应：50 °C孵育10分钟，随后95 °C孵育1分钟以灭活逆转录酶并实现DNA变性。</li>
	<li>进行40个循环的RT-PCR扩增：95 °C变性15秒，60 °C退火/延伸并读取板荧光信号20秒，随后进行熔解曲线分析，温度从65 °C升至95 °C，每步增加0.5 °C，每步持续2–5秒。</li>
	<li>根据与对照组相比HOXA9基因的表达水平，分别设定上调、下调及无变化组。以β-actin基因作为内参对照基因。</li>
</ol>
8. 通过基因分型和Sanger测序验证整合的sgRNA阳性克隆
<ol>
	<li>通过Sanger测序验证HOXA9表达降低的克隆，并使用50-100 ng MOLM13基因组DNA、5 µL聚合酶反应缓冲液（10x）、1 µL上游引物（10 µM）（AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG）和1 µL下游引物（10 µM）（TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG）、1 µL dNTP（10 mM）、1单位聚合酶（5 U/µL）进行PCR。PCR反应程序为：94 °C预变性30秒，随后进行30个循环：94 °C变性20秒，56 °C退火20秒，68 °C延伸20秒，最后在68 °C延伸10分钟，然后在4 °C保存。</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒提取并纯化PCR产物（片段大小为285 bp）。</li>
	<li>将纯化的PCR产物连接至T载体中，反应体系包含2 µL T4连接酶缓冲液（10x）、50 ng T载体DNA（50 ng/µL）、25 ng纯化的PCR DNA（285 bp）、1 µL T4连接酶（3单位/µL），将连接反应混合物置于16 °C孵育过夜。</li>
	<li>将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，在LB氨苄青霉素抗性琼脂平板上培养，并于37 °C过夜培养。</li>
	<li>从LB平板上挑取单克隆，通过基因分型和Sanger测序进行验证。</li>
</ol>
9. 通过核酸酶消化实验检测sgRNA诱导的插入缺失突变
<ol>
	<li>通过核酸酶检测实验测定sgRNA整合的单克隆诱导的Indel突变率。</li>
	<li>分别以50-100 ng的Indel突变体（检测样本）和野生型（WT，参照）DNA作为PCR模板，加入5 µL聚合酶反应缓冲液（10×）、1 µL dNTP（10 mM）、1单位聚合酶（5 U/µL）、1 µL正向引物（10 µM）（5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3'）和1 µL反向引物（10 µM）（5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'），制备PCR扩增产物。PCR反应程序为：98 °C预变性30秒，随后进行30个循环：98 °C变性20秒，56 °C退火20秒，72 °C延伸30秒，最后72 °C终延伸10分钟，4 °C保存。</li>
	<li>在0.2 mL PCR管中，将200 ng的&#34;参照&#34;（20 ng/µL）与200 ng的&#34;检测样本&#34;（20 ng/µL）PCR扩增产物混合，构建异源双链混合组；以400 ng的&#34;参照&#34;PCR扩增产物单独作为同源双链混合组，作为对照。</li>
	<li>将异源双链和同源双链混合物分别置于盛有800 mL水的1 L烧杯中，95 °C孵育5分钟，随后逐渐冷却至室温，使DNA退火并形成异源或同源双链结构。</li>
	<li>分别向400 ng退火后的异源双链和同源双链混合物中加入1 µL Indel突变检测试剂用核酸酶（2.5 U/µL）和2 µL核酸酶反应缓冲液（10×），在42 °C下消化60分钟。</li>
	<li>采用琼脂糖凝胶电泳分析消化后的样品，异源双链混合物的DNA应被切割为较小片段（70–250 bp），而同源双链DNA（320 bp）则不应被切割。</li>
</ol>

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<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+%28FLT3%29+and+Nucleophosmin+1+%28NPM1%29+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes%3A+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li>
<li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li>
<li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).</li>
<li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
</ol>

我们声明本报告无任何利益冲突。

与蛋白质编码基因相关的sgRNA文库已应用于功能筛选系统，通过sgRNA富集来鉴定调控特定细胞功能的基因及网络24,25,26,27,28。多个与非编码区相关的sgRNA文库也已用于基因特异性功能筛选，以研究远端和近端调控元件，包括BCL11A、Tdgf1a以及药物抗性调控基因28,29,30。这些sgRNA文库均通过详细的生物信息学设计、寡核苷酸合成，并将寡核苷酸池亚克隆至载体中构建而成。全基因组范围的筛选方法功能强大且用途广泛，但需要具备基因组范围sgRNA设计的计算专业知识，以及持续的资金...

