Name: 利用血脑肿瘤屏障在盘中进行活体有效载荷传递预测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学习利用小鼠和人类细胞在体外构建血脑肿瘤屏障模型，用于预测中枢神经系统肿瘤的药物靶向递送效果。该方法可量化药物通过屏障的能力，减少动物实验需求。

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本研究获得了芬兰癌症组织、Jane &amp; Aatos Erkko 基金会和Sigrid Juselius基金会（资助P.L.和V.L.J.）、瑞士国家科学基金会（高级博士后流动资助号：P300PB_164732，资助S.K.）、Orion研究基金会（资助S.K.）、Maud Kuistila纪念基金会（资助S.K.）以及芬兰科学院（TERVA 2017，资助号：314 498）的资助。特此感谢Biomedicum影像中心（赫尔辛基）提供显微成像核心设施。

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作者无任何利益冲突需要披露。

患者间肿瘤异质性概念的兴起推动了个体化癌症治疗研究的发展21。这种异质性同样是中枢神经系统肿瘤的显著特征。由于肿瘤行为的不可预测性，化疗反应与血脑屏障（BBB）对药物递送的阻碍效应叠加，共同构成了临床治疗中的重大挑战22。为了开发更有效的治疗方法，通常需要对大量新分子库进行筛选。评估新型治疗候选物的抗肿瘤效果及其到达肿瘤部位的能力，最佳选择是在小鼠患者替身模型中开展基于患者来源细胞的体内临床前研究。然而，由于实际因素（经费、时间、人力和设施资源）以及伦理考量（使用实验动物时需遵循3R原则），建立大规模体内筛选平台往往难以实现，因此基于细胞的检测方法仍然是首选模型23。选择已建立的细胞系而非原代细胞的主要原因在于提高实验可重复性，并减少对实验动物的使用——后者是分离和建立原代小鼠细胞培养的主要来源。本文所介绍的方法严格遵循3R原则，可高效排除那些无法穿透模型血脑肿瘤屏障（BBTB）的纳米颗粒，从而避免其进入后续的临床前研究。作为原理验证，本文描述了在BBTB模型构建与验证过程中获得的研究结果。例如，在测量376 Da的荧光素钠被动扩散时，我们成功地在体内验证了体外实验结果。&#160;
本文所述方案描述了在体外构建系统中，通过内皮细胞与星形胶质细胞共培养以形成类似血-脑肿瘤屏障（BBTB）界面的制备方法。当这两种细胞类型之间建立物理接触后，内皮细胞层表现出与血脑屏障（BBB）相似的特性（例如紧密连接蛋白在细胞表面的表达以及相对较低的通透性）。有趣的是，小鼠来源的BBTB模拟模型在Na-Fl通透性方面似乎与体内小鼠BBB通透性测量值非常接近24。因此，BBTB模拟模型的性能将直接取决于用于构建屏障的细胞选择。bEND3内皮细胞来源于脑组织，已知在与星形胶质细胞共培养时能够成功形成屏障25。然而，我们采用的是永生化的HIFko星形胶质细胞26来构建BBTB模拟模型。由于这些星形胶质细胞缺乏缺氧诱导因子，不会产生VEGF-A，而这对于本研究中所述BBTB模拟模型的稳定至关重要。星形胶质细胞已被确认为BBB通透性的调节因子，例如在神经炎症反应中通过释放VEGF-A发挥作用27。血管内皮生长因子受体（VEGFRs）的激活是体外28和体内29内皮/血管通透性的关键调控因子。因此，培养基中添加的VEGF-A会激活内皮细胞上的VEGFR2，从而诱导黏附连接蛋白（如VE-钙黏蛋白）发生磷酸化30。内皮细胞间连接的丧失会导致血管通透性显著升高。类似地，细胞培养实验中使用的胎牛血清具有强烈的促有丝分裂特性且其成分不明确，这也会对屏障的稳定性和实验的可重复性造成重大问题。
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）有时被用于体外构建血脑屏障（BBB）31；然而，它们在基因表达和屏障形成特性方面与脑微血管内皮细胞（如hCMEC/D3细胞系）32存在显著差异。尽管单独培养的HuAR2T细胞相比bEND3细胞表现出相对较高的通透性，但当其与人原代星形胶质细胞共培养时，通透性显著降低。虽然内皮细胞是形成细胞屏障所必需的，但显然星形胶质细胞在血脑肿瘤屏障（BBTB）的形成与稳定过程中同样发挥着至关重要的作用。
当将患者来源的胶质瘤细胞球体加入该体系后，小鼠血脑肿瘤屏障（BBTB）模型重现了某些小鼠异种移植瘤的特征，例如药物通过脑血管系统的扩散以及对肿瘤细胞的靶向作用。例如，在筛选多种不同直径的纳米颗粒时，本文所述的BBTB模型成功模拟了体内行为。为了说明体外模型与体内模型之间的对应关系，我们采用了先前描述的介孔硅酸盐纳米颗粒33 具有细胞穿透特性34 与肿瘤靶向肽CooP在其表面偶联20。CooP靶向肽通过特异性结合乳腺源性生长抑制因子（MDGI）靶向侵袭性肿瘤细胞。多种癌症（包括胶质瘤）中MDGI的表达水平均高于正常组织35，这使得CooP成为一种高效的肿瘤靶向部分，能够增强载荷的递送20此处使用的纳米颗粒此前已被证明可扩散至脑实质（27547955），当其用紫杉醇功能化后，这些纳米载体在临床前模型中已成功抑制胶质瘤的生长。36在纳米颗粒表面添加聚乙二醇（PEG）残基亦可使其静态电荷保持在正值（约 +4 mV），从而促进与神经血管单元的更好相互作用37 同时提高其在循环中的稳定性。在本研究的数据中，NP110s 被偶联了 3 kDa 的 PEG，而 NP350s 则包被了 10 kDa 的 PEG。然而，分子量更高的 PEG 也导致纳米颗粒直径显著增加，从而影响其穿越血脑屏障（BBB）的物理能力。因此，我们检测了颗粒的物理尺寸是否阻碍其通过血脑肿瘤屏障（BBTB），以及这些观察结果是否能在体内得到印证。
