Name: 单分子跟踪显微镜 - 确定细胞分子扩散状态的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: 了解三维单分子追踪显微镜技术，用于解析活细菌细胞中荧光标记蛋白的亚细胞定位和运动行为。该方法为研究蛋白质相互作用和扩散状态提供了重要工具。

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感谢Alecia Achimovich和Ting Yan对本文手稿的审阅。感谢弗吉尼亚大学高级研究计算服务组的高级科研人员Ed Hall，他在本研究使用的优化程序设置方面提供了帮助。本研究的资金由弗吉尼亚大学提供。

作者无任何利益冲突需要披露。

成功应用本方案的一个关键因素是确保单分子信号在空间和时间上彼此充分分离（即信号在空间和时间上需足够稀疏）（补充视频 1）。如果同一时间细胞内存在多个发光分子，则定位结果可能被错误地关联到另一个分子的轨迹上，这一问题被称为“连接问题”30。可通过选择适当的实验条件（如蛋白表达水平和激发激光强度）来避免连接问题。然而，应注意使蛋白表达水平接近野生型，以确保结果具有代表性。本研究中，我们采用在天然启动子控制下的等位基因替换策略，而非化学诱导表达，以保证标记蛋白的天然表达水平。因此，可通过调节激发激光强度（用于 eYFP 闪烁）或激活激光强度（用于光激活荧光探针）来控制活性发光分子在时间上的浓度。另外，当使用化学染料标记并结合 HALO 和 SNAP 标签时31,32，可通过降低染料浓度，直至荧光信号足够稀疏，从而实现单分子追踪33。本方案进一步通过排除同一细胞内同时出现两个或以上定位事件的轨迹，来消...

研究生物分子的扩散行为有助于揭示其生物学功能。基于荧光显微镜的技术已成为在细胞原生环境中观察生物分子的有力工具。光漂白后荧光恢复（FRAP）和荧光相关光谱（FCS）1可提供系综平均的扩散行为信息。相比之下，单分子定位显微镜能够以高空间和时间分辨率观测单个荧光标记的分子2,3,4。观测单个分子具有优势，因为目标蛋白可能处于不同的扩散状态。例如，当大肠杆菌（Escherichia coli）中的转录调节因子CueR在细胞质中自由扩散，或结合到DNA序列上并在测量时间尺度上被固定时，会呈现出两种易于区分的扩散状态5。单分子追踪技术可直接观测这些不同状态，且无需复杂的分析即可分辨它们。然而，当不同扩散状态之间的扩散速率较为接近时，分辨多个扩散状态及其群体比例将变得更加困难。例如，由于扩散系数对分子尺寸的依赖性，蛋白质的不同寡聚化状态会表现为不同的扩散状态6,7,8,9,10。此类情况需要在数据采集、处理与分析方面采用整合性的方法。
影响细胞质分子扩散速率的一个关键因素是细胞边界对扩散的限制作用。细菌细胞边界对分子运动的限制会导致测得的细胞质分子扩散速率比在无限制空间中发生相同运动时显得更慢。对于扩散非常缓慢的分子，由于与边界的碰撞极少，细胞限制效应可忽略不计。在这种情况下，可能通过使用基于布朗运动（随机扩散）方程的分析模型拟合分子位移分布 r 或表观扩散系数 D*，从而准确解析出扩散状态11,12,13。然而，对于快速扩散的细胞质分子，由于扩散分子会频繁碰撞细胞边界，实验测得的分布不再符合无限制布朗运动所得到的分布。因此，必须考虑限制效应，才能准确确定荧光标记分子的无限制扩散系数。近年来已发展出多种方法，用于在分析或半分析层面上5,14,15,16，或通过布朗扩散的蒙特卡洛数值模拟6,10,16,17,18,19来校正限制效应。
本文提供了一种整合的实验方案，用于采集和分析单分子定位显微镜数据，特别侧重于单分子追踪。本方案的最终目标是解析在此情况下呈杆状的细菌细胞内荧光标记的胞质蛋白的扩散状态。我们的工作基于先前的一项单分子追踪方案，在该方案中，通过扩散分析证明DNA聚合酶PolI存在DNA结合态与非结合态20。本文中，我们将单分子追踪分析扩展至三维测量，并开展更贴近实际的计算模拟，以同时解析并量化细胞内共存的多种扩散状态。数据采集使用自行搭建的三维超分辨率荧光显微镜完成，该系统通过双螺旋点扩散函数（DHPSF）成像实现对荧光发射体三维位置的测定21,22。原始单分子图像通过自主编写的软件处理，提取出单分子的三维定位信息，并进一步整合为单分子轨迹。数千条轨迹被合并以生成表观扩散系数的分布图。最后一步，将实验获得的分布与通过蒙特卡洛模拟在受限体积内布朗运动所生成的数值分布进行拟合。我们将该方案应用于解析活体Yersinia enterocolitica中III型分泌系统蛋白YscQ的扩散状态。由于本方案具有模块化特性，因此可广泛适用于任意细胞几何形态下的各类单分子或单颗粒追踪实验。

