Name: 使用基于化学探针的免疫测定直接测量KDM1A目标参与 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学习使用化学探针免疫测定法直接测量KDM1A靶点结合，该方法可用于评估药物与靶蛋白的相互作用，适用于神经肿瘤等疾病的药效学研究，为临床前和临床研究提供可靠的药物动力学分析工具。

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本研究由 Oryzon Genomics S.A. 和 Hoffman-La Roche 资助，并得到 CIIP-20152001 及 RETOS 合作项目 RTC-2015-3332-1 的部分支持。

<ol><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li>
<li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1%3A+biologic+roles+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-1001%2C+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor%2C+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li>
<li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li>
<li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-Specific+Histone+Demethylase%2C+LSD1%2C+%28KDM1A%29+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601(2015).</li>
<li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22HemaSphere%22%5BJournal%5D)">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54(2018).</li>
<li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li>
<li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RN-1%2C+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor%2C+increases+%CE%B3-globin+expression%2C+F+reticulocytes%2C+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li>
<li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li>
<li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+LSD1%2FMAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).</li>
<li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li>
<li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li>
<li>Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).</li>
<li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).</li>
<li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li>
<li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li>
<li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+%28LSD1%29+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000(2017).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-2001%3A+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).</li>
</ol>

作者 Tamara Maes 是 Oryzon Genomics S.A. 的执行董事和股东，作者 Cristina Mascaró 和 Raquel Ruiz Rodriguez 是 Oryzon Genomics S.A. 的员工。Oryzon Genomics S.A. 正在开发 KDM1A 抑制剂，并拥有涵盖本文所用化合物和方法的专利。

本方案旨在利用一种新型的基于KDM1A化学探针捕获的ELISA方法，直接测量KDM1A的靶点结合情况。该方法已在培养的人源细胞系以及人、大鼠、小鼠和狒狒的离体样本（包括外周血单个核细胞、肺、脑、皮肤和肿瘤组织）中得到验证，也可便捷地应用于其他KDM1A抗体靶向表位及催化中心保守的物种。由于OG-881是一种基于活性的化学探针，因此样本质量至关重要，在实验流程的初始步骤中尤其需要规范操作和妥善保存样本，以确保KDM1A的酶活性得以维持。
本实验方案已优化，用于分析共价靶向FAD的抑制剂对KDM1A的靶点结合情况。该方案也可用于阻断KDM1A辅因子FAD结合位点的可逆性抑制剂。对于具有长停留时间的强效可逆性抑制剂，可直接采用未经修改的实验方案。
OG-881 化学探针可能不适用于具有高解离速率的低效价可逆性抑制剂。本研究中使用的特定化学探针不具备细胞膜穿透能力，因此分析需在体外对裂解样品进行。
该方法可在科研和分析实验室中广泛配备的仪器上运行；无需对细胞引入基因修饰，且可轻松...

