Name: 核糖体组蛋白的体外泛化和二次基质测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学习体外泛素化和去泛素化实验方法，利用纯化组分研究组蛋白H2A修饰机制。该技术可鉴定关键酶结构域，筛选小分子抑制剂，为疾病治疗研究提供重要工具。

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感谢Diana Adjaoud提供的技术协助。本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（2015-2020年）、魁北克基因组学中心（2016-2019年）和加拿大基因组学中心（2016-2019年）向E.B.A.提供的资助。E.B.A.是魁北克健康研究基金会（FRQ-S）的资深学者。L.M和N.S.K.获得了FRQ-S的博士奖学金。H.B获得了突尼斯高等教育与科学研究部以及Cole基金会的博士奖学金。

1. GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 泛素连接酶复合物的 GSH-琼脂糖亲和纯化
<ol>
	<li>使用 pGEX6p2rbs-GST-RING1B（1-159 aa）-BMI1（1-109 aa）细菌表达载体转化 BL21（DE3）菌株（参见 材料表)23该质粒构建体可在pGEX-6P-2载体骨架中表达小鼠RING1B的1-159区段与BMI1的1-109区段的融合蛋白，并带有GST标签。</li>
	<li>接种表达 GST-RING1B（1-159 aa）- BMI1（1-109 aa）的 RIL 细菌至含 100 µg/mL 氨苄青霉素和 50 µg/mL 氯霉素的 20 mL LB 液体培养基中，进行过夜培养。于 37 °C 摇床中孵育过夜。次日，将该种子培养物按 1/26 体积比转接至含氨苄青霉素的 500 mL 新鲜 LB 液体培养基（1 L 三角瓶）中，于 37 °C 摇床中继续培养 2 至 4 小时。</li>
	<li>孵育期间，使用分光光度计在600 nm处测定OD值。当菌液培养物在600 nm处达到0.6 OD单位时，取1 mL等分试样置于1.5 mL离心管中，作为未诱导样品。向1 L培养物中加入400 µM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。将细菌在25 °C下孵育6小时至过夜。
	<ol>
		<li>将1 mL等份样品在14,000 x g 30秒后弃去上清液，将沉淀重悬于200 μL Laemmli样品缓冲液中，用于后续SDS-PAGE及考马斯亮蓝蛋白诱导分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将诱导后的菌液从烧瓶转移至洁净的离心管中，于3,500 x g 4 °C下离心15分钟。弃去上清液，用40 mL冷PBS重悬沉淀，于3,500 x g 4 °C下离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀在 -80 °C 冻存或直接进行下一步操作。若蛋白质在预期的分子量处被成功诱导，则进行下一步。</li>
	<li>将细菌沉淀重悬于25 mL预冷的裂解液中 缓冲液A （50 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP40，1 mM PMSF，0.5 mM DTT，以及1/100的含AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin和Pepstatin A的抗蛋白酶混合物）。确保所有细菌沉淀完全重悬。PMSF和抗蛋白酶混合物必须在细菌裂解前新鲜加入裂解缓冲液中。 
	注意： 始终将样品置于冰上。 
	注意： 可添加100 µg/mL的溶菌酶以增强细菌裂解。</li>
	<li>将细菌裂解液置于冰上孵育15 min。使用探头超声仪，以70%输出振幅超声处理30 s（重复4–5次），然后在21,000 x g 4 °C下孵育20分钟。 
	注意： 超声处理过程中，务必始终将样品置于冰上。</li>
	<li>离心期间，取500 µL 50%悬浮液的GSH-琼脂糖珠于15 mL离心管中，加入10 mL 缓冲液A 不添加PMSF和蛋白酶抑制剂。短暂混匀后，在4 °C下以2,500 g离心3分钟，重复此洗涤步骤两次，洗涤过程中磁珠始终置于冰上。</li>
	<li>细菌裂解液离心后，收集上清液并转移至50 mL锥形管中。取100 μL作为总裂解液，加入100 μL 2x Laemmli上样缓冲液，用于SDS-PAGE和考马斯亮蓝分析。</li>
	<li>将裂解液通过0.45 μm孔径的注射器滤器过滤，然后与GSH磁珠混合。4 °C条件下振荡孵育5 h。在2,500 x g 3 分钟后移除并保留上清液作为穿流液。用 5 mL 洗涤液依次洗涤蛋白质-GSH 结合珠 6 次（每次 5 mL） 缓冲液A 含蛋白酶抑制剂混合物和PMSF。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将珠子连同10 mL缓冲液转移至空的层析柱中，加入1.5 mL 缓冲液A 加入含25 mM谷胱甘肽的溶液，通过重力作用将洗脱液收集至1.5 mL微量离心管中。重复洗脱步骤4次。 
	注意： 谷胱甘肽储备液配制为200 mM浓度，溶于50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5</li>