与先前已发表的观察结果一致，我们发现 NP110s 能够穿过体外血-脑肿瘤屏障（BBTB）以及颅内肿瘤小鼠的血-脑屏障（BBB），而 NP350s 则滞留在 BBTB 模型的管腔侧以及小鼠的血管内。这些相似的结果强烈表明，BBTB 模型能够预测纳米颗粒在体内穿越血-脑屏障并进入大脑的能力。&#160;
血脑屏障（BBB）的细胞模型的相关性经常被讨论，即使在纳米颗粒中枢递送的研究中也是如此38。本文表明，通常被认为是最具相关性的原代星形胶质细胞和内皮细胞，可以被永生化细胞和/或商业可获得的细胞所替代，从而提高实验的可扩展性和可重复性。下一代体外血脑屏障模型可通过整合微流控装置来构建，从而形成结构上高度模拟真实血脑屏障的神经血管单元12,14。然而，由于递送过程的后续监测存在技术限制，这类模型目前尚不适用于胶质瘤靶向分子的高通量筛选14。在培养皿中准确再现血脑屏障的生理复杂性确实存在困难，某些已知由血脑屏障表达的受体或蛋白的缺失可能会影响结果的解释。另一个问题是体内与体外条件下基因表达存在显著差异，不同细胞系之间也存在较大变异，尤其是内皮细胞。然而，也有人指出，神经血管单元在脑内并非均一的结构实体39。生物学研究已进入一个更加注重人道的时代，在设计实验前，动物福利、伦理责任以及使用动物所涉及的成本始终被纳入考量。因此，为了推动动物实验的替代，越来越多的近期研究表明，充分认识模型的局限性，并谨慎选择用于构建屏障的细胞模型——特别是星形胶质细胞——能够使体外实验结果与动物模型结果之间具有良好的一致性40。通过本文所述的方法，我们在减少用于潜在治疗药物血脑屏障转胞吞筛选所需的实验动物数量方面又迈进了一步。

神经血管单元由神经元、星形胶质细胞以及血脑屏障（BBB）组成，后者由周细胞、星形胶质细胞、内皮细胞及其相关的基底膜之间复杂的连接共同构成脑微血管系统1。这种由连续性、无窗孔的血管形成的紧密细胞屏障，可精细调控离子和分子（包括激素、营养物质或药物）以及循环细胞的通过1。高分子量物质（如治疗性抗体、药物偶联物或纳米化合物）在血脑肿瘤屏障（BBTB）中的跨细胞转运显著受限，这极大地阻碍了包括恶性胶质瘤在内的神经系统疾病药物研发的进展2。事实上，口服或静脉给予的化疗药物往往只能以不足以产生抗肿瘤效应的低浓度到达脑实质，或者根本无法穿过BBTB到达肿瘤细胞3。一些临床前和临床研究并未解决BBTB穿透问题，而是尝试暂时性破坏BBTB，例如采用聚焦超声技术4,5，或通过药物原位直接递送以绕过该屏障6。然而，这些方法均未能有效遏制肿瘤不可避免的扩展或复发。因此，在开发新型抗胶质瘤疗法时，应将药物通过BBTB的扩散能力视为治疗剂成功递送的关键因素之一7。
由于血脑肿瘤屏障（BBTB）内细胞相互作用极为复杂，研究分子从血液进入大脑的过程时，对实验动物进行体内研究似乎是显而易见的选择。然而，大规模的体内方法建立起来相对复杂，因此难以在合理的时间和成本范围内实现对分子的高通量筛选。更为重要的是，动物实验必须遵循“3R”伦理准则，即：i）优化（refine），ii）减少（reduce），以及在当前背景下尤为相关的 iii）以替代性方案（如体外或计算机模拟方法）进行替代（replace）。因此，体外重建BBTB成为一个有趣且具有吸引力的选项，但这同时也是一项面临多种限制的复杂任务。已有大量研究尝试利用犬源、猪源、鼠源甚至人源的原代细胞或细胞系在体外重建这一复杂结构（如Rahman等8和Helms等9所综述）。这些模型包括三维微流控系统10、芯片上的血脑屏障（BBB-on-a-chip）11,12，以及基于经典Transwell共培养系统的多种变体。然而，目前的微流控和芯片系统要么不适合快速、高通量的药物验证研究13,14，要么目前尚无法兼容针对脑肿瘤药物递送的研究。此外，对155种已发表模型的回顾显示，这些模型使用原代细胞、诱导性多能干细胞（iPSC）或商业细胞系，并均在Transwell系统中进行共培养，但其测量结果和/或结论存在显著的实验室间差异趋势8。这种实验室间重复性差的现象可能与以下因素相关：i）培养条件未标准化，例如是否选择性地在细胞培养容器中包被基底膜基质蛋白；ii）过度传代以及使用含血清培养基，这两者均为细胞系遗传和表型改变的主要驱动因素15；或iii）在培养皿中难以可重复地重建星形胶质细胞与内皮细胞组分之间的恰当平衡。尽管使用永生化细胞或商业细胞系建立的体外BBB模型在某些特性上不如仅使用原代细胞的模型，但在本研究所述方法中，我们证明了特定的细胞组合在功能表现上与已发表的其他参考模型具有高度可比性16,17。最终，由于目前缺乏一种稳定且可重复的模型用于研究治疗性化合物通过BBTB向脑肿瘤递送的过程，促使我们开发了本文所述的方法。
由于该模型的目标是用于预测纳米颗粒在临床前动物模型中的体内递送效果，我们首先利用含有与小鼠星形胶质细胞接触的小鼠内皮细胞的插入式培养装置对BBTB模型进行了验证。此外，我们还优化了该模型以使用某些人源细胞系。待细胞屏障稳定后，将其转移至含有患者来源的胶质母细胞瘤球体或商品化胶质瘤细胞系的培养体系中。随后，可通过共聚焦显微镜观察纳米颗粒的跨细胞转运及对肿瘤细胞的靶向作用，并通过随时间收集样本进行定量分析。重要的是，使用BBTB模拟模型获得的结果能够可靠地预测纳米颗粒在体内的行为，支持在临床前验证之前应用BBTB模拟模型。