Name: 血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习利用化学富集与质谱技术检测硝基肽的方法，以血管紧张素II为模型。该技术显著提升硝基肽检测灵敏度，适用于体外生化体系与内源性生物组织的蛋白质组学研究。

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本工作得到了美国癌症协会机构研究基金 IRG-14-195-01 的支持（M. Sharon Stack 为首席研究员；X.L. 为子项目负责人）。本出版物的完成还获得了美国国立卫生研究院、国家转化科学促进中心临床与转化科学奖的部分支持，基金编号为 KL2 TR002530 和 UL1 TR002529（A. Shekhar，项目负责人）。X. L. 获得了印第安纳临床与转化科学研究所 KL2 青年研究员奖。S. F. 得到了沃尔瑟癌症基金会推进基础癌症研究基金的支持。X. W. 得到了中国国家自然科学基金面上项目（项目编号：817773047）的支持。

1. 血管紧张素II的硝化反应
<ol>
	<li>为制备硝化肽，将10 μL血管紧张素II（DRVYIHPF）母液（2 mM，溶于水）加入390 μL PBS溶液（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.4）中稀释，终浓度为50 μM。</li>
	<li>向血管紧张素II溶液中加入10 μL过氧亚硝酸盐（200 mM，溶于4.7% NaOH），使过氧亚硝酸盐终浓度达到5 mM。 
	注意：过氧亚硝酸盐不稳定，在酸性条件下易分解，因此其母液需保存在碱性溶液中，并储存在-80 °C。</li>
	<li>用1 M HCl调节溶液pH至7–8。为启动硝化反应，以400 rpm振荡反应管5分钟。</li>
	<li>使用市售反相固相萃取柱（见材料表）进行脱盐。
	<ol>
		<li>准备两种脱盐用溶液：5%甲醇水溶液用于洗涤，80%甲醇水溶液用于洗脱。</li>
		<li>先加入500 μL甲醇，再加入500 μL水以预平衡柱子，将1 mL移液枪头置于柱子上方，按压移液器以加快流速。</li>
		<li>将步骤1.3中的410 μL样品加载到柱子上，弃去穿流液。</li>
		<li>用500 μL 5%甲醇洗涤后，使用300 μL 80%甲醇洗脱硝化肽，随后在常温下以真空离心浓缩仪默认设置完全干燥。 
		注意：脱盐对后续反应至关重要，因前一步骤残留的溶剂可能对后续步骤产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过二甲基标记对伯胺进行烷基化
<ol>
	<li>将粉末状硝基血管紧张素II用100 μL的100 mM三乙基铵碳酸氢盐（TEAB）溶液重悬。 
	注意：溶液pH值应在7至9之间，并确保溶液中不含有任何伯胺。</li>
	<li>向溶液中加入4 μL的4%甲醛溶液，短暂混匀。 
	警告：甲醛蒸气有毒，实验应在通风橱中进行。</li>
	<li>向溶液中加入4 μL的0.6 M NaBH3CN，于室温下以400 rpm振荡反应1小时。</li>
	<li>加入16 μL的1%氨水溶液以终止标记反应，室温孵育5分钟。</li>
	<li>加入8 μL甲酸对溶液进行酸化，并按照步骤1.4所述方法使用反相固相萃取柱进行脱盐处理。</li>
</ol>
3. 将硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸
<ol>
	<li>将二甲基标记的硝基血管紧张素II溶于500 μL PBS（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.4）中进行重悬。</li>
	<li>向溶液中加入10 μL 1 M连二亚硫酸钠，室温孵育1小时。还原反应完成后，溶液的黄色变为无色。 
	注意：称取174.1 mg连二亚硫酸钠，溶于水中并定容至1 mL，配制成溶液。该溶液可在-20 °C保存，但不得超过一周。</li>
	<li>使用反相SPE柱进行脱盐，操作步骤如第1.4步所述。</li>
</ol>
4. 生物素标记、富集与检测
<ol>
	<li>将二甲基标记的氨基血管紧张素 II 溶于 500 μL PBS（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.4）中进行重悬。</li>
	<li>在室温下孵育 2 小时后，向溶液中加入 5 μL 溶于 DMSO 的 40 nM NHS-S-S-生物素，随后加入 1 μL 5% 盐酸羟胺以终止反应。</li>
	<li>同时，用 500 μL PBS（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.4）对链霉亲和素琼脂糖微珠进行平衡，于室温下以 580 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复平衡步骤 3 次。</li>
	<li>向反应体系中加入 100 μL 链霉亲和素琼脂糖微珠，在室温下于旋转摇床上孵育 1 小时。用 PBS（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.4）洗涤 4 次。每次洗涤时，向微珠中加入 500 μL PBS，充分混匀，然后于室温下以 580 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 400 μL 10 mM 二硫苏糖醇（DTT），在 50 °C 下与琼脂糖微珠孵育 45 分钟，于室温下以 580 × g 离心 5 分钟后弃去微珠，向上清液中加入 20 μL 0.5 M 碘乙酰胺（IAM），避光反应 20 分钟。 
	注：DTT 用于断裂生物素与肽之间连接子的二硫键，使肽从微珠上释放，并进一步被 IAM 烷基化。</li>
	<li>使用反相固相萃取柱（SPE 柱）进行第 1.4 步所示的脱盐处理。</li>
	<li>将干燥的肽溶解于 20 μL 0.1% 甲酸（FA）中后，对各组分产物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。
	<ol>
		<li>使用纳米高效液相色谱系统直接连接高分辨质谱仪，以 0.300 μL/min 的流速，采用 60 分钟梯度洗脱程序分离修饰后的 Ang II 肽段（0–8 分钟，2% B；8–10 分钟，5% B；10–35 分钟，18% B；35–50 分钟，28% B；50–52 分钟，80% B；52–58 分钟，80% B；58–59 分钟，2% B；59–60 分钟，2% B）。 
		注：分析柱内径为 75 μm，长度为 150 mm，填充 C-18 树脂。流动相 A 为 0.1% 甲酸，流动相 B 为含 0.1% 甲酸的 100% 乙腈。</li>
		<li>将质谱仪设置为数据依赖性采集模式，先采集一次全扫描质谱（300–1800 m/z，分辨率 60 000），随后进行 20 次数据依赖性 MS/MS 扫描，归一化碰撞能量设为 28%。</li>
		<li>打开质谱数据，鉴定每一步产物的峰，以确认化学反应已成功完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 硝基肽的定量分析
<ol>
	<li>从步骤1.4制备3组硝基血管紧张素II溶液，每组包含两种浓度的硝基血管紧张素II：第1组，A管和B管各含20 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中；第2组，C管含10 nmol，D管含20 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中；第3组，E管含40 nmol，F管含10 nmol，每管溶于100 μl TEAB溶液中。 
	注意：每组中两种浓度的硝基血管紧张素II用于二甲基标记，分别与甲醛（轻型）和氘代甲醛（重型）反应。</li>
	<li>对于每组样品，分别向需标记为轻型和重型的样品中加入4 μL 4%的甲醛和氘代甲醛。按照步骤2.3至2.5完成二甲基标记。</li>
	<li>混合轻型和重型标记的样品。</li>
	<li>按照步骤3.1至4.6进行还原、生物素标记、富集和检测。</li>
</ol>