	<li>从4次洗脱液中各取10 µL等分试样，加入10 µL 2× Laemmli上样缓冲液。这些样品将用于SDS-PAGE及考马斯亮蓝分析，以确定纯化蛋白的存在及纯度。 
	注意： 最后一次洗脱后，将磁珠保存在缓冲液中，于 4 °C 下储存，以备回收和后续使用。</li>
	<li>选择含有适量纯化蛋白的洗脱组分用于后续分析。将样品分成小份，于 -80°C 保存。通常蛋白浓度范围为 0.5 µg 至 2 µg 每 µL，样品可在此状态下长期保存。</li>
	<li>可选： 使用10K离心过滤装置浓缩样品或更换缓冲液</li>
</ol>
2. BAP1/DEUBAD（ASXL2）去泛素化酶复合物的纯化
<ol>
	<li>使用 pET30a+-His-BAP138 和 pDEST-MBP-DEUBAD（ASXL2）35 用于转化BL21 (DE3) RIL细菌以分别表达His-BAP1和MBP-DEUBAD的细菌表达载体。</li>
	<li>分别接种表达 His-BAP1 和 MBP-DEUBAD（ASXL2）的细菌，进行两组独立的过夜培养 在 20 mL 的 含50 µg/mL氯霉素以及每种质粒对应的抗生素（分别为100 µg/mL卡那霉素或100 µg/mL氨苄青霉素）的LB培养基。置于37°C摇床中培养。</li>
	<li>执行步骤 1.3–1.6。</li>
	<li>将细菌沉淀重悬于25 mL预冷的裂解缓冲液B（50 mM Tris pH 7.3，500 mM NaCl，3 mM β-巯基乙醇，0.2% Triton X-100，1 mM PMSF和1/100抗蛋白酶混合物）中。取等体积的His-BAP1与MBP-DEUBAD裂解液混合，冰上孵育15分钟。超声处理后，按照方案1（步骤9）所述条件离心裂解液。
	<ol>
		<li>离心期间，通过用500 µL预处理的Ni-NTA琼脂糖凝胶珠（50%悬液）洗涤三次来准备 缓冲液B 不含PMSF和蛋白酶抑制剂混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌裂解液离心后，收集上清液并转移至50 mL锥形管中。取100 μL上清液作为总裂解液样品，加入100 μL 2× Laemmli上样缓冲液。&#160;用于SDS-PAGE及考马斯亮蓝分析。</li>
	<li>将裂解液通过 0.45 μm 孔径的注射器滤器过滤，并与 Ni-NTA 珠混合。4°C 条件下振荡孵育 5 小时。在 2,500 x g 孵育3分钟，移除并保留上清液作为穿流液。
	<ol>
		<li>用5 mL溶液洗涤珠子6次 缓冲液B 含有 20 mM 1,3-二氮杂-2,4-环戊二烯（咪唑）。 
		注意：配制 pH 7.3 的 2 M 咪唑储备液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次洗涤后，将珠子用10 mL缓冲液转移至空的层析柱中，加入1 mL 缓冲液B 加入200 mM 咪唑溶液，通过重力作用将洗脱液收集至含有10 µL DTT（500 mM）和2 µL EDTA（500 mM，pH 8）的1.5 mL微量离心管中。重复洗脱步骤4次。取每次洗脱组分10 µL，加入10 µL 2× Laemmli上样缓冲液，用于SDS-PAGE及考马斯亮蓝分析。合并目标洗脱组分。 
	注意： 将珠子保存在缓冲液中，于 4 °C 下存放，以备回收和后续使用。</li>
	<li>用缓冲液 C（50 mM Tris pH 7.3，300 mM NaCl，1% Triton X-100，5 mM DTT，1 mM EDTA，1 mM PMSF 和 1/100 蛋白酶抑制剂混合物）将洗脱的复合物稀释 3 倍，再与直链淀粉琼脂糖 beads 孵育。
	<ol>
		<li>制备琼脂糖珠（500 µL 压实体积），用缓冲液洗涤 2 次 缓冲液 C 不添加PMSF和蛋白酶抑制剂混合物。将珠子加入稀释后的洗脱液中，4 °C下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 2,500 x g 3 分钟，保持流穿。用 5 mL 蛋白结合珠子洗涤 缓冲液 C (5–6倍)</li>
	<li>将纯化的 His-BAP1/MBP-DEUBAD 复合物保留在淀粉糖珠琼脂糖凝胶珠上 缓冲液 D （50 mM HEPES pH 8.0，50 mM NaCl，10% 甘油，1 mM DTT），于 -80 °C 保存。取 20 µL 比珠组分（50% 比珠溶液），加入 20 µL 2× Laemmli 上样缓冲液，用于 SDS-PAGE 及考马斯亮蓝分析。</li>
</ol>
3. 从HEK293T细胞中纯化核小体
<ol>
	<li>在补充有5%新生牛血清（NBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞。</li>
	<li>转染前一天，将约12 × 106个HEK293T细胞以每15 cm培养皿20 mL完全培养基接种（共使用10个培养皿）。转染前，将细胞培养基&#160;更换为12 mL无血清培养基&#160;，并使用63 µL浓度为1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）将21 µg pCDNA-Flag-H2A转染入细胞36。12小时后更换为完全培养基。</li>