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>培养条件：DMEM（1 g/L 葡萄糖）添加 10% FBS、5 mL L-谷氨酰胺和 5 mL 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>HIFko 永生化小鼠星形胶质细胞</td><td>由 Gabriele Bergers 博士实验室分离</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>培养条件：BME-1 添加 5% FBS、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠、3 g D-葡萄糖和 5 mL 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>HuAR2T</td><td>由 Dagmar Wirth 博士实验室分离</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td><td>培养条件：EBM-2 加 SupplementMix</td></tr><tr><td>正常人原代星形胶质细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td>培养条件：ABM 加 SingleQuots</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 17 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM 基础培养基，500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>用于人原代星形胶质细胞。ABM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。ABM-：除 rhEGF 和 FBS 外的所有添加剂</td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离溶液</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots 补充剂和生长因子</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>用于 GBM+ 和 GBM- 培养基</td></tr><tr><td>基础培养基伊格尔（Basal Medium Eagle）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>Corning Costar TC 处理 6 孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>溶于 50 mL BME-1 中，过滤除菌后加入培养基</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham）</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>专用于本实验室分离的患者来源类球体培养，其他胶质瘤细胞系可能不同</td></tr><tr><td>EBM-2 生长培养基 SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂</td></tr><tr><td>内皮基础培养基 2（EBM-2）</td><td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂。EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经认证、热灭活、欧盟批准、南美来源</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>黑色聚苯乙烯平底孔（带 micro-clear 底部）</td></tr><tr><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser 0.9 cm 圆形硼硅酸盐盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>每升 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中加入一片，然后通过高压灭菌对溶液进行灭菌</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td><td>用于 GBM+ 培养基</td></tr><tr><td>重组人碱性 FGF（154 个氨基酸）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>用于 GBM+ 培养基</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫荧光&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24 mm × 60 mm 显微镜载玻片盖玻片</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 和 594 二抗</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>抗 Claudin-5 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>稀释比例：1/150</td></tr><tr><td>抗 GFAP 抗体，克隆 GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>稀释比例：1/150</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31&amp;nbsp;抗体，克隆 MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>稀释比例 1/800</td></tr><tr><td>抗 SV40 T-抗原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>稀释比例：1/150</td></tr><tr><td>抗 