利用血脑肿瘤屏障在盘中进行活体有效载荷传递预测

针对中枢神经系统肿瘤的药物靶向是一项重大挑战。在这里, 我们描述了一个协议, 以产生一个体外模拟血脑肿瘤屏障使用小鼠和/或人类细胞, 并讨论其与中枢神经系统肿瘤靶向在体内的相关性。

为了开发针对中枢神经系统肿瘤的新药和化合物，通过血脑屏障的可及性和通过非常重要。虽然可以通过用治疗分子孵化细胞来轻松测量化合物的细胞毒性，但它并不能真正说明实际在大脑中的肿瘤位点传递。为了解决这个问题，我们开发了以下协议，描述如何在菜体外重新创建血脑肿瘤屏障。

使用不朽的穆林或人类起源的细胞，使这种测定非常灵活。它还可轻松放大以筛选数十种具有高可重复性化合物。此外，在进行临床前模型之前，该方法还允许对化合物的通过和定位能力进行定量和可视化。

因此，我们的方法部分取代了动物模型使用预先建立的细胞系。包括患者衍生的脑肿瘤细胞检测患者的异质性，而使用不朽的细胞建立血脑屏障，确保结果的可重复性。总之，这种血脑屏障模型提供了一个非常有趣的工具，以检测药物扩散或药物车辆的交付。

该方法的可视化演示至关重要，因为插入体对对面的单元的种子需要操作，而使用类似设置的其他协议中并不经常描述的操作。例如，当插入物倒置时，获得星核细胞的粘附性，从视觉表示中非常有益。在无菌细胞培养罩下，用五毫升无菌PBS小心清洗培养的星细胞。

使用真空泵轻轻丢弃PBS，并添加两毫升细胞分离试剂五分钟以分离细胞。然后，在容器中加入10毫升无菌完整的星细胞培养，以抑制细胞分离试剂的活性。使用无菌血清移液器将分离的细胞从容器转移到无菌的15毫升管。

在室温下以250倍g离心3分钟。同时，设置插入件。使用无菌钳子将大脑侧向上的刀片放在无菌六井板的盖子上。

离心完成后，小心地从细胞悬浮液中丢弃上经，然后通过轻轻移液管壁上的颗粒五次，将星细胞颗粒重新悬浮在一毫升的 ABM+中。然后，计算细胞数，并将细胞悬浮密度调整为15万个细胞，每插入400微升的反导加。将细胞悬浮液放在插入膜的脑侧中间，用带无菌移液器尖端的毛细管力小心地将其传播。

当刀片的脑侧仍然向上时，将六井板放回刀片上。将板和插入，与大脑侧向上，进入孵化器在37摄氏度和5%的二氧化碳，以允许细胞粘附。在此之后，将六井板恢复到其正常位置，插入物现在血侧向上。

添加介质，继续如文本协议中概述的孵化。在无菌细胞培养罩下，用五毫升无菌PBS小心清洗培养的内皮细胞。使用真空泵轻轻丢弃PBS，并添加两毫升细胞分离试剂五分钟以分离细胞。

然后，在容器中加入10毫升无菌完整的内皮细胞培养，以抑制细胞分离试剂的活性。使用无菌血清移液器将分离的细胞从容器转移到无菌的15毫升管。在室温下以250倍g离心3分钟。

在此之后，丢弃上经剂，将内皮细胞颗粒重新悬浮在一毫升EBM+中，缓慢将细胞悬浮液移液在管壁上长达五次。计算细胞，并将细胞悬浮密度调整为20万细胞，在2.5毫升内皮细胞培养中，不含血清和血管内皮生长因子-A每个插入。取回包含刀片的板。

小心地从血侧丢弃介质，代之以2.5毫升的内皮细胞悬浮液。然后，将板返回到培养箱，并在夜间离开，让内皮细胞粘附在膜上。第二天，准备一个六井板，将三毫升预热的反导减到每一个井。

使用无菌钳子，处理刀片，小心地从血侧丢弃内皮完整介质，并将插入物放入含有 ABM-减号的新板中。然后，添加 2.5 毫升 EBM 减。将刀片留在培养箱中，以最小的物理干扰或温度变化保留五天。

在传输当天，更换介质。对于免疫荧光成像，将多达四个圆形无菌硅酸盐盖玻片放入含有两毫升聚D-晶硅氨酸的六孔板的每个孔中。在室温下孵育30分钟。

同时，使用无菌血清移液器小心地将肿瘤球体从细胞培养容器转移到15毫升的无菌管中。将肿瘤球体以250倍g离心三分钟。丢弃上一杯，轻轻将球体重新在一毫升的 GBM 减量中重新暂停。