	<li>转染后第三天，用15 mL预冷的PBS洗涤细胞两次，使用细胞刮刀将细胞收集于3 mL预冷PBS中。在4 °C下以2,100 × g离心8分钟。弃去PBS，进入裂解步骤或将细胞沉淀在-80 °C下冷冻保存。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于约10倍体积的缓冲液E（50 mM Tris-HCl pH 7.3，420 mM NaCl，1% NP-40，1 mM MgCl2，1 mM PMSF，1/100蛋白酶抑制剂混合物，以及20 mM N-甲基马来酰亚胺（NEM））中，冰上孵育20分钟。添加N-甲基马来酰亚胺（NEM）对于抑制与核小体共纯化的去泛素化酶（DUBs）至关重要。</li>
	<li>在3,000 × g下离心5分钟后，弃去上清液，将染色质沉淀重悬于10倍体积的缓冲液E中。通过倒置混匀，并在3,000 × g下离心5分钟。
	<ol>
		<li>使用缓冲液E再洗涤一次，随后使用缓冲液F &#34;MNase Buffer&#34;（20 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM KCl，2 mM MgCl2，1 mM CaCl2，0.3 M蔗糖，0.1% NP-40，1 mM PMSF，以及1/100蛋白酶抑制剂混合物）洗涤两次。 
		注意：洗涤和离心过程中沉淀会漂浮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将染色质重悬于5 mL 缓冲液F中，并用微球菌核酸酶（MNase）处理沉淀（室温下3 U/mL，10分钟）。 
	注意：可使用Dounce匀浆器混匀以辅助反应。</li>
	<li>孵育后，取40 μL混合物用于分析核小体DNA片段。将该等分试样与40 μL酚/氯仿和20 μL 6× DNA上样缓冲液混合，涡旋振荡，在18,000 × g下离心2分钟，然后将DNA上样至2%琼脂糖凝胶。
	<ol>
		<li>当DNA主要为对应于单核小体的147 bp片段时，加入EDTA至终浓度5 mM以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4°C下以21,000 × g离心20分钟后，将可溶性染色质组分与抗Flag树脂在4°C下孵育过夜。用6倍体积的缓冲液G（50 mM Tris-HCl pH 7.3，5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% NP-40，1 mM PMSF，1 mM DTT，1/100蛋白酶抑制剂混合物）洗涤树脂珠。</li>
	<li>将珠子连同5 mL 缓冲液G转移至空的层析柱中。使用200 μg/mL Flag洗脱肽洗脱珠子结合的核小体。洗脱缓冲液由含200 μg/mL Flag洗脱肽（见材料表）和1/5（体积比）1 M Tris（pH 8.0）的缓冲液G组成。用260 μL Flag洗脱缓冲液分3次洗脱核小体（每次洗脱2小时）。</li>
	<li>取3次洗脱液的等分试样进行酚-氯仿抽提，将DNA上样至2%琼脂糖凝胶进行检测。取每次洗脱组分各10 µL，加入10 µL 2× Laemmli上样缓冲液，用于SDS-PAGE和考马斯亮蓝分析，并进行各洗脱组分的泛素化H2A的Western印迹检测。将洗脱液在-80 °C下保存。通常，从人源细胞中纯化的蛋白量少于细菌表达系统，浓度范围为0.1至0.5 μg/μL。</li>
</ol>
4. 使用 BMI1/RING1B E3 泛素连接酶复合物进行核小体泛素化检测
<ol>
	<li>将核小体通过10K孔径的0.5 mL离心过滤器离心，以将底物从洗脱缓冲液置换为反应缓冲液缓冲液H（25 mM Tris，pH 7.5；10 mM MgCl2 和 5 mM ATP）。或者，也可使用商业来源的核小体进行该检测。 
	注意：将底物悬浮液更换为反应缓冲液可确保实验重复性，并防止Flag洗脱混合物中的成分对E3连接酶产生潜在抑制作用。</li>
	<li>在40 μL总体积的缓冲液H中加入1 μg核小体，再加入泛素激活酶（UBE1）（250 ng）、泛素（Ub）（50 ng/μL）和E2泛素结合酶（672 ng），以及1 μg BMI1/RING1B E3泛素连接酶复合物。在37 °C孵育反应体系3小时，期间偶尔振荡。 
	注意：可同时设置多个对照反应，包括省略E1、E2、E3、ATP或泛素。这有助于验证泛素化反应的特异性。</li>
	<li>加入40 μL 2× Laemmli上样缓冲液终止反应，随后按照标准操作流程通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析组蛋白H2A K119位点的泛素化水平。可使用抗H2A抗体或抗H2A K119ub抗体（见材料表）。</li>
</ol>
5. 使用 BAP1/DEUBAD 的体外核小体 H2A 去泛素化酶活性检测
<ol>
	<li>使用纯化的核小体进行后续实验&#160;体外去泛素化实验。将100–500 ng核小体重悬于40 μL中 缓冲液 I （50 mM Tris-HCl，pH 7.3，1 mM MgCl₂）2，50 mM NaCl 和 1 mM DTT）。加入 1 μg 细菌纯化的 His-BAP1 和 MBP-DEUBAD。在 37 °C 下孵育 3 小时，偶尔振荡，进行去泛素化反应。</li>
	<li>通过加入40 μL 2x Laemmli缓冲液终止体外反应，并通过免疫印迹进行分析。</li>
</ol>