Zonula Occludens-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片介质&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物实验操作&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 弯头解剖剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子（12.5 cm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>用于组织解离</td></tr><tr><td>Intramedic 聚乙烯导管 PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>氯胺酮</td></tr><tr><td>电动微型钻机</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser 0.5 cm 圆形硼硅酸盐盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>微型血管夹</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>Mustela</td><td>无菌单剂量小瓶 20 × 5 mL / 40 × 5 mL - 医疗器械类</td><td></td></tr><tr><td>Rochester-Oschner 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr148999</td><td>赛拉嗪</td></tr><tr><td>立体定位适配器</td><td>World Precision Instruments</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi 海绵头</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 荧光体视变倍显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 微孔板读数仪</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 数字 sCMOS 相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320 台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Hettich</td><td>Cat. No. 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 配备 Airyscan 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

血脑屏障（BBB）具有高度选择性，在生理条件下对维持大脑稳态至关重要。然而，在脑肿瘤情况下，BBB的分子选择性也会阻碍外周给药的化疗药物递送，从而保护肿瘤细胞。开发靶向恶性脑肿瘤的新药（包括纳米颗粒）时，理想情况下需借助临床前动物模型来研究药物的跨细胞转运能力及其抗肿瘤效果。为了遵循“3R原则”（优化、减少和替代），减少实验中实验动物的使用数量，并实现大规模抗肿瘤药物库的高通量筛选，我们建立了一种可重复的体外人源和鼠源血脑肿瘤屏障（BBTB）模型，该模型采用内皮细胞、星形胶质细胞与患者来源的胶质母细胞瘤球体三层共培养系统。为了提高可扩展性和可重复性，本模型在特定条件下使用商业细胞系或永生化细胞，以形成类似于真实BBB的屏障结构。本文描述了一种通过在插入式培养小室上以特定细胞密度共培养内皮细胞与星形胶质细胞来构建BBTB模拟模型的实验方案。该BBTB模拟模型可用于定量分析和共聚焦成像纳米颗粒穿越内皮和星形胶质细胞屏障的过程，同时在同一实验体系中评估药物对肿瘤细胞的靶向性。此外，我们证明所获得的数据可用于预测纳米颗粒在临床前动物模型中的行为表现。从更广泛的角度来看，该体外模型还可适用于其他神经退行性疾病，用于评估新型治疗分子穿越血脑屏障的能力，或结合脑类器官以直接评价药物疗效。

小鼠BBTB模型的共聚焦成像显示了bEND3细胞中紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens-1）和claudin-5的表达及细胞定位。与bEND3单层培养相比，内皮细胞与星形胶质细胞之间的接触明显诱导ZO-1和claudin-5向内皮细胞间连接处的重新分布图1D）。通过免疫荧光染色标记膜脑侧表达GFAP的星形胶质细胞，可观察并研究星形胶质细胞突起及其终足穿过膜与内皮细胞接触的情况（图1E）。已知星形胶质细胞与内皮细胞之间的接触可促进并稳定细胞屏障的紧密化，并与血脑屏障较低的通透性值相关。19. 与此一致，我们观察到小鼠血-脑肿瘤屏障模型对 Na-Fl 的通透性显著下降，从 27.63 降至&#177; 3.45) × 10-6 cm/s，在单培养情况下为6.74（&#177; 3.01) × 10-6 cm/s，当与低氧诱导因子敲除（HIFko）星形胶质细胞共培养时（表1）。永生化的HuAR2T细胞可形成高通透性的细胞屏障（104.92 &#177; 27.1 x 10-6 cm/s 表1）。与小鼠模型类似，我们测得BBTB对Na-Fl的通透性显著降低，即47.4（&#177; 14.32) × 10-6 cm/s，当HuAR2T细胞与人原代星形胶质细胞共培养时（表1).