<table><tbody><tr><td>2,6-二氨基庚二酸</td><td>Chem Impex International</td><td>5411</td><td>用于培养&lt;em&gt;Y. enterocolitica&lt;/em&gt;细胞所必需。</td></tr><tr><td>4f透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-080-A</td><td>f = 80mm，2&quot;</td></tr><tr><td>514 nm激光器</td><td>Coherent</td><td>Genesis MX514 MTM</td><td>用于荧光激发</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Inivtrogen</td><td>16520100</td><td>用于制备凝胶垫，以在显微镜上固定液态细菌样品。</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET510/bp</td><td>激发光路。</td></tr><tr><td>脑心浸液培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53286</td><td>&lt;em&gt;Y. enterocolitica&lt;/em&gt;的生长培养基。</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>相机</td><td>Imaging Source</td><td>DMK 23UP031</td><td>用于相差成像的相机。</td></tr><tr><td>介电相位掩模</td><td>Double Helix, LLC</td><td>N/A</td><td>用于产生DHPSF信号。</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795410</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>螯合Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，可诱导III型分泌系统（T3SS）的分泌。</td></tr><tr><td>翻转镜</td><td>Newport</td><td>8892-K</td><td>用于在荧光与相差成像光路之间切换。</td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F8792</td><td>荧光微珠，激发/发射波长为540/560 nm，直径40 nm。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>#1.5，22 mm × 22 mm</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Chem Impex International</td><td>811</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Olympus</td><td>Z-81025</td><td>滴加在物镜上使用。</td></tr><tr><td>硫酸亚铁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0518</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Semrock</td><td>LP02-514RU-25</td><td>发射光路。</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25414A</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>显微镜平台</td><td>Mad City Labs</td><td>custom</td><td>倒置显微镜用平台。</td></tr><tr><td>萘啶酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4382</td><td>所使用的&lt;em&gt;Y. enterocolitica&lt;/em&gt;细胞对萘啶酸具有抗性。</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>1-U2B991</td><td>60X，1.4 NA</td></tr><tr><td>臭氧清洗仪</td><td>Novascan</td><td>PSD-UV4</td><td>用于消除玻璃盖玻片上的背景荧光。</td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795488</td><td>M2G组分。</td></tr><tr><td>红色LED</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>用于相差成像的样品照明，波长625 nm。</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-Flash 4.0 V2</td><td>用于荧光成像的相机。</td></tr><tr><td>短通滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET700SP-2P8</td><td>发射光路。</td></tr><tr><td>管镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-180-A</td><td>f=180 mm，2&quot;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Yersinia enterocolitica&lt;/em&gt; dHOPEMTasd</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>菌株AD4442，eYFP-YscQ</td></tr><tr><td>零级四分之一波片</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-514</td><td>激发光路。</td></tr></tbody></table>

单分子追踪显微技术——用于确定细胞质分子扩散状态的工具

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

单分子定位显微镜能够在生理相关环境中，以数十纳米的空间分辨率和毫秒级的时间分辨率探测活细胞中单个分子的位置与运动。这些特性使单分子定位显微镜非常适合研究分子水平的生物学功能。本文展示了一套整合的实验方案，用于获取、处理与分析单分子追踪数据，以提取目标蛋白可能表现出的不同扩散状态。该信息可用于量化活细胞中分子复合物的形成。我们详细描述了一种基于相机的三维单分子定位实验方法，以及后续生成单个分子运动轨迹的数据处理步骤。随后，利用数值分析框架对这些轨迹进行分析，以提取荧光标记分子的主要扩散状态及其相对丰度。该分析框架基于在任意细胞几何形状空间限制下的细胞内布朗扩散轨迹的随机模拟。根据模拟生成的轨迹，以与实验图像相同的方式生成并分析原始单分子图像。通过这种方式，将实验中难以校准的精度与准确度限制显式地纳入分析流程中。通过使用模拟分布的线性组合对实验值的分布进行拟合，确定主要扩散状态的扩散系数及其相对群体比例。我们通过解析一种蛋白在细菌病原体细胞质中形成同源和异源寡聚复合物时表现出的不同扩散状态，展示了本方案的有效性。