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<li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li>
<li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li>
<li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%3A+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li>
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<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385(2018).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAP1%2FASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li>
<li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li>
<li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li>
<li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li>
<li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%2FASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292(2016).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

建立针对目标蛋白的稳定体外泛素化和去泛素化检测方法具有多项优势。这些检测方法可用于：（i）确立反应的最佳条件并定义其最低需求；（ii）测定酶促反应动力学参数和生物化学常数；（iii）明确影响这些反应的辅因子或抑制剂的作用；（iv）界定相互作用界面；（v）评估人工引入或疾病相关突变的影响；以及（vi）建立可用于进一步开发高通量化学筛选检测的实验条件。本文以核小体底物上BMI1/RING1B介导的H2A泛素化以及BAP1/ASXL介导的H2A去泛素化为例，详细说明这些检测方法的操作过程。
使用最少的组分即可在体外重现组蛋白H2A的泛素化，几乎可以观察到BMI1-RING1B复合物介导的H2A完全泛素化。需要注意的是，该反应是在重组核小体上进行的。重组核小体的优势在于不受哺乳动物细胞中其他组蛋白翻译后修饰的干扰。尽管如此，该泛素化反应也可在天然核小体上高效进行。如果泛素化反应较弱，可提高酶与底物的比例以获得最佳的泛素连接效果。需要注意的是，如果后续需进行去泛素化反应或相互作用检测，则可直接在磁珠结合的底物上进行泛素化反应。通过免疫沉淀回收泛素化的底物，并弃去含有泛素化反应组分的上清液。然...