在小鼠和人类的BBTB模型中，与仅含内皮细胞-星形胶质细胞共培养体系相比，患者来源的胶质母细胞瘤球体的存在导致通透性数值略有升高（表1）。该现象在多个但并非全部患者来源胶质瘤球体模型中均可观察到，可能与部分患者来源细胞分泌的VEGF-A有关。
为比较体外BBTB模型与体内BBB的通透性值，我们通过植入裸鼠颅窗实时成像观察了Na-Fl的扩散情况。使用荧光体视显微镜，在系统注射探针前后及过程中，记录了源自主要软脑膜血管的毛细血管中Na-Fl从血管内的扩散过程。图2C随时间测量循环血液与脑皮层实质中差异性荧光值的变化，使我们能够计算裸鼠血脑屏障的近似通透性数值’s BBB 对于 Na-Fl（5.57 &#177; 2.19 × 10-6 cm/s, 表1).
为了说明该血脑肿瘤屏障（BBTB）模型如何用于可视化化合物从血液侧向脑侧的转运过程，我们比较了跨细胞转运的差异 &#248; 110 nm（NP110）和 &#248; 靶向患者来源的胶质母细胞瘤球体的350 nm（NP350）纳米颗粒。体外实验结果随后与体内转胞吞作用进行了比较。在本示例中，纳米颗粒表面包被了肿瘤靶向肽CooP20 并用荧光染料（FITC）标记以利于观察。我们在BBTB模型的血液侧加入FITC纳米颗粒后24小时，使用溶酶体染料对细胞进行标记，并用DAPI复染，随后在不同层面（如血液侧、膜层、脑侧以及患者来源的胶质母细胞瘤球体）采集共聚焦显微图像（图 3A）。NP110 相关的荧光信号在内皮细胞、星形胶质细胞和肿瘤细胞中与溶酶体共定位。此外，在内皮细胞和星形胶质细胞之间检测到 NP110s，其穿过插入物的膜孔。图 3A).
通过测量从血液和脑组织两侧收集的样品的荧光强度，定量分析NP110s的通透性。将这些通透性数值与纳米颗粒的相应测定值进行比较。&#160;&#248; 350 nm（NP350）。结果表明，只有NP110能够穿过BBTB模拟物图3BNP350 保留在 BBTB 模型的血液侧，导致这些纳米颗粒的通透性值较低。
为了凸显BBTB模型相较于体内模型的相关性，将用肿瘤靶向肽CooP包被并偶联红色荧光染料（TRITC）的NP110或NP350纳米颗粒通过静脉注射到裸鼠体内进行检测。在多个时间点采集组织后发现，8小时后，能够穿透血脑屏障（BBB）的纳米颗粒已从血管渗出进入脑实质，而无法穿透的纳米颗粒则滞留在循环系统中，并主要被体内清除。因此，我们在注射后8小时采集了脑组织，并量化了每平方毫米脑组织中的纳米颗粒数量。与体外实验结果一致，只有NP110而非NP350成功渗入脑实质（图3C）。对纳米颗粒在脑内定位的高倍成像显示，NP110均匀分布在脑毛细血管外的脑实质中，并成功靶向至植入的胶质母细胞瘤细胞（图3D）。尽管具有相同的肿瘤靶向基团（CooP），NP350无法渗入脑实质，仅在脑血管管腔内被检测到（图3E），这与体外实验结果相似。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg" /> 
图1：血脑肿瘤屏障（BBTB）模型的描述。 (A不同细胞类型位置的示意图。B) 示意图展示将插入式培养小室置于6孔板盖上的位置，以及在插入式培养小室的脑组织侧接种星形胶质细胞的技术’膜。C) 星形胶质细胞黏附用6孔板放置示意图。D) 紧密连接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，上排，红色）和claudin-5（下排，绿色）的免疫荧光显微图像。蛋白表达情况比较了单独培养于BBTB血液侧的鼠脑微血管内皮细胞（bEND3）单层培养（左列）与共培养鼠永生化HIFko星形胶质细胞（右列）的情况。细胞核用DAPI复染（蓝色）。E免疫荧光显微图像显示培养于血脑肿瘤屏障（BBTB）脑侧的HIFko星形胶质细胞中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP，红色）。高倍镜图像显示星形胶质细胞的突起和终足（箭头）通过膜孔与内皮细胞接触（右图）。通过免疫荧光染色检测用于细胞永生化的猴病毒40大T抗原（SV40 large T，绿色）验证了HIFko星形胶质细胞的身份。内皮细胞不表达GFAP和SV40 large T，因此可通过膜对侧透明部分观察到仅被DAPI染色的细胞（虚线）。细胞核用DAPI复染（蓝色）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg" /> 