<ol><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+oxidants%2C+and+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li>
<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+nitration%3A+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin%2C+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin%2C+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li>
<li>Batthyány, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Nitrated+Proteins%3A+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li>
<li>Feeney, M. B., Schöneich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li>
<li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li>
<li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li>
<li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了硝化肽的富集与分析流程。以血管紧张素II作为模型肽，我们展示了如图1所示的操作步骤。在获得硝化血管紧张素II后，应封闭肽段上的伯胺基团，以避免进一步发生胺偶联反应，这是本方案中最关键的步骤之一。在本方案中，采用二甲基标记法封闭伯胺基团，原因有二：第一，该方法可实现定量分析；第二，其反应成本低于基于NHS的反应，且封闭效率较高13。在定量分析中，测得的轻重同位素比值与预期比值非常接近（图7），误差小于10%。
该实验方案的另一个关键步骤是使用连二亚硫酸钠将二甲基标记的肽段上的3-硝基酪氨酸快速高效地还原为氨基酪氨酸。新生成的氨基基团进一步与5倍过量的NHS-S-S-生物素进行标记。若NHS-S-S-生物素用量不足或过量，将分别导致标记反应不完全或富集不完全。DTT可完全断裂二硫键，使富集的肽段从链霉亲和素磁珠上释放，随后经IAM烷基化处理，并通过LC-MS/MS进行分析。
<p class="jov...