近期的基因组互作研究表明，人类细胞核基因组会形成稳定的拓扑关联结构域（TADs），这些结构域在不同细胞类型和物种间具有保守性。基因组被组织成独立的结构域，有助于促进并限制调控元件（如增强子和启动子）之间的相互作用。CCCTC结合因子（CTCF）结合于TAD边界，在限制相邻TAD内DNA元件之间相互作用方面发挥关键作用1。然而，全基因组范围的CTCF结合数据表明，尽管CTCF在不同细胞类型中主要结合相同的DNA位点，但它往往仅在某一种细胞类型中的特定位点发挥染色质屏障功能，而在其他细胞类型中则无此功能，提示CTCF在染色质边界形成过程中需与其他因子协同作用2。目前尚不清楚的是，边界元件（即CTCF结合位点）是否直接与CTCF的生物学功能相关，以及这些关联是如何建立的。因此，我们提出假设：基因组中特定的CTCF结合位点可直接调控TAD的形成，并控制这些结构域内部或相邻结构域之间启动子与增强子的相互作用。人类和小鼠基因组测序项目的完成以及后续的表观遗传学分析，揭示了基因组新的分子与遗传特征。然而，这些特定特征或修饰在基因调控和细胞功能中的作用及其分子机制仍有待全面阐明。
多项证据表明，CTCF介导的拓扑关联结构域（TADs）代表了功能性的染色质结构域3,4,5。尽管CTCF在不同类型细胞中主要结合相同的DNA位点，全基因组范围的CTCF ChIP-seq数据揭示，CTCF常在一种细胞类型中发挥染色质屏障作用，而在另一种细胞类型中则不具备此功能2。CTCF通过介导基因组的高级结构，在发育过程中发挥关键作用4,6,7。CTCF边界结构的破坏会损害增强子/启动子之间的相互作用及基因表达，导致发育阻滞。这表明CTCF介导的TADs不仅是结构性元件，同时也是实现增强子正常功能和基因转录所必需的调控单元5,8,9。
HOX 基因在胚胎发育过程中发挥关键作用，其表达模式具有严格的时间和空间限制。在 hESC 和 IMR90 细胞中，HOXA 基因座形成两个稳定的拓扑关联结构域（TAD），通过一个与 CTCF 相关的边界元件将前部和后部基因分隔开来1。近期研究表明，HoxBlinc 是一种与 HoxB 基因座相关的长链非编码 RNA（lncRNA），可介导 CTCF 指导的 TAD 形成以及 HOXB 基因座内的增强子/启动子相互作用，从而在胚胎干细胞（ESC）定向承诺和分化过程中激活前部 HOXB 基因10。此外，在包括 HOXA 基因座在内的特定基因位点，CTCF 介导的 TAD 结构域的改变会影响谱系特异性基因表达谱，并与疾病状态的发生相关11,12。这些证据支持 CTCF 的主要功能是通过将基因组组织成功能性结构域，协调基因转录并决定细胞身份。
尽管在胚胎发育中发挥作用，HOX 基因在造血过程中调控造血干细胞和祖细胞（HS/PC）的功能，其机制是调控增殖与分化之间的平衡10,13,14,15。在造血细胞的特化与分化过程中，HOX 基因的表达受到严格调控，在HS/PCs中表达水平最高。随着细胞成熟，HOX 基因的表达逐渐下降，在终末分化的造血细胞中达到最低水平16。HOX 基因的异常调控是白血病转化的主要机制，通过扰乱HS/PCs的自我更新和分化特性，导致白血病的发生17,18。然而，HOX 基因在正常与致癌表达模式建立和维持过程中的机制，以及相关调控网络，目前仍不明确。
CRISPR-Cas9 sgRNA 文库筛选已广泛用于研究不同物种中的蛋白编码基因19以及非编码基因，例如lncRNA20和miRNA21。然而，利用CRISPR-Cas9 sgRNA文库鉴定新的基因组靶点的成本仍然较高，因为通常需要高通量基因组测序来验证sgRNA文库筛选结果。我们的sgRNA筛选系统聚焦于特定基因组位点，并通过一步法RT-PCR检测标记基因（如HOXA9）的表达水平来评估靶向sgRNA的效果。此外，通过Sanger测序可确认sgRNA已整合至基因组中，并可检测插入缺失（Indel）突变，从而确定sgRNA的靶向位点。通过位点特异性的CRISPR-Cas9遗传筛选，已鉴定出CBS7/9染色质边界在急性髓系白血病（AML）发病过程中对形成致癌性染色质结构域及维持异位HOX基因表达模式具有关键调控作用12。该方法不仅可用于鉴定CTCF边界在胚胎发育、造血过程和白血病发生中的特定功能，还可用于探索CTCF边界作为未来表观遗传治疗潜在治疗靶点的可能性。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 3000 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 细胞&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;C737303</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>DSMZ</td><td>ACC 554</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pGEM&amp;reg;-T Easy 载体系统&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A137A</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>&amp;nbsp;M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SingleShot&amp;trade; SYBR&amp;reg;&amp;nbsp;Green 一步法试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725095</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;11965084</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 浓缩试剂&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Genessee Scientific</td><td>&amp;nbsp;25-507</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>Surveyor&amp;reg; 突变检测试剂盒</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>706020</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Universal Hood II 凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8126</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器/金属浴加热器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88870002</td><td></td></tr><tr><td>TSX 系列超低温冰箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSX40086V</td><td></td></tr><tr><td>Forma&amp;trade; Steri-Cult&amp;trade; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3308</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe&amp;trade; KS 二级生物安全柜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51022484</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; XT/XF 离心机系列</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004506</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;trade;&amp;nbsp;Isotemp&amp;trade; 水浴锅</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade;&amp;nbsp;Locator&amp;trade; Plus 架盒系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-762-353</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp&amp;trade; 梯度 PCR 仪</td><td>Applied Biosystems technology</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade;&amp;nbsp;Owl&amp;trade; EC300XL2 紧凑型电泳电源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7217581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade;&amp;nbsp;Owl&amp;trade; EasyCast&amp;trade; B1 微型凝胶电泳系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-528-178</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 试管旋转混合仪及旋转器</td><td>VWR International</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 恒温小型摇床</td><td>VWR International</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>分析天平 MS104TS/00</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>30133522</td><td></td></tr><tr><td>DS-11 FX 和 DS-11 FX+ 分光光度计</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 FX</td><td></td></tr></tbody></table>