计算细胞数，将细胞密度调整为每毫升GBM-减号约10000个球体或10万个细胞。接下来，从井中丢弃聚D-利氨酸，然后用无菌PBS冲洗井三次。用三毫升的肿瘤球状悬浮液播种板的每个井，并将BBTB模拟的插入物转移到肿瘤细胞悬浮液上。

在37摄氏度下孵育过夜，用5%的二氧化碳使检测的血液和脑肿瘤两侧达到平衡。第二天，用EBM-减号代替血侧的介质，并辅以感兴趣的分子、药物或纳米粒子。收集样品随着时间的推移直接量化，如前所述。

首先，从BBTB模拟的血液和大脑两侧收集100微升的介质，并分别转移到一个单独的平底、黑色、96井板，以便随后进行荧光测量。接下来，在EBM-减号中准备一个50微摩尔氟素钠溶液，确保每井准备2.5毫升。将溶液预热至37摄氏度，用含有这种氟化钠溶液的介质取代刀片的血侧介质。

更换介质后，立即开始计时器。在5分钟、30分钟、60分钟和120分钟时，从插入物的血液和大脑两侧仔细收集100微升介质。将每个样品转移到适当的黑色 96 孔板的分离井中。

使用板读卡器从采集的样品中量化荧光。首先，在预热介质中稀释利索索姆荧光染料至适当的工作浓度。将此添加到细胞中，在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育45分钟。

然后，用冰冷的PBS冲洗细胞三次。丢弃 PBS，在井中加入三毫升冰冷 4%半甲醛，在刀片中加入 2.5 毫升。在冰上孵育10分钟。

在此之后，丢弃甲醛，并用PBS冲洗细胞三次。取出PBS，并使用DAPI溶液在蒸馏水中每毫升1微克的最终浓度对细胞核进行反污。在室温下孵育7分钟。

然后，取出DAPI，用蒸馏水洗三次膜。小心地切开膜，取出蒸馏水，并将其放在玻璃显微镜幻灯片上的一滴安装介质上。在膜的另一侧再加入一滴安装介质，并小心地用硅酸盐盖玻璃盖住。

在这项研究中，内皮细胞与星形细胞共同培养，在体外设置中形成血脑肿瘤屏障样界面。murine BBTB 模拟的共声成像显示了 bEND3 中紧密结点蛋白分区-1 和克劳丁-5 的表达和细胞定位。与 bEND3 单培养物相比，内皮细胞和星细胞之间的接触显然诱导这两种蛋白质重新定位到内皮细胞对细胞接触。

利用免疫荧光染色来可视化膜脑侧的 GFAP 表达星细胞，可以观察和研究通过膜接触内皮细胞的星体过程和末脚。为了将体外BBTB模拟的渗透值与体外血脑屏障进行比较，通过植入裸鼠的颅窗对氟素钠的实时扩散进行成像。使用荧光立体显微镜，在探头系统注射之前、期间和之后，记录从主皮亚尔血管中衍生出的血管毛细血管中荧光素钠。

然后比较针对患者衍生胶质母细胞瘤球体的纳米粒子的转囊，以说明 BBTB 模拟如何用于可视化化合物从血侧到大脑侧的传递。NP110相关的荧光信号与内皮细胞、星细胞和肿瘤细胞中的利索体共同位化。此外，NP110在内皮细胞和星细胞之间检测到，通过插入的膜孔隙。

NP110的通过通过测量从血液和大脑两侧的样本中采集的荧光进行量化，这些值与350纳米的确定纳米粒子进行比较。可以看到，只有NP110能够穿过BBTB模拟，而NP350留在血液侧，导致这些纳米粒子的渗透率较低。小心处理刀片，并小心地将星细胞悬浮液扩散到刀片的大脑侧，而不直接接触膜。

膜的任何损坏都会导致泄漏。这种方法可以适应，以回答大脑传递外围管理的有效载荷的问题。通过使用具有较大膜孔隙的不同插入物，也可以研究细胞外创。

可以通过使用不同的细胞类型来模拟其他细胞屏障来修改此技术。它还为更负责任和合乎道德的研究铺平了道路，旨在减少用于抗癌药物验证的实验室动物的数量。请记住，甲醛是一种非常有毒的化学物质，应进行相应的处理。

此外，在使用锋利的手术刀从刀片中提取膜时要小心。