Name: Lhgra 介导的反激活在拟南芥诱导、细胞类型特异性表达中的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习利用模块化绿色门克隆系统在拟南芥分生组织中实现可诱导的细胞类型特异性基因表达。该方法适用于研究植物发育生物学中的基因功能，并可推广至其他难以转化的植物物种。

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本实验室的工作得到了德国研究基金会（DFG）基金项目WO 1660/6-1（资助S.W.）、GR 2104/4-1（资助T.G.）以及SFB1101（资助T.G.和J.U.L）的支持，同时也获得了欧洲研究委员会整合基金（PLANTSTEMS 647148）对T.G.的资助。&#160; S.W. 还获得了DFG颁发的埃米·诺特奖学金（项目编号WO 1660/2）的支持。

载体和模块可从非营利性资源库 Addgene（https://www.addgene.org）获取。
1. 使用 GreenGate 进行克隆
<ol>
	<li>使用 表1 中列出的突出序列设计引物，将“NNNN”替换为以下列出的模块类型特异性接头序列：正向引物：5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 特异性序列 3´，反向引物：5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + 特异性序列的反向互补序列 3´。添加下划线的碱基以确保阅读框的维持。 
	模块突出序列： 
	&#8203;注意：在默认的 GreenGate 框架中，六个模块 A-F 与植物转化载体骨架组装成一个表达质粒（图1C）。通常，A 模块包含启动子序列，B 模块包含N端标签或“虚拟”序列6，C 模块包含编码序列（CDS），D 模块包含C端标签或虚拟序列，E 模块包含终止子，F 模块包含用于筛选转基因植物的抗性盒。可使用用于与其他预组装单元连接的接头替代 F 模块2。</li>
	<li>PCR 扩增
	<ol>
		<li>根据标准操作流程，使用设计的引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标序列。</li>
		<li>在琼脂糖凝胶上分离 PCR 产物。使用商业试剂盒（参见 材料表）切下并柱纯化正确片段，具体操作按照制造商说明进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>入门模块构建
	<ol>
		<li>分别用 Eco31I/BsaI 酶切模块载体和 PCR 片段（步骤 1.2）（图1 A, B），取 100–500 ng DNA（载体或片段）、3 µL 10× 消化缓冲液和 5–10 U Eco31I 于离心管中，用 ddH2O 补足至 30 µL 总体积。</li>
		<li>轻轻吹打混匀，短暂离心（1,000 × g）。在 37 °C 恒温金属浴中孵育 15 分钟（或根据所购限制性内切酶推荐时间操作）。</li>
		<li>消化完成后，使用商业试剂盒（参见 材料表）对每个样品进行柱纯化，并通过分光光度计测定 260 nm 处的光密度（OD260）来定量所得 DNA。</li>
		<li>将 30–100 ng 消化的插入片段与 10–50 ng 消化的载体通过反复吹打混匀，在室温下于总反应体积 30 µL 中加入 1 µL T4 连接酶（5 U/µL）和 3 µL 10× T4 连接缓冲液，孵育 1 小时（遵循 T4 连接酶供应商的建议）（参见 材料表）。 
		注意：根据入门模块插入片段的浓度和长度，计算所需的摩尔比（入门模块 : 目标载体，例如 3:1）用于连接反应。</li>
		<li>为提高转化效率，将反应体系在 65 °C 孵育 20 分钟以热失活 T4 连接酶。</li>
		<li>根据标准实验室操作流程，将连接产物用于转化感受态 E. coli 细胞，并将细菌涂布于添加氨苄青霉素（100 µg/mL）的琼脂平板上。</li>
		<li>将平板在 37 °C 培养过夜。</li>
		<li>使用引物 86A1（5′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′）和 86A2（5′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′）进行菌落 PCR，筛选含有目标入门模块的克隆。 
		注意：该引物组合适用于所有入门模块，因为引物结合于入门载体骨架。</li>
		<li>挑选单克隆进行质粒提取。使用 2 mL 添加氨苄青霉素（100 µg/mL）的 LB 液体培养基，在 37 °C 摇床中过夜培养。</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒或所需提取方法从过夜液体培养物中提取质粒（参见 材料表）。</li>