在本文所述实验条件（20,000帧，轨迹长度至少包含4个定位点）下，根据荧光标记融合蛋白的表达水平，每个细胞可产生约200–3,000个定位点，形成10–150条轨迹图 2a，b). 要生成充分采样的表观扩散系数分布，需要大量的轨迹数据。此处采集的视场（FOV）大小约为 55 x 55 &#181;m，每次实验采集10个视野（FOV）。因此，为了获得 &#62;每次实验的5,000条轨迹中，每个视野应至少包含50个细胞。理想情况下，细胞群体应尽可能密集，但细胞之间不得相互接触。若细胞密度过高，则会出现细胞相互接触或重叠的情况，从而难以使用OUFTI成功进行分割。28），如所述 数据后处理分割效果不佳可能导致细胞间的定位和轨迹分配错误。
本文展示了对Y. enterocolitica</e...

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。

单分子定位显微镜以数十纳米的空间分辨率和……探测活细胞中单个分子的位置与运动

3D单分子示踪技术可确定单个蛋白质的亚细胞定位及其运动行为。在活细胞中观察蛋白质的运动，能够提供其在天然环境中与结合伴侣相互作用的重要信息。本文介绍的方法为分析单分子示踪数据提供了一个通用框架，以解析生物分子的扩散状态。该方法可应用于限制在任意形状细胞体积内的二维和三维轨迹。按照随附的文字实验方案，将荧光微珠置于预先制备好的琼脂糖垫上后，将其放置在显微镜盖玻片上，并将盖玻片固定到显微镜样品架上。随后将样品架安装到倒置荧光显微镜上。然后启动显微镜的图形用户界面；此处使用基于 MATLAB 编写的自定义软件进行仪器控制。启动相机软件 HCImage Live。在“相机控制”部分的“采集”选项卡中，将曝光时间设置为 0.03 秒，然后点击“实时”以开始相机的实时成像。点击图形用户界面中相应的“打开激光”按钮，以解除激光锁定并激发琼脂糖垫上的荧光微珠。使用实时成像模式在相机上观察荧光发射信号。通过点击用户界面中“微定位载物台”部分的 XY 位置箭头，调节显微镜载物台的 X 和 Y 位置，使至少一个荧光微珠位于视野中心。如有必要，可通过点击箭头下方的下拉框来调整步长。接下来，在纳米定位台部分，点击 Z 位置箭头，调节显微镜载物台的 Z 轴位置。将荧光微球的双螺旋点扩散函数的取向设置为垂直方向。此垂直方向被定义为Z轴校准的起始点。以起始Z位置为中心，上下各扫描30步，步长为50纳米。在每一步采集10帧图像，曝光时间为0.03秒。要启动自动数据采集，请点击 Z 校准下方的“运行”。将一毫升热激的耶尔森氏肠炎杆菌培养物在室温下以 5,000 ×g 离心三分钟，然后移除培养物并弃去上清液。用一毫升 M2G 培养基将菌体沉淀清洗三次。最后一次洗涤后，将沉淀的细菌重悬于 250 微升 M2G 培养基中。随后加入荧光微珠作为定位标记。荧光微珠溶液的添加量应控制在显微镜观察时每个视野中仅有 1 至 2 个微珠为宜。通过涡旋轻轻混悬，以分离任何聚集的细胞，并将1.5 µL悬液接种至由M2G制备的1.5%至2%琼脂糖垫上，然后将琼脂糖垫倒置并放置于经臭氧清洁的显微镜盖玻片上。在显微镜物镜上滴加一滴浸油，将样品支架置于显微镜载物台上并固定。启动图形用户界面以控制显微镜的相机、样品载物台和激发激光器，然后初始化相机软件。在相机控制部分的“捕获”选项卡中，将曝光时间设置为 0.025 秒，然后单击“实时”以开始相机的实时成像。通过点击微定位载物台部分下的 XY 位置箭头，调节显微镜载物台的 X 和 Y 位置，以扫描样品并找到细菌细胞密度适中的视野。为了最大化数据通量，盖玻片上的细胞密度应尽可能高，但需确保细胞之间不发生重叠或接触。