图 2： 小鼠血脑屏障通透性的活体实时测定。 （A）可植入尾静脉导管的制备过程。（1）所需工具和设备如下：（a）PE20 聚乙烯管（b）两根 25 G 针头（c）Rochester-Ochsner 镊子，以及（d）小型鳄嘴钳。（2）使用镊子通过多次扭转移除一根 25 G 针头，并（3）小心地将其插入聚乙烯管中。（4）将管子的另一端连接至另一根 25 G 针头。（B）导管植入与定位操作示意图，用于通过小鼠尾静脉灌注荧光素钠溶液。图中圆圈区域表示滴加氰基丙烯酸酯胶水以固定导管的位置。使用鳄嘴钳辅助导管操作，在导管固定后将其移除。（C）代表性成像与定量方法，用于测定荧光素钠通透性数值。在灌注荧光素钠之前（左列），在脑区（上图，白色矩形）和血管区域（下图，红色矩形）设置感兴趣区域（ROI），测量自发荧光/空白值。在荧光素钠灌注期间（右列），同步测量两个 ROI 内的荧光强度，从而计算血脑屏障通透性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg" /> 
图3：利用体外BBTB模型预测纳米颗粒通过血脑屏障的脑内转胞吞作用 (A) BBTB实验的图示及在小鼠BBTB模型不同水平获取的代表性共聚焦图像。将直径为110 nm、偶联FITC（绿色）的纳米颗粒（NP110）加入BBTB的血液侧。细胞用溶酶体探针（LT-99，红色）标记。 &#160;(1内皮细胞，2) 纳米颗粒通过膜孔（白色虚线）的内皮细胞转胞吞作用（3) 星形胶质细胞，以及 (4) 患者胶质母细胞瘤球体在图示及相应的共聚焦显微图像（右）中被识别。纳米颗粒的溶酶体包封（箭头）提示其通过血脑肿瘤屏障的内皮细胞层和星形胶质细胞层发生主动转胞作用。B) 体外定量测定所示纳米颗粒通过血脑肿瘤屏障（BBTB）的通透性n = 6). (C) 裸鼠尾静脉注射后8小时，脑组织切片中指定纳米颗粒密度的定量分析n = 3). (D) 共聚焦显微镜图像显示了分布情况 &#248; 110 nm 纳米颗粒（NP110，红色）在小鼠脑组织切片中与抗小鼠 CD31 抗体（绿色）共标。箭头指示纳米颗粒的转胞吞作用（左图）。由于颗粒表面展示的 CooP 靶向肽，纳米颗粒在脑肿瘤细胞周围（肿瘤，右图）富集。在正常脑组织（脑）中未观察到显著的靶向富集。E) 共聚焦显微镜图像显示了分布情况 &#248; 350 nm 纳米颗粒（NP350，红色）在经抗小鼠 CD31 抗体（绿色）标记的小鼠脑组织切片中的分布。箭头指示滞留在血管腔内的 NP350，其可能由于直径较 NP110 更大而无法穿越血脑屏障（BBB）。细胞核用 DAPI 复染呈蓝色。** P &#60; 0.01. P使用双尾非参数Mann-Whitney U检验计算P值。误差线表示标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>小鼠 BBTB 模型</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3+HIFko As</td>
			<td>bEND3+GB</td>
			<td>bEND3+HIFko As+GB</td>
			<td>体内</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>通透性 (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差 (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人源 BBTB 模型</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T+hIAs</td>
			<td>HuAR2T+GB</td>
			<td>HuAR2T+hIAs+GB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>通透性 (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差 (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在指定的共培养系统中体外测定以及在NMRI裸鼠体内测定的荧光素钠（Na-Fl）通透性值（单位：厘米每秒）。 数据来自一次代表性实验（n = 3 只小鼠）。