		<li>为鉴定含有正确插入片段的质粒，进行限制性内切酶分析，例如选择两种在插入片段中具有唯一酶切位点的酶，将 200 ng 质粒、2 µL 10× 消化缓冲液、5–10 U 所选限制性内切酶和 ddH2O 混合至 20 µL 总体积。</li>
		<li>使用引物 86A1 和 86A2（见步骤 1.3.9）对筛选出的质粒进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>目标模块构建： 
	注意：对于目标质粒，请使用所需的目标模块 pGGZ001、pGGZ002 或 pGGZ0032（图1C）。
	<ol>
		<li>在离心管中加入并混合 50–150 ng 空的目标载体（例如 pGGZ003）、每种已构建的入门模块 50–300 ng、2 µL 10× 消化缓冲液、1.5 µL 10 mM ATP、1 µL T4 连接酶（30 U/µL）、5–10 U/µL Eco31I，并用 dH2O 补足至 20 µL 总体积。 
		注意：根据入门模块插入片段的浓度和长度，计算所需的摩尔比（入门模块 : 目标载体，例如 3:1）用于连接反应。</li>
		<li>混合后使用 PCR 仪进行 GreenGate 反应2，循环 30 次，每次交替在 37 °C 孵育 5 分钟和 16 °C 孵育 2 分钟，随后在 50 °C 和 80 °C 各进行一次 5 分钟的单步反应。</li>
		<li>为提高效率，向反应体系中加入 1 µL T4 连接酶（30 U/µL）和 1.5 µL 10 mM ATP，在室温下孵育 1 小时，随后在 65 °C 热失活 T4 DNA 连接酶 20 分钟。</li>
		<li>将连接反应产物用于转化感受态 E. coli，并将细菌涂布于添加适当选择剂——壮观霉素（50 µg/mL）的琼脂平板上。</li>
		<li>将转化后的 E. coli 在 37 °C 培养过夜。</li>
		<li>为确认转化结果，将每个筛选出的单克隆分别在含壮观霉素（50 µg/mL）和氨苄青霉素（100 µg/mL）的平板上重新划线。仅使用能在壮观霉素平板上生长而不能在氨苄青霉素平板上生长的克隆。</li>
		<li>将 E. coli 克隆在 37 °C 培养过夜。</li>
		<li>挑选单克隆进行质粒提取。使用 2 mL 添加壮观霉素（50 µg/mL）的 LB 液体培养基，在 37 °C 摇床中过夜培养。</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒（参见 材料表）提取相应质粒。</li>
		<li>通过限制性内切酶分析（见 1.3.12）检测，并使用引物 88C3（5′-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′）和 88C4（5′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′）对筛选出的阳性构建体进行测序。若无法用这些引物完全测序插入片段，可设计内部引物进行测序。 
		注意：为鉴定含有正确数量 pOp 重复序列的克隆（见讨论部分），可使用结合于短侧翼序列的引物 pOp6（pOp6_F，5′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′；和 pOp6_R，5′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′）进行 PCR 扩增，随后通过凝胶电泳根据片段大小进行区分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中间超级模块构建
	<ol>
		<li>为组合两组独立的入门模块（如构建整合报告-效应盒的 GR-LhG4 驱动系所需），需先在 pGGZ001 或 pGGZ003 中构建两个中间质粒，称为超级模块2，再组装最终表达质粒。</li>
		<li>确保在第一个超级模块末端添加 F-H 接头，在第二个超级模块起始处添加 H-A 接头（这些接头作为两个构建体之间的连接），具体方法见文献2。 
		注意：仅 pGGN000 中间模块携带抗性盒。为生成表达质粒，需将目标载体与 pGGN000 和 pGGM000 中间超级模块进行 GreenGate 反应。或者，也可将目标载体、pGGN000 中间超级模块与其余单个模块混合进行 GreenGate 反应2。后一种方法效率较低，但可能更快。</li>
		<li>构建 pGGM000/pGGN000 超级模块时，将每种入门模块各 1.5 µL（100–300 ng/µL）与 1 µL（30 ng/µL）空中间载体（pGGM000 或 pGGN000）、2 µL 10× 消化缓冲液、1.5 µL 10 mM ATP、1 µL T4 连接酶（30 U/µL）和 5–10 U Eco31I 混合，总体积为 20 µL。 
		注意：根据入门模块插入片段的浓度和长度，计算所需的摩尔比（入门模块 : 目标载体，例如 3:1）用于连接反应。</li>
