可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过LhGR介导的 转录-激活

发育生物学的关键目标是理解基因在特定环境下的作用。而通过传统的基因敲除突变体或组成型过表达品系往往难以实现这一目标。我们利用模块化的Green Gate克隆系统，构建了一套可用于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）三种主要分生组织中可诱导的细胞特异性表达资源。

采用相同的模块化克隆策略，该方法也可应用于其他难以进行转化的植物物种。本实验步骤的可视化演示具有重要价值，因为分析转激活作用在茎尖分生组织和顶端分生组织中的效应时，需要在成像前进行解剖操作，而这一过程可能极具挑战性。首先，按照文本方案中所述的方法对种子进行灭菌处理。

接下来，配制pH为5.8的半倍浓度Murashige和Skoog培养基，并加入1%蔗糖和0.9%琼脂。高压灭菌后，将溶于DMSO的Dex加入诱导平板中，终浓度为10至30微摩尔。在对照平板中加入等量的DMSO。

将用于根部成像的种子放置在培养皿中，并在4°C、黑暗条件下进行48小时的春化处理。将培养皿垂直放入植物培养箱中，培养5天。在萌发后第5天，采用共聚焦激光扫描显微镜对幼苗进行成像。

首先，按照文字实验方案中所述的方法准备并培养种子。种子萌发后六至七天，将每株幼苗移栽至单独的花盆土壤中。若通过浇灌方式进行诱导，需使用水中含25 µM DEX的溶液，该溶液由溶于乙醇的25 mM DEX母液稀释而成。

每两到三天浇水一次，直至诱导时间。若采用浸渍法诱导，准备一个一升烧杯，加入750毫升含有0.02% Silwet L77和终浓度为25微摩尔DEX的水溶液，或加入等量DMSO作为DEX处理和模拟处理对照。将单株植物浸入诱导溶液或模拟溶液中30秒。

每两到三天重复一次，直至达到所需的成像时间。首先，按照文本方案中所述的方法准备并培养种子。种子萌发后六至七天，将每株幼苗移栽至单独的花盆土壤中。

当茎长约达1厘米时，用10至50 µM的DEX水溶液喷洒具有荧光的SAM。若需在发育的后期阶段进行诱导和成像，可对具有较长茎或侧枝的SAM进行诱导。诱导后24至48小时，分离SAM并进行成像。

首先，将幼苗从培养皿转移至含有10 µg/mL碘化丙啶的溶液中，染色5分钟。将根部放入显微镜成像室，使用共聚焦激光扫描显微镜配合63倍水浸物镜进行成像。为观察碘化丙啶荧光，采用488 nm的激发波长，并收集590至660 nm之间的发射光信号。

对于 mTurquoise2 荧光，使用 458 纳米激发光，并通过顺序扫描收集 460 至 615 纳米之间的发射光。首先，用手指固定茎的对侧，使其稳定在目标切段位置。使用剃刀切取一段约三厘米的组织，并进行数次精细切割。

将剃须刀片在含有自来水的培养皿中冲洗，并收集茎段。可对茎段进行染色，或直接将其置于显微镜载玻片上。若需染色，取一反应管，配制1毫升浓度为250微克/毫升的碘化丙啶溶液。

用移液管从培养皿中移除自来水，加入碘化丙啶溶液，染色五分钟。随后移除碘化丙啶溶液，用水冲洗。使用精细镊子或细毛刷将染色后的切片转移至显微镜载玻片上。

使用配备25倍水浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像。采用561纳米激光激发碘化丙啶荧光，并收集570至620纳米的发射光信号。采用405纳米激光激发驱动细胞系构建体编码的mTurquoise2荧光蛋白效应分子，并收集425至475纳米的发射光信号。

首先，用镊子在茎尖下方两厘米处剪断茎。一手握住茎，用精细镊子去除花芽和较大的原基。为去除幼嫩的原基，将茎尖分生组织（SAM）固定在含有3%琼脂糖的培养皿中，保持直立位置。

接下来，使用双目镜和镊子去除靠近茎尖分生组织（SAM）的幼嫩原基。将分离的 SAM 转移至含有 250 微克/毫升碘化丙啶溶液的离心管中。让样品染色 5 到 10 分钟，期间确保样品完全浸没在溶液中。

将染色的 SAM 置于含有 3% 琼脂糖培养基的小型培养皿中，用双蒸水覆盖 SAM。使用配备 25 倍水浸式物镜的共聚焦激光扫描显微镜对分离的 SAM 进行成像。

使用561纳米激光激发碘化丙啶荧光，并收集570至620纳米的发射光。使用405纳米激光激发mTurquoise2荧光蛋白，并收集425至475纳米的发射光。在Z方向上以0.5微米的步长采集跨度为50微米的图像序列。

使用 DEX 诱导可导致根内皮层、韧皮部前体细胞和形成层，以及茎顶端分生组织中的干细胞特异性表达 mTurquoise2。为验证转激活效果，构建了一条编码次生细胞壁主转录因子 VND7 与 V16 激活域融合蛋白的效应子株系。分别用 15 微升 DEX 或 DMSO 单独处理五天后，制备茎切片以观察叶鞘起始部位的异位木质化现象。

在诱导样品中，起始鞘细胞在碘化丙啶通道中显示出强烈的信号，部分细胞表现出木质部细胞壁典型的网状加厚结构。观看本视频后，您应清楚地了解如何在不同组织中诱导基因表达，以及如何为成像准备样品。通过该实验流程，已建立的驱动品系可与不同用户根据各自研究兴趣构建的多种效应子载体联合使用。

该方法可帮助植物研究人员以节省时间的方式快速评估目标基因在特定细胞类型中表达或敲低的效果。这种细胞类型特异性的诱导系统需要使用皮质类固醇地塞米松。应避免直接接触，因此在处理过程中必须佩戴手套和口罩。