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。

血脑屏障（BBB）天生具有高度选择性，在生理条件下对维持脑内环境稳态至关重要。然而，在……背景下

为了开发靶向中枢神经系统肿瘤的新型药物和化合物，药物能否通过血脑屏障并到达病灶至关重要。尽管通过将细胞与治疗分子共同孵育可轻易测定化合物的细胞毒性，但这并不能反映药物实际递送至脑内肿瘤部位的情况。为解决这一问题，我们建立了以下实验方案，用于描述如何在培养皿中体外重建血脑肿瘤屏障。使用小鼠或人类来源的永生化细胞使该检测方法具有很高的灵活性。该方法还可轻松扩展，用于高通量筛选数十种化合物，并具有良好的可重复性。此外，该方法可在进入临床前模型研究之前，实现对化合物穿透能力和靶向能力的定量分析与可视化观察。因此，我们的方法通过使用已建立的细胞系部分替代了动物模型。纳入患者来源的脑肿瘤细胞可检测患者的异质性，而利用永生化细胞构建血脑屏障则确保了实验结果的可重复性。总体而言，该血脑屏障模型为检测药物扩散或药物递送载体的传递提供了极具价值的工具。该方法的可视化演示至关重要，因为在插入物的相反侧接种细胞需要进行特定操作，而类似实验设置的其他方案中通常未详细描述这些操作。例如，当插入物倒置放置时，星形胶质细胞的贴壁过程能够极大受益于直观的视觉展示。在无菌细胞培养罩内，用五毫升无菌 PBS 轻柔洗涤培养的星形胶质细胞。使用真空泵轻轻弃去 PBS，加入 2 毫升细胞解离试剂，作用 5 分钟以使细胞脱离。随后，向容器中加入 10 毫升无菌完全星形胶质细胞培养基，以抑制细胞解离试剂的活性。使用无菌刻度移液管将脱离的细胞从容器转移至无菌 15 毫升离心管中。在室温下以250 × g离心3分钟。同时，准备好插入物。使用无菌镊子将插入物置于无菌六孔板的盖子上，脑组织面朝上。离心结束后，小心弃去细胞悬液中的上清液，通过用移液器轻轻吹打管壁上的星形胶质细胞沉淀最多五次，将其重悬于1毫升ABM-plus培养基中。随后对细胞进行计数，并将细胞悬液密度调整为每400微升ABM-plus培养基中含有150,000个细胞，加入至插入式培养小室的膜脑侧中央。使用无菌移液器吸头，借助毛细作用力将细胞悬液小心铺展均匀。保持插入物的脑侧朝上，将六孔板重新放回到插入物上。将六孔板和插入物（脑侧朝上）放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，以促进细胞贴壁。此后，将六孔板恢复至常规位置，此时插入物的血侧朝上。加入培养基，并按照文本方案中所述继续孵育。在无菌细胞培养罩内，用五毫升无菌 PBS 轻柔洗涤培养的内皮细胞。使用真空泵轻轻弃去 PBS，加入两毫升细胞解离试剂，作用五分钟以使细胞脱落。然后，向容器中加入10毫升无菌的完全内皮细胞培养基，以抑制细胞解离试剂的活性。使用无菌的血清移液管将从容器中解离的细胞转移至一个无菌的15毫升离心管中。在室温下以250 × g离心3分钟。此后，弃去上清液，沿管壁缓慢吹打细胞悬液至多五次，将内皮细胞沉淀重悬于1毫升EBM-plus培养基中。对细胞进行计数，并将细胞悬液密度调整为每插入物中含200,000个细胞，溶于2.5毫升不含血清和血管内皮生长因子-A的内皮细胞培养基中。取出含有插入物的培养板。小心弃去血液侧的培养基，加入 2.5 毫升内皮细胞悬液。然后将培养板放回培养箱，过夜培养，使内皮细胞贴附于膜上。次日，将 3 毫升预热的 ABM-minus 培养基加入六孔板的每个孔中，以完成六孔板的准备。使用无菌镊子操作小室，小心地从血管侧弃去内皮细胞完全培养基，并将小室转移至含有 ABM-minus 的新培养板中。然后加入 2.5 毫升 EBM-minus。将小室置于培养箱中，避免受到物理扰动或温度波动，培养五天。在转染当天更换培养基。进行免疫荧光成像时，将最多四个圆形无菌硼硅酸盐盖玻片放入含有两毫升聚-D-赖氨酸的六孔板的每个孔中。室温孵育30分钟。同时，使用无菌的血清移液管将肿瘤球从细胞培养容器中小心转移至一个15毫升的无菌离心管中。