		<li>混合后参照步骤 1.4.2 进行 GreenGate 反应。</li>
		<li>为提高效率，加入 1 µL T4 连接酶和 1.5 µL ATP（10 mM），在室温下孵育 1 小时，随后在 65 °C 热失活 20 分钟。</li>
		<li>取 10 µL 连接反应产物转化感受态 E. coli，并在含卡那霉素（50 µg/mL）的平板上划线。</li>
		<li>将转化后的 E. coli 在 37 °C 平板上过夜培养。</li>
		<li>将每个筛选出的单克隆分别在含卡那霉素（50 µg/mL）和氨苄青霉素（100 µg/mL）的平板上重新划线。</li>
		<li>将 E. coli 克隆在 37 °C 平板上过夜培养。</li>
		<li>挑选仅在卡那霉素平板上生长而不在氨苄青霉素平板上生长的单克隆进行质粒提取。使用 2 mL 添加卡那霉素（50 µg/mL）的 LB 液体培养基，在 37 °C 摇床中过夜培养。</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒（参见 材料表）提取相应质粒。</li>
		<li>通过限制性内切酶分析（见 1.3.12）检测质粒，并使用引物 87E2（5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´）和 87E3（5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´）对 pGGM000/pGGN000 骨架进行测序验证。若无法用这些引物完全测序插入片段，可设计内部引物进行测序。 
		注意：若克隆至 pGGM000 或 pGGN000 载体失败，一种可能的解决方案是用 Eco31I 消化 pGGM000 或 pGGN000，跑胶后从凝胶中纯化出不含 ccdB 盒（约 1400 bp）的 pGGM000 或 pGGN000 骨架片段（约 2000 bp），然后正常进行连接反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化 A. tumefaciens pSOUP+ 菌株（例如 ASE），因为目标载体中的 pSa 复制起点（ori A. tum.）需要辅助质粒 pSOUP 的存在12。将细菌划线接种于含氯霉素（34 µg/mL）、卡那霉素（50 µg/mL）、壮观霉素（50 µg/mL）和四环素（12.5 µg/mL）的 LB 平板上。将转化后的 A. tumefaciens 在 28 °C 培养箱中培养 2 至 3 天。</li>
</ol>
2. 拟南芥转基因植株的制备
<ol>
	<li>拟南芥（Arabidopsis thaliana）的转化。 
	注：按照 Zhang 等人，200613 的方法对拟南芥（A. thaliana）植株进行转化。</li>
	<li>转基因株系的筛选。
	<ol>
		<li>为筛选转化植株，采用 GABI-Kat14 所使用的抗磺胺嘧啶15 的筛选方案。</li>
		<li>为获得可能发生单一位点整合的稳定株系，选择在 T2 代中抗性标记呈现 3:1 分离比的株系。将这些株系繁殖至 T3 代，并筛选对抗性基因纯合的植株。或者，可通过 Southern 印迹杂交分析或标准定量实时 PCR（SA-qPCR）16 来筛选单拷贝插入株系。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 反式激活的诱导 拟南芥 驱动品系
<ol>
	<li>根
	<ol>
		<li>检测报告基因的表达 拟南芥 通过步骤1和2获得的转基因品系，按以下方法对种子进行灭菌。
		<ol>
			<li>向含有约100粒种子（20 mg）的1.5 ml离心管中加入0.5–1.0 mL 70%乙醇 + 0.01%非离子型去污剂，轻轻颠倒混匀数次。在1000 × g离心15 s，吸除上清液。</li>
			<li>加入 0.5–1.0 mL 无水乙醇，倒置离心管数次，以 1,000 x g 15 秒后弃去上清液。</li>
			<li>加入0.5–1.0 mL无水乙醇，倒置离心管数次，然后在1,000 x g 15秒后弃去上清液。</li>
			<li>在超净工作台内让种子干燥。如果种子需要在离心管中进行分层处理，则继续执行步骤 3.1.1.6。</li>
			<li>加入 0.5–1.0 mL 无菌水，轻轻颠倒离心管数次。以 1,000 x g 15秒后弃去上清液。</li>
			<li>加入 0.5–1.0 mL 无菌水，倒置离心管数次。以 1,000 x g 15秒后弃去上清液。</li>
			<li>加入 0.5–1.0 mL 无菌水。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制半倍浓度的Murashige和Skoog培养基，pH 5.8，加入0.9%植物琼脂和1%蔗糖。高压灭菌后，向诱导组平板中加入用DMSO溶解的Dexamethasone（Dex），终浓度为10–30 µM；向对照组平板中加入等量的DMSO。</li>