泛素化是最保守的翻译后修饰之一，对包括酵母、植物和脊椎动物在内的多种生物体至关重要。泛素化是指将一种高度保守的76个氨基酸多肽——泛素，共价连接到靶蛋白上，该过程由三种酶依次催化完成，即E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶1,2,3。这种翻译后修饰在广泛的生物学过程中发挥核心作用。事实上，提供反应特异性的E3连接酶构成了一大类酶的超家族，是泛素系统中最丰富的酶类4,5,6。蛋白质泛素化的下游效应取决于修饰的性质：单泛素化、多单泛素化，以及线性或分支的多聚泛素化。单泛素化通常不与蛋白酶体降解相关，而是参与调控多种信号转导事件。多聚泛素化涉及泛素分子自身的N端或赖氨酸残基，而多聚泛素化蛋白的命运取决于泛素链延伸所使用的残基。已知由泛素K48位点介导的多聚泛素化可诱导蛋白酶体降解；相反，通过泛素K63位点进行的多聚泛素化则常与蛋白质活化相关7,8,9。与其他重要的翻译后修饰类似，泛素化是可逆的，泛素从蛋白质上的移除由一类称为去泛素化酶（DUBs）的特异性蛋白酶完成，这些酶已被证实是细胞过程的重要调控因子2,10。重要的是，许多DUBs具有高度特异性，通过去泛素化作用调控特定底物，表明泛素化与去泛素化之间的精细平衡对蛋白质功能至关重要。E3连接酶和DUBs，连同蛋白酶体降解机制及相关辅助因子，共同构成了泛素-蛋白酶体系统（UPS，包含&#62;1200个基因），该系统调控多个主要信号通路，其中许多通路与细胞生长和增殖、细胞命运决定、分化、细胞迁移以及细胞死亡相关。重要的是，涉及泛素化的多个信号级联反应的失调会促进肿瘤发生及神经退行性疾病5,11,12,13,14。
泛素化在染色质生物学及依赖DNA的过程当中发挥着广泛作用15,16,17。例如，组蛋白H2A在赖氨酸119位点的单泛素化（下文简称H2A K119ub）是一种关键的翻译后修饰，参与转录抑制和DNA修复过程18,19,20,21,22。H2A K119ub由多梳抑制复合物1（Polycomb Repressive Complex 1, PRC1）催化生成，该复合物在维持表观遗传信息方面发挥关键作用，并且从果蝇到人类高度保守。经典的PRC1主要由RING1B和BMI1组成，二者构成核心E3泛素连接酶复合物，负责上述泛素化事件22,23。在Drosophila中，H2A单泛素化（H2A K118ub，对应于哺乳动物中的H2A K119ub）可被去泛素化酶Calypso逆转，Calypso与Additional Sex Comb（ASX）相互作用，形成多梳抑制性去泛素化酶复合物（Polycomb-repressive DUB, PR-DUB）24。calypso的哺乳动物同源基因BAP1是一种肿瘤抑制基因，在多种人类恶性肿瘤中常发生缺失或失活25,26,27,28,29,30,31,32,33。BAP1调控细胞核内依赖DNA的多种生物学过程，同时也参与内质网介导的钙信号通路相关的细胞凋亡33,34,35,36,37,38,39,40,41,42。BAP1可组装成包含多个亚基的蛋白质复合物，其中包含多个转录调控因子，特别是ASXL1、ASXL2和ASXL3（统称为ASXLs），这三者是ASX的同源蛋白38,43。ASXLs通过其去泛素化酶适配域（DEUBiquitinase ADaptor domain，简称DEUBAD域），也称为ASXM域，来增强BAP1的去泛素化酶（DUB）活性35,36,44。因此，ASXLs在协调BAP1在染色质上的去泛素化酶活性及其更广泛的肿瘤抑制功能中发挥重要作用。
研究泛素化与去泛素化过程存在多种方法。其中，利用从细菌中纯化的蛋白质进行生化实验，仍是验证特定底物是否发生直接泛素化或泛素被移除的强有力手段。此类实验可用于探究多种参数，例如确定最小复合物的必要性、反应动力学分析、定义结构与功能关系，以及理解致病性基因突变的影响。本文提供了使用纯化组分在染色质底物上进行泛素化与去泛素化反应的实验方案。以模式系统为例， 体外 展示了核小体H2A蛋白的泛素化与去泛素化。分别使用经细菌纯化并组装成最小复合物的RING1B/BMI1和BAP1/DEUBAD蛋白，对核小体H2A进行泛素化或去泛素化。