赖氨酸特异性去甲基化酶1（KDM1A）1是一种参与基因转录调控的去甲基化酶。该蛋白已成为肿瘤学领域潜在的药物靶点2，包括急性髓系白血病3（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）4、骨髓纤维化（MF）5,6、小细胞肺癌（SCLC）7；在镰状细胞病（SCD）8,9以及中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病（AD）、多发性硬化症（MS））和攻击行为10中也具有研究价值。
目前处于临床研发阶段的大多数KDM1A抑制剂均为环丙胺类衍生物，通过与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子发生共价结合来抑制该蛋白活性11。KDM1A的抑制可引发基因表达的改变，但这些改变在不同组织、细胞类型或疾病状态下差异极大。KDM1A的抑制还可改变组蛋白修饰12，然而这些修饰通常仅在基因组的特定局部位点产生，且同样具有高度的组织和细胞特异性。
该方案旨在直接测定生物样品中KDM1A与靶点的结合情况，并已针对环丙胺类抑制剂的使用进行了优化。本检测基于ELISA技术，在固相检测体系中平行分析来自生物样品的天然蛋白提取物中的总KDM1A和游离KDM1A（即未与抑制剂结合的KDM1A）。第一步是在生物样品裂解过程中加入生物素标记的KDM1A特异性化学探针OG-88113,14，该探针源自选择性KDM1A抑制剂ORY-1001（iadademstat），后者是一种正处于临床开发阶段、用于治疗肿瘤性疾病的高效KDM1A抑制剂。该化学探针对KDM1A的IC50为120 nM，包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合基团，并连接有生物素化的聚乙二醇（PEG）尾部。该化学探针仅特异性结合样品中的游离KDM1A，而不结合已被抑制剂占据的KDM1A。在化学探针结合后，样品中含有KDM1A的复合物将被捕获至微孔板上：测定游离KDM1A时使用链霉亲和素包被的微孔板，测定总KDM1A时则使用包被了单克隆抗KDM1A捕获抗体的微孔板。洗涤后，两块板均与抗KDM1A检测抗体孵育，再次洗涤后，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗兔IgG二抗孵育，随后使用发光底物进行检测，并通过化学发光仪测量相对光单位（RLU）进行定量分析（图1）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg" /> 
图1. 用于检测KDM1A靶点结合的ELISA酶联化学探针免疫吸附测定示意图： A) 采用夹心ELISA法测定总KDM1A水平；B) 采用化学探针ELISA法测定游离KDM1A水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在两块ELISA板中均包含标准曲线，以验证每次检测的线性关系。每个样本中KDM1A靶点结合的测定结果均相对于给药前或载体处理样本计算为相对值。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 X 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td></td></tr><tr><td>96 孔深孔储存板</td><td>VWR</td><td>#734-1679</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 ELISA 板</td><td>Nunc</td><td>#436110</td><td></td></tr><tr><td>黑色粘性膜</td><td>Perkin Elmer</td><td>#6050173</td><td></td></tr><tr><td>透明粘性膜</td><td>VWR</td><td>#60941-062</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 KDM1A 探针 OG-881</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td># 3117057001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23208)</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 蛋白检测试剂盒</td><td>BioRad</td><td>#500-0001</td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液 10X</td><td>Cell Signaling</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>适用于 96 孔板的离心机</td><td>Hettich</td><td>Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>#156499</td><td></td></tr><tr><td>全长、酶活性人源重组 LSD1 / KDM1A</td><td>Active Motif</td><td>#31426</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5 项目</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>鲁米诺增强剂和过氧化物溶液（化学发光底物）</td><td>Thermo Scientific</td><td>#37074</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>无限 200-Tecan 微孔板读数仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆捕获抗体 Anti-KDM1A（N 端表位）</td><td>Abcam</td><td>#ab53269</td><td></td></tr><tr><td>18 号钝头针</td><td>BD</td><td>#303129</td><td></td></tr><tr><td>ORY-1001 (iadademstat)</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PBMC 分离管 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#163288</td><td></td></tr><tr><td>PBMC 分离管 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227288</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>板式振荡器</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Rotamax 120</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20</td><td>Sigma</td><td>#P7949</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆检测抗体 Anti-KDM1A（C 端表位）</td><td>Cell Signaling</td><td>#672184BF-100</td><td></td></tr><tr><td>二抗 辣根过氧化物酶标记驴抗兔 IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>#31458</td><td></td></tr><tr><td>比色皿光度计 1.5</td><td>Deltalab</td><td>#302100</td><td></td></tr><tr><td>比色皿用分光光度计</td><td>GE Healthcare</td><td>GeneQuant 1300</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Promega</td><td>#Z704A</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>#303172</td><td></td></tr><tr><td>1 型超纯水</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>VWR</td><td>USC200T</td><td></td></tr></tbody></table>

基于化学探针免疫测定法直接测量kdm1a靶点结合

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

靶点结合（即药物与其设计靶向的蛋白质之间的相互作用）的评估，是解释药物研发或基础研究项目中任何化合物生物学活性的基本要求。在表观遗传学领域，靶点结合通常通过分析替代标志物来评估，而非直接测量化合物与靶点的结合。已分析的下游生物学读数包括组蛋白修饰变化或基因表达改变。KDM1A 是一种赖氨酸去甲基化酶，可去除H3K4单甲基化和二甲基化上的甲基基团，该修饰与基因表达沉默相关。替代标志物的变化依赖于所研究细胞的细胞类型及其基因构成的功能，这使得结果解释和跨案例比较变得相当困难。为克服这些问题，本文提出了一种通用的实验方案，用于评估KDM1A直接靶点结合的剂量效应和动态变化。所述检测方法利用KDM1A化学探针捕获并定量未受抑制的酶，可广泛应用于细胞或组织样本，无需进行基因改造，具有优异的检测窗口，既可用于基础研究，也可用于临床样本分析。

总KDM1A和游离KDM1A检测的线性关系。
标准品系列按照步骤5.3.2所述方法制备，使用0至2500 pg的全长人源重组KDM1A酶。通过检测总rKDM1A和游离rKDM1A的RLU值以验证其线性关系（图2A 和 2B）。数据表示为3次独立实验、每次3个技术重复（n）的平均值±标准差（SD）。在3名独立志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到的总KDM1A和游离KDM1A的RLU值叠加于 图2C 和 2D 的标准曲线中。血液样本来自西班牙生物银行法规（Real Decreto de Biobancos 1716/2011）及当地伦理委员会批准的Instituto de Investigación Biomédica S...