hox 基因座靶向的crispr/sgrna文库筛选鉴定关键ctcf边界

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC结合因子（CTCF）介导的稳定拓扑关联结构域（TADs）在限制位于相邻TADs内DNA元件之间相互作用方面发挥关键作用。CTCF在调控控制胚胎发育、体轴模式形成、造血以及白血病发生的HOX基因时空表达中具有重要作用。然而，目前尚不清楚与HOX基因座相关的CTCF边界是否以及如何调控染色质结构和HOX基因的表达。在本实验方案中，构建了一个特异性的sgRNA文库，靶向HOXA/B/C/D基因座中的所有CTCF结合位点，以研究破坏CTCF相关染色质边界对TAD形成和HOX基因表达的影响。通过CRISPR-Cas9遗传筛选，发现位于HOXA7/HOXA9基因之间的CTCF结合位点（CBS7/9）是致癌性染色质结构域的关键调控元件，同时在维持MLL重排的急性髓系白血病（AML）中异常的HOX基因表达模式方面也具有重要作用。因此，该sgRNA文库筛选方法为研究CTCF介导的特定基因座基因组结构组织提供了新的见解，并为在人类基因组计划完成后的时代，对编码和非编码的注释遗传调控元件在正常生物学过程中的功能特征分析奠定了基础。