<table><tbody><tr><td>直链淀粉琼脂糖珠</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 10K 离心滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>抗-H2AK119ub（H2Aub）抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8240</td><td></td></tr><tr><td>抗-Flag 琼脂糖珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A4596</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL 菌株</td><td>Agilent technologies</td><td>#230240</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>空层析柱</td><td>Biorad</td><td>#731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Flag 肽段</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F3290</td><td></td></tr><tr><td>GSH 琼脂糖珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G4510</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>#CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I5513</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶（MNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N3755</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖珠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#88221</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基马来酰亚胺（NEM）</td><td>Bioshop</td><td>#ETM222</td><td></td></tr><tr><td>孔径 0.45 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Sarstedt</td><td>#83.1826</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences Inc</td><td>#23966-1</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) 质粒</td><td>Addgene</td><td>#63139</td><td></td></tr><tr><td>泛素激活酶（UBE1）</td><td>Boston Biochem</td><td>#E-305</td><td></td></tr><tr><td>UBCH5C（UBE2D3）</td><td>Boston Biochem</td><td>#E2-627</td><td></td></tr></tbody></table>

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

泛素化是一种翻译后修饰，在多种信号通路中发挥重要作用，尤其参与染色质功能和DNA相关过程的调控。该修饰过程涉及一系列酶的级联反应，包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶，并由去泛素化酶（DUBs）催化其逆向反应。泛素化可导致蛋白质降解或功能改变，包括调节酶活性、蛋白质-蛋白质相互作用以及亚细胞定位。证明蛋白质发生泛素化或去泛素化的关键步骤是使用纯化的组分进行体外反应。有效的泛素化和去泛素化反应可能受到所用组分、酶辅因子、缓冲体系以及底物性质的显著影响。&#160; 本文提供了进行泛素化和去泛素化反应的逐步操作方案。我们以小鼠多梳抑制复合物1（PRC1）的最小组分BMI1和RING1B为例，其中RING1B是一种E3泛素连接酶，可在组蛋白H2A的第119位赖氨酸上催化单泛素化。核小体上H2A的去泛素化反应则采用由人源去泛素化酶BAP1及其辅助因子ASXL2的DEUBiquitinase ADaptor（DEUBAD）结构域组成的最小多梳抑制去泛素化酶复合物（PR-DUB）来完成。这些泛素化/去泛素化检测可在两种体系中进行：一种是利用细菌表达纯化的蛋白重构的重组核小体，另一种是从小鼠哺乳动物细胞中纯化的天然核小体。我们强调了可能对这些反应产生重大影响的技术细节，并指出这些方案中的通用原则可快速适用于其他E3泛素连接酶和去泛素化酶的研究。

GST-BMI1 和 RING1B 蛋白在细菌中表达良好，可轻松从可溶性组分中提取。 图1A 展示了 GST-BMI1-RING1B 复合物典型纯化过程的考马斯亮蓝染色结果。GST-BMI1 和 RING1B 条带的迁移分子量分别为约 45 kDa 和约 13 kDa，符合预期。值得注意的是，该 E3 泛素连接酶复合物具有高度均一性，细菌蛋白污染物和/或降解产物含量极低。此外，纯化所得复合物的化学计量比理想，当摩尔比为 1:1 时，GST-RING1B 蛋白的条带强度预计为 BMI1 的两到三倍。类似地，His-BAP1/MBP-DEUBAD 复合物的纯化也获得了相对高度均一的产物，其条带分别位于约 90 kDa 和约 55 kDa（图1B）。通过镍-琼脂糖和直链淀粉-琼脂糖分别对 BAP1 和 DEUBAD 进行串联亲和纯化，可确保复合物具有适当的化学计量比，并去除纯化复合物中游离的 BAP1。另一方面，纯化的核小体组分主要由 147 bp 条带组成，...