本文介绍了一种用于检测经KDM1A抑制剂处理的人或动物细胞、组织及血液样本中KDM1A靶点结合情况的实验方案。该方案利用化学探针标记游离的KDM1A酶，并通过基于化学探针的免疫检测方法直接定量靶点占据率，可用于临床前及临床研究。

基于化学探针免疫测定法直接测量KDM1A靶点结合

靶向结合评估，即评估药物与其设计靶向蛋白之间相互作用，是……的基本要求。

靶点结合的评估，即药物与其设计靶向的蛋白质之间的相互作用，是解释药物研发或基础研究项目中任何化合物生物学活性的基本要求。该技术的主要优势在于，它能够直接测量KDM1A靶点结合的剂量效应和动态变化，而非检测组蛋白修饰或表达水平等下游效应。该技术可应用于基础研究，也可用于临床试验中，针对接受KDM1A抑制剂治疗的肿瘤性中枢神经系统疾病或其他相关疾病，开展药效动力学研究。该技术基于一种为研究 ORY-1001（iadademstat）而开发的化学探针，但也可用于其他 KDM1A 抑制剂，且该策略可推广至其他靶点。本实验操作将由我实验室 PK/PD 发现平台的运营经理 Raquel Ruiz 演示。在用 ORY-1001 处理细胞期间，该化合物会结合存在于细胞核中的 KDM1A 蛋白。开始此操作前，从冰箱中取出一支10微升、浓度为20毫摩尔的生物素化探针OG-881储备液，室温下静置10分钟使其升温。使用带滤芯吸头的微量移液器，将储备液进行系列稀释，配制浓度为2微摩尔的工作液。接着，在微量离心管中将一片蛋白酶抑制剂溶解于1毫升PBS溶液中。每配制1毫升含化学探针的1×细胞裂解缓冲液，需混合100微升市售的10×细胞裂解缓冲液、150微升10×蛋白酶抑制剂、12.5微升2微摩尔的OG-881工作液以及737.5微升一级双蒸水。在含有化学探针的1×裂解缓冲液中裂解细胞，该化学探针可结合所有游离的KDM1A蛋白。若从组织样本制备，应使用经干冰预冷的研钵和研杵将一块体积为1立方厘米的冷冻组织充分研磨并均质化。将组织分装至一次性小瓶中，确保每个小瓶中转移约40毫克组织粉末，全程避免解冻。将样品储存于-80摄氏度，直至准备处理。若从细胞沉淀制备，将约1000万个细胞的沉淀重悬于200微升含25纳摩尔OG-881的1×细胞裂解缓冲液中。将每个样品短暂涡旋振荡，并置于冰上5分钟。使用超声波破碎仪，在45千赫兹条件下，以每次20秒、共三次脉冲对样品进行超声处理。每次脉冲之间将样品置于冰上冷却20秒。将样品置于冰上继续孵育五分钟。然后短暂涡旋振荡，并在4°C预冷的离心机中以14,000 × g离心10分钟。使用1毫升微量移液器将每份上清液转移至各自的1.5毫升微量离心管中。将离心管置于冰上孵育两小时后再进行处理。随后，按照文本方案中所述的Bradford法测定天然蛋白质的浓度。使用抗KDM1A抗体包被整块酶标板。游离的孔板包被有链霉亲和素。然后将细胞裂解液加入到两块孔板中，KDM1A 复合物通过化学探针或直接被捕获。洗涤孔板后，加入抗 KDM1A 检测抗体以及与辣根过氧化物酶偶联的二抗进行孵育。最后，加入发光底物并产生信号。对于总KDM1A ELISA，每块板需用PBS配制10毫升KDM1A捕获抗体，使其终浓度为每毫升2微克。将100微升加入板的每个孔中。对于游离KDM1A ELISA实验，每块板需配制10毫升PBS中的链霉亲和素溶液，浓度为10微克/毫升。将100微升溶液加入板的每孔中。然后用自粘膜密封板，于4摄氏度孵育过夜。第二天，将培养板从冰箱中取出，于室温下平衡约45分钟。用洗涤缓冲液将每块板洗涤三次，每次洗涤后务必将培养板在纸巾上轻拍，以去除残留液体。向两块板的每个孔中加入200 µL封闭缓冲液。用封板膜密封酶标板，室温孵育 2 小时。同时，用 PBS 将先前获得的天然蛋白提取物稀释至适当浓度，并根据文本方案中所述，使用人源 rKDM1A 设置标准曲线。2 小时孵育结束后，弃去封闭缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板，每次洗涤后均需将酶标板在纸巾上轻拍，以去除残留液体。根据文字方案中表二所示的板布局，将相应稀释的样品转移至预冷的96深孔储存板中。按照文字方案中表三所示的板布局，将每孔100 µL样品加入总ELISA板和游离ELISA板时，保持该储存板置于冰上。