CRISPR-Cas9 技术是一种用于功能基因组学研究的强大研究工具，正在迅速取代传统的基因编辑技术，在全基因组范围和单个基因靶向应用中均具有高度实用性。此处介绍的首个 individually cloned loci-specific CRISPR-Cas9-arrayed sgRNA 文库包含 1,070 条 sgRNA，由靶向 303 个随机选择基因的 sgRNA、60 条阳性对照、500 条非人源靶向对照以及 207 条靶向 CTCF 元件或 lncRNA 基因的 sgRNA 组成，共分装于四个 HOX 位点（图1, 表1。该文库靶向所有CTCF核心结合基序， HOX 基因相关的长链非编码RNA、已知的调控元件以及若干 HOX 基因作为阳性对照在 HOX 位点。它还包含靶向随机非HOX 基因、非人类基因及基因间区域作为阴性对照。为提高通过lentiCRISPR转导实现CTCF位点敲除...

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX 位点中的功能。

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

由CTCF介导的稳定拓扑关联结构域（TADs）在限制DNA元件间的相互作用中发挥关键作用……

我们采用的合并sgRNA文库筛选是一种强大的遗传学方法，可用于识别和评估基因组中非编码元件的生物学功能。该技术使我们能够研究破坏结合位点、染色质边界或其他调控元件后对靶基因表达的影响。本方法可用于鉴定CTCF、长链非编码RNA以及增强子在早期胚胎发育过程中对HOX基因调控的作用，也可用于研究具有异常HOX基因表达特征的某些白血病。从设计靶向CTCF结合位点的sgRNA开始本实验。按照文本方案中所述，在细胞准备过程中将sgRNA文库克隆。为包装慢病毒，将20微克纯化的文库载体、15微克包装质粒和10微克包膜质粒共同转染HEK293 T细胞，转染48小时后收集病毒。48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45微米低蛋白结合PVDF膜过滤。接着，使用浓缩器将慢病毒上清液浓缩50倍。将浓缩后的病毒分装，并储存于-80摄氏度冰箱中。在12孔板的各个独立孔中，将MOLM13细胞与不同剂量的浓缩慢病毒混合，共设六个组。立即将这些混合物在33摄氏度下以1000 × g离心两小时。随后将12孔板转移回37摄氏度、5% CO₂的培养箱中孵育四小时。轻轻吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，用新鲜的添加补剂的RPMI 1640培养基重悬转导后的细胞。随后将重悬的细胞转移至T25培养瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，期间不加入嘌呤霉素。48小时后，将这些细胞分至两个培养瓶：实验组加入1微升/毫升嘌呤霉素处理5天，对照组则不加嘌呤霉素处理5天。通过将经嘌呤霉素处理的活细胞数量除以未经嘌呤霉素处理的细胞数量，测定转导的最佳感染复数（MOI）值。使用混合文库进行细胞转导时，在6孔板中用0.3 MOI的sgRNA混合慢病毒感染150万个MOLM13细胞。以未感染慢病毒的细胞作为对照。立即将六孔板在33摄氏度下以1000 × g离心两小时，以实现细胞的旋转感染（spinfection）。随后，将培养板转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育四小时。轻轻吸除上清液，避免扰动细胞层，然后用新鲜培养基重新悬浮转导后的细胞。然后，将细胞转移至T25培养瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，不添加嘌呤霉素。48小时后，用1微克/毫升嘌呤霉素处理细胞，持续5天。两天后更换新鲜培养基，并维持最佳细胞密度。采用有限稀释法将单克隆接种至96孔板中。在37摄氏度及5%二氧化碳条件下培养这些单克隆，培养时间为3至4周。用0.4%台盼蓝溶液染色后计数整合了sgRNA的MOLM13细胞，然后将10,000个活细胞转移至96孔PCR板的每个孔中。以1000 × g离心5分钟，随后用移液器彻底移除并弃去上清液。注意不要扰动细胞沉淀。按照文中所述洗涤细胞后，向每孔加入50 µL细胞裂解主混合液。用移液器吹打5次，重新悬浮细胞沉淀。