		<li>将用于根部成像的种子置于培养皿中，并在黑暗及低温（4 °C）条件下层积处理48小时。</li>
		<li>将培养皿垂直放置于植物培养箱中（长日照条件，16/8 小时，22 °C，湿度 65 %），培养五天。</li>
		<li>萌发后第五天（dag），使用共聚焦激光扫描显微镜对幼苗进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>干细胞
	<ol>
		<li>按照2.1.1节所述对种子进行灭菌，将种子置于含½ MS、0.9%植物琼脂和1%蔗糖的培养基平板上。在黑暗及低温（4 °C）条件下层积处理48 h。</li>
		<li>萌发后6至7天，将幼苗移栽至土壤中，每株植物单独种植于一个花盆中（长日照条件（16/8小时），22 °C，湿度65%）。</li>
		<li>通过浇灌Dex或模拟溶液，或分别将植株浸入Dex或模拟溶液中，诱导茎中转激活。</li>
		<li>浇水时使用含25 µM Dex的水溶液，该溶液由溶于乙醇的25 mM Dex母液稀释而成，每2-3天浇水一次，直至达到预期的诱导时间。</li>
		<li>用于浸渍处理时，准备一个1 L烧杯，其中加入含有0.02% Silwet L-77的750 mL水溶液，并分别添加25 µM Dex或等量DMSO，用于Dex处理和对照处理。将单株植物分别浸入诱导溶液或对照溶液中30秒。每隔2–3天重复一次，直至达到所需的成像时间。 
		注意：浸染后，植物需在高湿度环境中培养一小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>茎尖分生组织（SAM）
	<ol>
		<li>按照2.1.1节所述对种子进行灭菌。制备含有½ MS、0.9%植物琼脂和1%蔗糖的培养基平板，并将种子接种于平板上。将平板置于黑暗及低温条件下放置两天，进行春化处理。</li>
		<li>将培养皿垂直放入植物培养箱中。种子萌发后6至7天，将幼苗移栽至土壤中，每株植物单独种植于一个花盆中（长日照条件（16/8 h），22 °C，湿度65%）。</li>
		<li>当茎长约达1 cm（25–30 天）时，用含有10–50 µM Dex的H₂O喷洒花序分生组织（SAM）20 佩戴口罩。对于发育后期阶段的诱导与成像，可诱导较长茎段或侧枝的SAMs。 
		注意：也可通过毛笔涂抹Dex溶液来诱导SAMs，以避免喷雾液滴产生。当采用喷雾方式施用Dex时，务必佩戴口罩。</li>
		<li>诱导后24–48小时，解剖SAMs并进行成像（见4.3节）。 
		注意：仅使用未诱导的植株进行繁殖，以降低基因沉默的发生概率。T2/T3 代植株用于成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 报告基因表达的成像 拟南芥 驱动细胞系
<ol>
	<li>根
	<ol>
		<li>将幼苗从培养板转移至含有10 µg/mL碘化丙啶（PI）的溶液中，染色5分钟。</li>
		<li>将根放入显微镜成像室（盖玻片II上的单孔组织培养室，参见材料表），使用配备63倍水浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜进行成像（参见材料表）。</li>
		<li>为观察PI荧光，采用488 nm激发波长，收集590至660 nm的发射光。对于mTurquoise2荧光，使用458 nm激发波长，收集460至615 nm的发射光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>茎
	<ol>
		<li>使用剃须刀片对植物茎进行横向徒手切片，切取约3 cm长的茎段。用手指固定待切部位另一侧的茎部，依次进行多次精细切割，但应注意仅比较茎中相似位置的切片。</li>
		<li>每次切割后，将刀片浸入盛有自来水的培养皿中，并收集茎切片。此时可对切片进行染色，或直接将其置于显微镜载玻片上。</li>
		<li>染色时，在小培养皿中配制1 mL浓度为250 µg/mL的PI水溶液（参见材料表）。将切片浸入溶液中染色5分钟，随后用清水冲洗。使用精细镊子或细毛笔将切片转移至显微镜载玻片上。加盖盖玻片时注意不要挤压样品。</li>
		<li>使用配备25倍浸水物镜的共聚焦激光扫描显微镜对样品成像（参见材料表）。采用561 nm激光激发PI荧光，收集570至620 nm的发射光；采用405 nm激光激发驱动系构建体编码的mTurquoise2荧光蛋白，并收集425至475 nm的发射光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>茎尖分生组织
	<ol>
		<li>用镊子在茎尖下方2 cm处切断茎。一手握住茎，用精细镊子去除花芽和较大的原基。为去除较年轻的原基，将茎尖分生组织（SAM）垂直固定在含有3%琼脂糖的培养皿中。使用体视显微镜和镊子去除靠近SAM的幼嫩原基。也可使用注射针头（参见材料表）切除这些原基。</li>