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。

泛素化是一种翻译后修饰，在多种信号通路中发挥重要作用，并显著参与调控……

鉴于细胞内泛素化和去泛素化反应的复杂性，建立含有明确纯化组分的体外检测体系非常重要。这有助于理解泛素化和去泛素化的机制，也有助于确定编码这些反应相关酶的基因突变如何导致人类疾病。我们可以鉴定出这些组分中驱动这些反应的结构域和基序。我们还可以开发高通量筛选检测方法，用于筛选可作为潜在治疗药物的小分子抑制剂。开始细菌裂解时，将PMSF和抗蛋白酶混合物加入预冷的裂解缓冲液A中。取25毫升裂解缓冲液A加入含有细菌沉淀的瓶子中，重悬沉淀。将含有细菌裂解物的液体转移至离心管中进行超声处理。使用探头超声仪以70%的输出振幅对裂解液进行超声处理，每次30秒，重复四到五次。然后在4°C条件下以21,000 ×g离心20分钟。根据文章所述，将细菌裂解液与GSH珠子孵育5小时后，将珠子连同10毫升缓冲液转移至空的层析柱中。然后，向柱中加入含有 25 毫摩尔谷胱甘肽的 1.5 毫升缓冲液 A，通过重力作用将洗脱液收集到 1.5 毫升微量离心管中。用新鲜的缓冲液 A 重复洗脱步骤四次，并根据论文所述继续处理洗脱组分。首先，将 His-BAP1 和 MBP-DEUBAD 细菌沉淀物重悬于 25 毫升预冷的裂解缓冲液 B 中。混合每种裂解液各 25 毫升，在冰上孵育 15 分钟。超声处理裂解液，然后在21,000 × g离心20分钟。裂解液离心后，经0.45 µm孔径的注射器滤器过滤至瓶中，并与镍-NTA珠混合。在4 °C条件下振荡孵育5小时。随后，在 25,000 × g 条件下离心 3 分钟，使磁珠沉淀。用移液器将上清液转移至 50 毫升离心管中，作为穿流液保留。用含有 20 毫摩尔/升咪唑的缓冲液 B 洗涤磁珠 6 次，每次加入 5 毫升缓冲液，离心 3 分钟。最后一次洗涤后，将珠子与10毫升缓冲液B一起转移至空的层析柱中，并加入1毫升含有200毫摩尔咪唑的缓冲液B。利用重力将洗脱液收集到含有DTT和EDTA的1.5毫升微量离心管中。重复洗脱步骤四次，将目标洗脱组分合并至一个15毫升离心管中。加入缓冲液 C 将洗脱的复合物稀释三倍。然后将稀释后的洗脱液转移至含有预处理的淀粉微珠的离心管中，4 摄氏度下振荡孵育过夜。次日早晨，将离心管在 2,500 × g 离心 3 分钟，将上清液收集至 15 毫升离心管中作为穿流液保留。用5毫升缓冲液C洗涤与蛋白结合的珠子，重复五到六次。然后向结合有纯化后的His-BAP1/MBP-DEUBAD复合物的淀粉糖珠（amylose agarose beads）中加入500微升缓冲液D，制成50%的珠子溶液。取20微升该50%珠子溶液转移至微量离心管中，加入20微升两倍浓度的Laemmli上样缓冲液，用于SDS-PAGE及考马斯亮蓝分析。将剩余的磁珠溶液于-80摄氏度保存，以备后续使用。在转染前一天，将1200万个HEK293T细胞接种于20毫升完全培养基中，置于15厘米的培养皿内进行培养。24小时后，在细胞培养操作台内吸除培养基，并加入12毫升无血清培养基。使用63微升浓度为1毫克/毫升的PEI，将21微克pCDNA flat-H2A转染入细胞中。转染12小时后，更换为完全培养基。根据论文所述收获细胞后，用约10倍体积含有NEM的缓冲液E重悬细胞沉淀，以抑制去泛素化酶活性，并在冰上孵育20分钟。在3,000 × g离心5分钟后，弃去上清液。先用10倍体积的缓冲液E将染色质沉淀洗涤两次，再用缓冲液F洗涤两次。将染色质重悬于5 mL缓冲液F中，并在室温下以每毫升3个单位的浓度加入微球菌核酸酶处理10分钟。孵育后，取40 µL该混合物转移至1.5 mL离心管中，用于分析核小体DNA片段。加入 40 微升酚-氯仿和 20 微升六倍 DNA 上样缓冲液。涡旋混匀后在 18,000 ×g 离心 2 分钟。然后将 15 微升水相转移至 2% 琼脂糖凝胶中以加载 DNA。根据文稿要求停止反应并进行离心后，将可溶性染色质组分与抗flag树脂珠在15毫升离心管中于4摄氏度轻轻振荡孵育过夜。用缓冲液G洗涤珠子六次。将珠子用5毫升缓冲液G转移至空的层析柱中。用含有200微克/毫升flag洗脱肽和1至5摩尔/升Tris（pH 8）的260微升缓冲液G稀释珠子结合的核小体。