蛋白质中酪氨酸残基硝化形成3-硝基酪氨酸，可调控多种生物学过程。由于酪氨酸与3-硝基酪氨酸在化学性质上存在差异，硝化后的蛋白质其信号传导活性可能发生改变1,2。因此，开发能够高效富集并鉴定蛋白质硝化位点的方法具有重要意义。相较于磷酸化、乙酰化等其他蛋白质翻译后修饰形式，3-硝基酪氨酸在蛋白质中的丰度较低，因此直接从细胞系或组织样本中鉴定内源性硝化位点具有挑战性。尽管如此，利用质谱（MS）技术表征硝基肽段裂解模式的方法已有发展（例如Zhan &amp;#38; Desiderio3），这为硝基蛋白质组学新方法的建立奠定了基础。&#160;
目前，富集步骤结合质谱分析是硝基肽谱分析最有效的策略4,5富集方法可分为两类：一类基于能够特异性识别3-硝基酪氨酸的抗体，另一类则基于化学衍生法，将硝基还原为氨基。4,5对于基于抗体的方法，使用硝基酪氨酸亲和柱进行富集，随后对洗脱物进行高分辨率质谱分析。6,7对于基于化学衍生化的方法，首先应通过乙酰化、相对与绝对定量同重标记（iTRAQ）或串联质谱标签（TMT）试剂阻断肽段N端或赖氨酸的氨基。随后使用还原剂将硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸，接着对新生成的氨基进行修饰，包括生物素连接、巯基肽转化或其他类型的标记系统。8,9,10,11. 目前建立的大多数方案均基于 体外 过度硝化的蛋白质，而非内源性硝化蛋白质。
本研究建立了一种改良的硝基酪氨酸化学衍生化方法，用于硝基肽的富集与鉴定，该方法在质谱检测中表现出更高的灵敏度，并适用于定量分析。我们近期在生物系统中应用该方法的研究发现，髓源性抑制细胞（MDSCs）产生的活性氮物种（RNS）可导致淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）在Tyr394位点发生硝基化，这在肿瘤微环境的免疫抑制过程中发挥着重要作用12。因此，本硝基肽鉴定方法同样可应用于复杂的生物样品。本文以血管紧张素II作为模型肽进行实验方案的描述，该肽段的碎裂模式已知，且在硝基蛋白质组学研究中被广泛使用8,9,10,11。

<table><tbody><tr><td>Acclaim pepmap 100 C18 色谱柱</td><td>Thermo-Fisher</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>1 M TEAB 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>50% 羟胺</td><td>Thermo-Fisher</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A955</td><td>质谱级</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>甲醛-D2</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>F691353</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td>ACS 试剂</td></tr><tr><td>Fusion Lumos 质谱仪</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A456</td><td>质谱级</td></tr><tr><td>NHS-S-S-生物素</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21441</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 柱（10 mg）</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>过氧亚硝酸盐</td><td>Merck-Millipore</td><td>516620</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42077</td><td>PharmaGrade</td></tr><tr><td>连二亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>工业级</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 nanoLC</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素ii为例

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

蛋白质酪氨酸残基的硝基化是最重要的翻译后修饰（PTM）之一，可由真核细胞中活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的化学作用诱导产生。精确鉴定蛋白质上的硝基化位点对于理解与蛋白质硝基化相关的生理和病理过程（如炎症、衰老和癌症）至关重要。由于即使在诱导条件下，细胞中硝基化蛋白质的丰度仍然很低，目前尚未建立通用且高效的蛋白质硝基化位点分析与鉴定方法。本文介绍了一种通过化学还原反应结合生物素标记富集硝基肽段，并利用高分辨质谱进行鉴定的实验方案。在本方法中，硝基肽衍生物可被高精度地识别。与先前报道的方法相比，本方法具有两个优势：第一，采用二甲基标记封闭硝基肽段上的伯胺基团，可用于获得定量结果；第二，使用含二硫键的NHS-生物素试剂进行富集，该二硫键可进一步被还原和烷基化，从而增强质谱检测信号。本方案已在本文中成功应用于模型肽段血管紧张素II的分析。

本论文中硝基化多肽分析的流程图见图1。图2、3、4和5分别为血管紧张素II、硝基化血管紧张素II、二甲基标记的硝基化血管紧张素II和二甲基标记的氨基化血管紧张素II的质谱图。各图中单一同位素峰的m/z值可反映化合物的分子量，表明每一步血管紧张素II的化学修饰均成功实现。图6展示了第4.7步检测到的最终产物，并通过LC-MS/MS对其进行表征。图7展示了通过二甲基标记对硝基化多肽进行定量的结果。轻标与重标组的相对含量通过各组单一同位素峰强度的比较确定，从而实现对不同样本中富集的硝基化多肽的定量分析。
<img alt="血管紧张素II反应；化学过程；示意图；LC-MS/MS分析；肽修...