		<li>将分离的SAM置于250 µg/mL的PI溶液中染色5–10分钟。染色可直接通过移液器滴加数滴染色液至制备好的SAM上进行，也可将样品转移至装有染色液的离心管中。染色过程中应确保SAM完全浸没于溶液中。</li>
		<li>将染色后的SAM放入含有3%琼脂糖培养基的小培养皿中（参见材料表），并在SAM上覆盖ddH2O。</li>
		<li>使用配备25倍浸水物镜的共聚焦激光扫描显微镜对分离的SAM进行成像（参见材料表）。</li>
		<li>采用561 nm激光激发PI荧光，收集570至620 nm的发射光；采用405 nm激光激发mTurquoise2荧光蛋白，收集425至475 nm的发射光。 
		采集z轴方向跨度为50 µm、步长为0.5 µm的图像序列。 
		注意：此处所述的SAM成像需要使用直立式共聚焦激光扫描显微镜，并配备工作距离较长的物镜（此处为浸水物镜）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了构建和应用一种多功能且全面的诱导型、细胞类型特异性trans-激活工具包所需的关键步骤。将携带由pOp启动子调控的效应元件表达盒的品系与驱动品系杂交，可在F1代中研究基因异位表达的效应，从而快速评估多种细胞类型中遗传扰动的结果。此外，也可将效应元件构建体转化至驱动品系中；或者通过调整克隆策略，将驱动元件和效应元件构建体共同构建于同一T-DNA上。该系统应用广泛，包括时空可控的基因异位表达研究、结构域特异性基因敲低或基因编辑，以及细胞类型特异性的功能互补实验。
本文所述的所有实验步骤对于具备常规分子生物学技术条件的实验室而言均不应构成困难。LhG4表达系统经过充分验证，可确保无泄漏且可调节的表达，并能够实现高水平的表达8，但我们提醒，诱导剂浓度的动态范围应针对每种驱动系与效应系组合通过实验确定。将这一经过验证的系统与模块化的GreenGate克隆技术相结合，为在任何具有特异性启动子的细胞类型中实现可诱导表达提供了一种快速而简便的方法。我们注意到，在含有pOp-type启动子...

在后基因组时代，生物学研究的一个主要局限在于解析特定环境下某一因子或遗传扰动的具体作用。组成型遗传扰动方法（如功能缺失和功能获得策略）通常仅能对终生适应过程进行终点分析，从而模糊了初级效应与次级效应之间的区别。此外，特定环境下的功能可能被远端组织的大范围效应或发育其他阶段的影响所掩盖或稀释。更极端情况下，致死性会阻碍任何机制性研究的开展。理想情况下，为克服上述问题，可在特定细胞类型等具体环境中，以时间分辨的方式分析急性遗传扰动所产生的效应。为此，需要具备可诱导、细胞类型特异性表达功能的遗传工具。1为了提供一种快速评估特定效应物反应时空动态的资源，我们结合了GreenGate系统在克隆操作上的简便性2 GR-LhG4 系统已证实的有效性3,4,5,6我们构建了一系列表达嵌合型转录因子LhG4与大鼠皮质类固醇受体（GR）配体结合域融合蛋白的品系7 在特征明确的细胞类型特异性启动子的调控下8在静息状态下，转录因子位于细胞核外，因为糖皮质激素受体（GR）结构域与胞质中的HSP90结合。加入合成配体地塞米松（Dex）后，可诱导其向细胞核内转位，LhG4将介导由相应合成启动子控制的表达盒的转录 pOp型 启动子，例如驱动品系中包含的 mTurquoise2 报告基因，用于在诱导后可视化表达区域。&#160; 因此，驱动品系在技术上也包含一个效应子表达盒。将一组驱动品系与携带效应子表达游戏副本的品系进行杂交，该表达盒中例如包含受同一调控元件控制的目标基因 pOp型 因此，该启动子能够快速评估效应分子在多种细胞类型中表达后的急性或长期效应。
本文提供了一种实验方案，描述了构建驱动系和效应系所需的步骤，并展示了如何在拟南芥（Arabidopsis）的茎顶端分生组织、根顶端分生组织以及形成层中诱导并追踪特定细胞类型的表达。为展示该方法的强大功能与特异性，我们采用了已知的转录因子VND7，该因子能够异位诱导木质部样次生细胞壁加厚9。将pSCR10,11驱动系与pOp6:VND7效应系杂交所得的F1代植株进行处理，可在拟南芥茎的淀粉鞘细胞中诱导产生异位的木质部样细胞。
为了促进构建驱动元件和效应元件表达质粒所需的大型DNA组装，我们采用了快速高效的GreenGate克隆方法2。GreenGate克隆基于II型S限制性内切酶，例如Eco31I或其同裂酶BsaI2。这些酶在其不对称识别位点的下游切割，产生具有不同碱基组成的黏性末端。通过在寡核苷酸中引入Eco31I/BsaI限制性酶切位点，并为DNA元件分配特定的黏性末端序列，实现模块化克隆，从而促进大型DNA组装的构建。在GreenGate体系中，DNA模块根据其黏性末端序列分为A-F类，作为适配器按此顺序进行组装。因此，设计用于扩增目标产物的引物应与所选模块相匹配2（图1A）。如果目标序列内部存在Eco31I/BsaI位点，且该序列与GreenGate入门载体和目的载体模块不兼容，可不进行突变直接进行实验，但效率较低。或者，可通过定点突变去除Eco31I/BsaI限制性酶切位点，同时注意避免改变基因产物中的氨基酸序列。