在冷室中分三次洗脱核小体，每次一小时。进行泛素化实验时，首先将1微克纯化的核小体加入40微升H缓冲液中。随后，向管中加入酶反应混合液，其中包含250纳克UBE1、672纳克UB以及E2泛素结合酶，以及1微克BMI1-RING1B E3泛素连接酶复合物。在37摄氏度孵育反应体系3小时，期间偶尔振荡。加入40微升2倍Laemmli上样缓冲液以终止反应，并通过蛋白质印迹分析组蛋白H2AK119的泛素化水平。为进行体外去泛素化实验，将纯化的核小体重悬于40微升缓冲液I中，并加入1微克经细菌纯化的His-BAP1/MBP-DEUBAD珠粒。将离心管置于37摄氏度孵育器中孵育3小时，期间偶尔振荡，以完成去泛素化反应。然后加入40微升2倍浓度的Laemmli缓冲液终止反应，并通过免疫印迹进行分析。本实验中，使用GST亲和 beads 对GST-BM1-RING1B复合物进行典型纯化后的考马斯亮蓝染色结果显示，两条条带的迁移位置分别对应预期的分子量，约为45千道尔顿和13千道尔顿。类似地，His-BAP1与MBP-DEUBAD复合物的纯化也获得了相对高度均一的样品，其条带分子量分别约为90千道尔顿和55千道尔顿。另一方面，纯化的核小体组分主要由一条147个碱基对的条带组成，表明其中富含单核小体组分。纯化核小体的考马斯亮蓝染色显示了四种组蛋白亚基的典型条带模式，且各亚基含量符合化学计量比。组蛋白H2A在BMI1-RING1B复合物作用下的泛素化修饰呈现出时间依赖性的泛素化蛋白形式增加，同时未修饰形式的蛋白水平相应降低。泛素化反应完全，几乎所有的H2A蛋白均被转化为H2A K119ub。另一方面，在天然核小体上进行了去泛素化实验。将这些核小体与BAP1-DEUBAD共孵育后，观察到H2A K119ub信号随时间依赖性减少。泛素化与去泛素化反应的成功与否取决于蛋白质的纯化方式。我们需要获得较高的产量，且用于蛋白质重悬和纯化的缓冲液必须与生化反应相容。当这些泛素化与去泛素化检测方法建立完善后，便可用于测试激活剂和抑制剂的作用，以及与疾病相关的基因突变所产生的影响。该方法由多个实验室共同建立，对于理解泛素化和去泛素化的机制具有重要价值。多种化学试剂具有危险性，需在通风橱中操作，包括苯酚-氯仿、酸、碱和还原剂。

in-vitro-ubiquitination-deubiquitination-assays-nucleosomal

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

核糖体组蛋白的体外泛化和二次基质测定

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。...

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。...

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。...

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

本方案描述了一系列方法，包括采用分析型尺寸排阻色谱研究组蛋白伴侣的寡聚化状态与稳定性，通过下拉实验解析组蛋白伴侣与组蛋白之间的相互作用，利用分析超速离心分析蛋白复合物的化学计量比，以及开展组蛋白分子伴侣功能检测以对潜在的组蛋白伴侣进行功能性表征 体外.

体外利用分析、下拉及分子伴侣实验对组蛋白伴侣蛋白的表征

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。...

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

本方案描述了一种利用哺乳动物细胞裂解液或纯化的泛素酶复合物对Streptococcus...

体外 重建细菌泛素化及VCP/p97介导的清除过程

学习体外泛素化和去泛素化实验方法，利用纯化组分研究组蛋白H2A修饰机制。该技术可鉴定关键酶结构域，筛选小分子抑制剂，为疾病治疗研究提供重要工具。

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

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