酪氨酸硝化蛋白的蛋白质组学分析一直是一项具有挑战性的技术，原因是3-硝基酪氨酸修饰的丰度极低。本文以血管紧张素II为模型，介绍一种新型的硝基肽段富集与分析方法。该方法可推广应用于其他 体外 或 体内 系统。

硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素II为例

蛋白质硝基化是酪氨酸残基上最重要的翻译后修饰（PTM）之一，可由化学作用诱导……

该方法有助于通过化学手段和质谱技术来富集和鉴定硝基化肽段，并解答相关关键科学问题。该技术显著提高了质谱检测硝基化肽段的灵敏度，可应用于体外生化体系以及内源性生物组织。对于硝基化血管紧张素II的脱盐处理，使用1毫升移液器，通过向反相固相萃取（SPE）柱上样端加入500微升甲醇和500微升水，对柱子进行预处理。当所有水溶液流经色谱柱后，将 410 微升硝基血管紧张素 II 溶液上样至柱中。用 500 微升 5% 甲醇水溶液和 300 微升 80% 甲醇水溶液洗涤色谱柱，以洗脱硝基肽。随后，在室温下使用真空离心浓缩仪以默认设置将洗脱液干燥。对于伯胺烷基化，将粉末状硝基血管紧张素II溶于100微升100毫摩尔的三乙基铵碳酸氢盐溶液中，并在通风橱内加入400微升4%甲醛溶液，短暂混匀。随后，加入4微升0.6摩尔氰基硼氢化钠溶液，在室温下以每分钟400转的速度振荡反应1小时。孵育结束后，加入16微升1%氨水溶液，在室温下淬灭标记反应5分钟，随后加入8微升甲酸进行酸化。然后使用新的反相固相萃取柱对溶液进行脱盐，方法如前所述。对于硝基酪氨酸还原为氨基酪氨酸的反应，将二甲基标记的硝基血管紧张素II溶于500 µL PBS中，加入10 µL 1 M连二亚硫酸钠，在室温下孵育1小时。还原反应完成后，黄色溶液将变为澄清。按照所示方法，将还原后的样品在新的反相固相萃取柱中进行脱盐。进行生物素标记与富集时，将二甲基标记的氨基血管紧张素II溶于500微升PBS缓冲液中，随后加入5微升浓度为40纳摩尔的NHS-S-S-生物素（溶于二甲基亚砜），室温孵育2小时。孵育结束后，加入1微升5%羟胺终止反应，并将500微升新鲜PBS缓冲液加入100微升链霉亲和素琼脂糖微珠中，通过三次离心进行平衡。最后一次离心后，将100 µL磁珠加入反应体系中，在室温下于旋转摇床中孵育1小时。孵育结束后，每次用500 µL新鲜PBS洗涤体系，共洗涤4次，随后加入400 µL 10 mmol/L二硫苏糖醇，在50 °C下孵育45分钟。孵育结束后，离心柱子，将上清液转移至含有20 µL 0.5 mol/L碘乙酰胺的新离心管中，避光孵育20分钟。然后，如所示，将溶液在新的反相固相萃取柱中进行脱盐，并用20微升0.1%甲酸溶解干燥的肽段。检测时，将产物上样至配备串联质谱仪的液相色谱仪。使用直接与高分辨质谱仪联用的纳米高压液相色谱系统，以每分钟0.3微升的流速，通过60分钟梯度洗脱分离修饰的血管紧张素II肽段。在数据依赖型采集模式下，先在质谱仪中设置一次完整的全扫描质谱，随后进行 20 次数据依赖型串联质谱扫描，归一化碰撞能量为 28%。然后打开质谱数据，识别每一步反应产物的峰，以确认化学反应已成功进行。此处可观察到血管紧张素 II 在每次化学修饰前后具有代表性的质谱图。该化合物的分子量由单一同位素峰的质荷比值表示，表明血管紧张素II在此步骤中的化学修饰已成功实现。此处显示的是通过液相色谱串联质谱检测并表征的最终产物。通过二甲基标记对硝基肽进行定量分析，可通过比较每组中单一同位素峰强度来计算轻链与重链的相对含量，从而实现对不同来源富集硝基肽的定量。按照该步骤，您可以使用程序搜索工具（例如 SEQUEST 或 pFIND 的最大计数法）来鉴定潜在的硝基肽段。该技术发展之后，为研究特异性硝化位点的生物学功能奠定了基础。

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生物化学

血管紧张蛋白II图解的硝酸分析与鉴定

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帕金森病中神经肽的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

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用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

基于肽段的功能基序及其结合伴侣的鉴定

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利用团簇诱导解吸/电离质谱法分析表面复杂分子及其反应

本文详细介绍了一种利用碱性磷酸酶偶联的ScFv...

利用D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光法直接检测组织中的异构左旋前列腺素

本文介绍了一种对由血管紧张素II输注诱导高血压的小鼠进行肾交感神经消融（RDN）的实验方案。该方法可重复、操作便捷，可用于研究RDN对高血压及心脏肥厚的调控机制。...

经血管内去肾交感神经术改善血管紧张素II输注诱导的高血压

本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。...

通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

学习利用化学富集与质谱技术检测硝基肽的方法，以血管紧张素II为模型。该技术显著提升硝基肽检测灵敏度，适用于体外生化体系与内源性生物组织的蛋白质组学研究。

硝基肽的分析与鉴定：以血管紧张素II为例

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