视野中还应至少包含一个荧光微珠，作为基准标记，以便在数据采集过程中测量载物台的位移。接下来，在“纳米定位载物台”部分，点击Z位置箭头，调节显微镜载物台的Z位置，使荧光微珠的双螺旋点扩散函数叶瓣呈垂直状态。然后进入“序列”并选择“扫描设置”。将帧数更改为 20,000。接下来，通过点击标有三个点的按钮选择保存目标文件夹。最后，点击“开始”以 0.025 秒的短曝光时间采集最多 20,000 帧相机图像。完成后，单击图形用户界面上相应的“关闭激光”按钮，以阻断激光照射。然后使用相同的曝光时间采集200帧暗场图像。勾选Thorlabs LED旁边的复选框，然后单击“Toggle Mirror Up”（切换镜片向上）。这将开启样品上方的LED光源，并将显微镜从荧光光路切换至相差光路。启动数据采集软件的相差成像通道，点击“开始/停止实时显示”按钮以查看相机的实时图像。然后点击“采集并保存”以获取当前视野下细胞的相差图像。调整荧光微珠的位置，将其作为定位标记物使用。根据文本方案中所述的模板阈值，查找并拟合所有定位点及所有相机帧。在 Easy-DHPSF 图形用户界面的“Localize DHPSF SM”部分，点击“Run”以拟合单分子信号，然后在随后弹出的窗口中点击“OK”，保留默认设置。软件将查找符合双螺旋点扩散函数特征的单分子荧光信号，并尝试使用双高斯模型对其进行拟合。在脚本运行过程中，用户将看到原始图像数据的显示，以及成功拟合的单分子信号的重建图像。使用在 MATLAB 中编写的自定义软件，首先在弹出窗口中通过大致估计并分别在单分子定位数据和细胞轮廓中点击同一五个细胞的细胞极点，手动选择五对控制点。删除包含少于 10 个定位点的细胞，并移除部分位于视场之外的细胞，然后在弹出窗口中通过点击细胞轮廓内部删除任何其他不需要的细胞。最后，将位于细胞轮廓边界内的定位点分配给该细胞，丢弃任何未位于细胞轮廓边界内的定位点。成功应用本方案的一个关键因素是确保单分子信号之间充分分离。如果同一细胞中同时存在多个荧光分子，则定位信息可能被错误地分配到另一个分子的轨迹上。本方案通过剔除同一细胞内同时出现两个或以上定位点的任何轨迹，来解决轨迹连接错误的问题。因此，当单分子信号过于密集时，大量此类数据会在处理过程中被自动舍弃。根据荧光标记融合蛋白的表达水平，每个细胞可产生约 200 至 3,000 个定位点。这些定位点可生成 10 至 150 条轨迹。需要大量轨迹才能获得采样充分的分布。此处显示的是约 80,000 条荧光蛋白 eYFP 标记的鼠疫耶尔森菌 III 型分泌蛋白 YscQ 单分子轨迹的表观扩散系数直方图。YscQ 会结合到嵌入膜中的注射装置（injectisome），导致一部分分子（约 24%）不发生扩散，如黑色分布所示。其余的 YscQ 分子则在细胞质中自由扩散。在本方法中，确定了游离的 YscQ 分子至少存在三种不同的扩散状态。该结论是通过将表观扩散系数的分布与已知扩散系数的模拟分布库进行拟合而得出的。在尝试分辨多种扩散状态时，应收集数千条单分子轨迹，以确保对表观扩散系数的分布进行充分采样。可以在野生型细胞或基因敲除突变体中进行单分子示踪，以确定特定的扩散状态是否仅在分子结合伴侣存在时才出现。通过利用三维单分子示踪技术解析细胞质蛋白及蛋白复合物的扩散状态，研究人员能够确定寡聚蛋白复合物在活细胞内的形成位置、时间及机制。使用高功率激光源和操作活体人类病原体可能具有极高的危险性。应始终遵循适当的激光安全和生物安全规程。

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