室温孵育1小时后，弃去样品，并用洗涤缓冲液洗涤板孔5次。用封闭缓冲液配制20毫升兔抗KDM1A检测抗体，浓度为每毫升0.125微克。除阴性对照孔外，向两块板的每孔中加入100微升检测抗体溶液。用自粘膜将板密封，于室温孵育一小时。此后，弃去检测抗体溶液，并用洗涤缓冲液将酶标板洗涤六次。用封闭缓冲液将二抗（山羊抗兔抗体，HRP）稀释至1:5,000，配制25毫升。向每孔中加入100微升二抗溶液，室温孵育一小时。在此孵育结束前30分钟，于避光条件下，在棕色瓶中将鲁米诺增强剂与过氧化物溶液等体积混合。将此混合液置于室温下备用。当1小时孵育结束后，弃去二抗溶液，并用洗涤缓冲液将板洗涤六次。接下来，将100微升鲁米诺工作液加入到每孔中，注意缓慢移液以避免产生气泡。使用计时器控制加入溶液至进行发光检测之间的时间间隔，并保持该时间恒定，以获得良好的板间重复性。用密封膜封板后，在室温下以500 × g离心45秒，以去除任何残留的气泡。将酶标板置于摇床上，100 rpm 振荡孵育 1 分钟。随后，移除粘性封板膜，将酶标板放入酶标仪中，静置 3 分钟，使温度稳定至 25 摄氏度。读取每块 ELISA 板检测的相对发光单位。保存并复制原始数据电子表格文件中的原始 RLU 值，以供进一步分析。在本研究中，采用了一种新型基于 KDM1A 化学探针捕获的 ELISA 方法，用于直接测量细胞和组织样本中 KDM1A 的靶点结合情况。通过评估总 rKDM1A 和游离 rKDM1A 的 RLU 值，验证其线性关系。将来自三位独立志愿者的人外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到的总KDM1A和游离KDM1A的RLU值叠加至标准曲线上。AML细胞按照供应商的建议进行培养，并用溶剂对照或不同浓度的ORY-1001处理。在含有25毫摩尔OG-881化学探针的条件下获得天然蛋白提取物，并使用0.5微克总蛋白进行靶点结合分析。随后测定总KDM1A和游离KDM1A的含量，并相对于对照组计算ORY-1001对KDM1A的靶点占有率百分比。此处展示了在口服灌胃给予ORY-1001后，大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）和肺组织中KDM1A靶点占有率的剂量依赖性变化，计算时以对照组为参照。将对照组动物的肺组织蛋白提取物在体外与25纳摩尔ORY-1001孵育，可达到完全的靶点占有率（TE）；然而，在经30微克/千克ORY-1001连续处理四天的大鼠样本中，该孵育不再进一步提高靶点占有率，证实KDM1A在体内已被完全抑制。本方案通过检测游离态和总KDM1A水平来评估KDM1A的靶点结合情况。请注意，该方法需要进行天然蛋白提取。该技术可用于来自不同物种的样本，以评估特异性抑制剂，也可用于筛选新的抑制剂。本研究中使用的化学探针也可应用于化学蛋白质组学，以研究 KDM1A 相互作用组。在处理生物样本和生物活性化合物（如 KDM1A 抑制剂）时，务必注意安全，并始终遵守预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用基于化学探针的免疫测定直接测量KDM1A目标参与

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利用表面等离子共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂

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双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

学习使用化学探针免疫测定法直接测量KDM1A靶点结合，该方法可用于评估药物与靶蛋白的相互作用，适用于神经肿瘤等疾病的药效学研究，为临床前和临床研究提供可靠的药物动力学分析工具。

基于化学探针免疫测定法直接测量KDM1A靶点结合

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