在250 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，并用1毫升GBM-minus培养基轻柔重悬肿瘤球。计数细胞，并将细胞密度调整至每毫升无GBM培养基中约10,000个类球体或100,000个细胞。随后，弃去培养孔中的多聚-D-赖氨酸，用无菌PBS洗涤孔内三次。每孔接种3毫升肿瘤类球体悬浮液，并将含有BBTB模拟物的插入物转移至肿瘤细胞悬浮液上。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，使检测体系中的血液侧和脑肿瘤侧达到平衡。次日，将血液侧的培养基更换为添加了目标分子、药物或纳米颗粒的EBM-minus培养基。按照先前所述方法，随时间收集样品进行直接定量分析。首先，从 BBTB 模型的血液侧和脑侧分别收集 100 微升培养基，并将每份样品转移至单独的平底黑色 96 孔板中，用于后续荧光检测。接着，用 EBM-minus 配制 50 微摩尔的荧光素钠溶液，确保每孔准备 2.5 毫升。将该溶液预热至 37 摄氏度，并用含此荧光素钠溶液的培养基替换插入膜血液侧的原有培养基。更换培养基后立即启动计时器。在5分钟、30分钟、60分钟和120分钟时，小心从插入式培养小室的血液侧和脑侧分别收集100微升培养基。将每个样本转移至相应的黑色96孔板中的不同孔内。使用酶标仪定量测定所收集样品的荧光。首先，将溶酶体荧光染料用预热的培养基稀释至适当的工作浓度。将其加入细胞中，在37°C、5% CO₂条件下孵育45分钟。然后，用预冷的 PBS 洗涤细胞三次。弃去 PBS，向孔中加入 3 毫升预冷的 4% 多聚甲醛，向插入物中加入 2.5 毫升。冰上孵育 10 分钟。此后，弃去多聚甲醛，用 PBS 洗涤细胞三次。移除 PBS，使用终浓度为每毫升蒸馏水中含 1 微克的 DAPI 溶液对细胞核进行复染。室温孵育 7 分钟。然后，去除 DAPI，用蒸馏水将膜清洗三次。小心地裁剪膜，除去蒸馏水，并将其放置在玻璃载玻片上的一滴封片剂中。在膜的另一侧再加一滴封片剂，然后小心地用硼硅酸盐盖玻片覆盖。本研究中，内皮细胞与星形胶质细胞共培养，在体外构建出类似血脑肿瘤屏障的界面。小鼠血脑肿瘤屏障模型的共聚焦成像显示，在bEND3细胞中紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens-1）和claudin-5的表达及其细胞定位。与bEND3单层培养相比，内皮细胞与星形胶质细胞之间的接触明显诱导这两种蛋白重新定位至内皮细胞间的细胞连接处。通过免疫荧光染色标记膜脑侧表达 GFAP 的星形胶质细胞，可观察并研究星形胶质细胞的突起及其终足通过膜与内皮细胞的接触情况。为了将体外构建的血脑脊液屏障模型与体外血脑屏障的通透性数值进行比较，利用植入裸鼠颅窗的荧光立体显微镜，实时成像荧光素钠在体内的扩散情况。记录荧光素钠从软脑膜主要血管分支出的毛细血管中扩散的现象，分别在探针全身注射前、注射过程中及注射后进行观察。随后比较靶向患者来源的胶质母细胞瘤球体的纳米颗粒的跨细胞转运情况，以说明该血脑肿瘤屏障（BBTB）模型如何用于可视化化合物从血液侧向脑侧的转运过程。与NP110相关的荧光信号在内皮细胞、星形胶质细胞和肿瘤细胞中与溶酶体共定位。此外，在内皮细胞与星形胶质细胞之间可检测到NP110，其穿过插入膜上的膜孔。 通过测量从血液侧和脑侧收集的样品的荧光强度来定量 NP110s 的透过情况，并将这些数值与已确定的 350 纳米纳米颗粒的数值进行比较。可以看出，只有 NP110s 能够穿过 BBTB 模型，而 NP350 则保留在血液侧，导致这些纳米颗粒的通透性值较低。操作插入物时需小心谨慎，在插入物的脑侧接种星形胶质细胞悬液时应避免直接接触膜表面。膜的任何损伤都会导致泄漏。该方法可适用于研究外周给药的载荷在脑部的递送问题。通过使用具有更大膜孔径的不同插入物，还可用于研究细胞外渗。 通过使用不同类型的细胞，该技术可被改造以模拟其他细胞屏障。它还为更加负责任和符合伦理的研究铺平了道路，旨在减少用于抗癌药物验证的实验动物数量。请务必注意，多聚甲醛是一种毒性很强的化学物质，应谨慎操作处理。此外，使用锋利的手术刀从插入物中剥离膜时需小心操作。

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