室温孵育10分钟。然后，将混合物在37摄氏度孵育5分钟，再于75摄氏度继续孵育5分钟。现在，向含有RT qPCR反应混合液的PCR孔中加入1 µL细胞裂解液。该混合液包含目的基因的正向与反向引物、逆转录酶以及一步法反应混合液。在50摄氏度下进行逆转录反应10分钟，随后在95摄氏度下进行1分钟的聚合酶激活和DNA变性。按照文本方案中所述，进行40个循环的RT-PCR反应。通过Sanger测序验证HOXA9表达降低的克隆，并按照文本方案中所述，以MOLM13基因组DNA为模板进行PCR扩增。使用PCR纯化试剂盒提取并纯化PCR产物。将纯化的PCR产物与T4连接缓冲液、T载体DNA、PCR DNA及T4连接酶在T载体内进行连接反应。将连接混合物置于16摄氏度的培养箱中过夜孵育。将连接反应产物转入DH5 alpha感受态细胞，并涂布于LB氨苄青霉素抗性琼脂平板上。在37摄氏度条件下过夜培养平板。从LB平板上挑取单克隆，通过基因型鉴定和Sanger测序进行验证。在0.2毫升PCR管中，设置异源双链混合组，包含200纳克参考PCR扩增子和200纳克待测PCR扩增子。同时设置同源双链混合组作为对照，仅包含400纳克参考PCR扩增子。将异源双链和同源双链混合物分别置于盛有800毫升水的1升烧杯中，在95摄氏度下孵育5分钟。然后，将混合物逐渐冷却至室温，以退火形成异源双链或同源双链。现在，分别用1微升插入缺失突变检测核酸酶和2微升核酸酶反应缓冲液，在42摄氏度下对400纳克退火后的异源双链和同源双链混合物进行消化，反应60分钟。采用琼脂糖凝胶电泳分析消化后的样品。杂合双链DNA应被切割成小片段，而同源双链DNA不应被切割。通过RT-qPCR方法检测HOXA9基因的表达水平，并与对照细胞进行比较，确认了靶向MOLM13阳性克隆的sgRNA。在筛选的528个存活克隆中，有10个克隆的HOXA9表达水平降低了50%以上。通过PCR扩增sgRNA并进行Sanger测序，进一步验证了整合到HOXA9表达降低、HOXA9表达不变以及HOXA9表达升高克隆中的sgRNA。在Sanger测序确定的10个HOXA9水平降低的克隆中，有6个含有靶向CBS79位点的sgRNA。通过基于PCR的基因分型和核酸酶消化法确定了整合sgRNA阳性克隆的插入缺失（indel）突变。通过基于PCR的基因分型鉴定出位于HOXA7和HOXA9基因之间的CTCF位点存在杂合缺失。HOXA9表达降低的克隆5、6、28和121在CBS79边界位置均表现出缺失。在通过核酸酶消化实验分析CBS79位点的插入缺失突变时，也观察到类似结果。进行此操作时，为了通过核酸酶消化实验检测sgRNA诱导的插入缺失突变，重要的是要生成等量的异源双链和同源双链。我们的方法能够利用所选标记，对目标基因进行下一代测序，以揭示该基因在白血病发生中的作用。总体而言，我们的方法可防止在死后基因组计划的正常生物学过程及白血病发生过程中，出现功能性正确但减少已知遗传异常元件的冗余克隆（RPC）错误。

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公司重点调查的社区图书馆筛选确定关键 CTCF 边界

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关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

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果蝇细胞核内Hi-C技术

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通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

改进CAR T细胞中CRISPR-Cas9筛选：一种优化的文库构建方法

探索利用HOX基因座特异性sgRNA文库筛选技术，研究CTCF边界在基因调控中的作用机制。该方法通过CRISPR技术靶向CTCF结合位点，揭示非编码元件对HOX基因表达的影响，为早期胚胎发育和白血病研究提供新见解。

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

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