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.1</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>柱层析纯化</td><td>Qiagen</td><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)</td><td></td></tr><tr><td>成像用培养室</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co. KG</td><td>1 孔组织培养室，置于盖玻片 II 上</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4903</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>D139-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Eco&lt;/em&gt;31I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0294</td><td></td></tr><tr><td>注射套管（0.30 × 12 mm，30 G × 1/2）</td><td>Sterican, Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜，HCX PL APO lambda blue 63× 水浸物镜</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS 培养基</td><td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td><td>M0221.0050</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 共聚焦激光扫描显微镜，Apo LWD 25×&amp;nbsp;1.1 NA 水浸物镜</td><td>Nikon, Minato, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿 35/10 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 60/150 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 120/120/17</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>植物琼脂</td><td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>质粒提取</td><td>Qiagen</td><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td><td>7005115E</td><td></td></tr><tr><td>反应管</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co. KG</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Kurt Obermeier GmbH &amp;amp; Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>AppliChem GmbH</td><td>3834.001</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>磺胺嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6387</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>AppliChem GmbH</td><td>2228.0025</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶 5 U/&amp;micro;l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶 30 U/&amp;micro;l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr></tbody></table>

可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过lhgr介导的 转录-激活

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

可诱导的、组织特异性表达是研究基因扰动时空动态的重要且强大的工具。通过将灵活高效的GreenGate克隆系统与已验证且作为基准的LhGR系统（本文称为GR-LhG4）相结合，用于实现可诱导表达，我们构建了一组转基因拟南芥品系，可在三种主要植物分生组织的多种特定细胞类型中驱动效应元件表达。为此，我们选用了先前开发的基于嵌合转录因子及其对应顺式作用元件的GR-LhG4系统 pOp型 启动子，可在广泛的表达水平上实现严密调控。此外，为了可视化合成转录因子活性的表达区域，使用由该启动子控制的、定位于内质网的mTurquoise2荧光报告基因 pOp4 或 pOp6 启动子编码在驱动系中。本文描述了构建驱动系或效应系所需的步骤，并展示了如何在茎尖分生组织、根尖分生组织以及维管形成层中诱导并追踪细胞类型特异性表达 拟南芥通过使用一种或多种驱动品系，可在特定背景下研究在人工调控下表达一个或多个因子（效应分子）的作用效果 pOp 启动子可以快速评估，例如在一种效应子与多个驱动系杂交所得的F1代植株中。该策略的一个实例是VND7的异位表达，VND7是一种NAC转录因子，能够以细胞自主的方式诱导异位的次生细胞壁沉积。

通过 GreenGate 克隆技术构建驱动和效应子品系
GreenGate 克隆系统基于 GoldenGate 克隆技术，使用 I 型切口限制性内切酶 BsaI 或其同裂酶 Eco31I。由于该酶在其不对称识别位点之外产生黏性末端，因此黏性末端的碱基组成可自由选择，这构成了该系统模块化设计的基础。每一个通过 PCR 获得的元件（例如启动子序列、CDS 或终止子）首先被插入到具有匹配黏性末端的特定入门载体中，这些黏性末端由限制性酶切产生，从而形成一个模块。在完成亚克隆后，通常将六个匹配的模块用于 GreenGate 连接反应，最终在植物双元载体中组装成完整的构建体。
对于驱动系，将包含组织特异性启动子（pTS）的DNA序列、GR-LHG4转录因子、pOp6启动子以及与N端信号肽和C端内质网滞留信号融合的mTurquoise2报告基因的模块进行连接，同时包括终止子、多种适配模块以及用于转基因筛选的模块，具体构建方法如前所述<sup class=...

本文描述了一套转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）品系的构建与应用，该品系可在三种主要分生组织——茎尖分生组织、根尖分生组织和形成层中实现可诱导的、组织特异性的基因表达。

可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过LhGR介导的 转录-激活

可诱导的、组织特异性表达是研究基因扰动时空动态的重要而强大的工具。结合……

发育生物学的关键目标是理解基因在特定环境下的作用。而通过传统的基因敲除突变体或组成型过表达品系往往难以实现这一目标。我们利用模块化的Green Gate克隆系统，构建了一套可用于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）三种主要分生组织中可诱导的细胞特异性表达资源。采用相同的模块化克隆策略，该方法也可应用于其他难以进行转化的植物物种。本实验步骤的可视化演示具有重要价值，因为分析转激活作用在茎尖分生组织和顶端分生组织中的效应时，需要在成像前进行解剖操作，而这一过程可能极具挑战性。首先，按照文本方案中所述的方法对种子进行灭菌处理。接下来，配制pH为5.8的半倍浓度Murashige和Skoog培养基，并加入1%蔗糖和0.9%琼脂。高压灭菌后，将溶于DMSO的Dex加入诱导平板中，终浓度为10至30微摩尔。在对照平板中加入等量的DMSO。将用于根部成像的种子放置在培养皿中，并在4°C、黑暗条件下进行48小时的春化处理。将培养皿垂直放入植物培养箱中，培养5天。在萌发后第5天，采用共聚焦激光扫描显微镜对幼苗进行成像。首先，按照文字实验方案中所述的方法准备并培养种子。种子萌发后六至七天，将每株幼苗移栽至单独的花盆土壤中。若通过浇灌方式进行诱导，需使用水中含25 µM DEX的溶液，该溶液由溶于乙醇的25 mM DEX母液稀释而成。每两到三天浇水一次，直至诱导时间。若采用浸渍法诱导，准备一个一升烧杯，加入750毫升含有0.02% Silwet L77和终浓度为25微摩尔DEX的水溶液，或加入等量DMSO作为DEX处理和模拟处理对照。将单株植物浸入诱导溶液或模拟溶液中30秒。每两到三天重复一次，直至达到所需的成像时间。首先，按照文本方案中所述的方法准备并培养种子。种子萌发后六至七天，将每株幼苗移栽至单独的花盆土壤中。当茎长约达1厘米时，用10至50 µM的DEX水溶液喷洒具有荧光的SAM。若需在发育的后期阶段进行诱导和成像，可对具有较长茎或侧枝的SAM进行诱导。诱导后24至48小时，分离SAM并进行成像。首先，将幼苗从培养皿转移至含有10 µg/mL碘化丙啶的溶液中，染色5分钟。将根部放入显微镜成像室，使用共聚焦激光扫描显微镜配合63倍水浸物镜进行成像。为观察碘化丙啶荧光，采用488 nm的激发波长，并收集590至660 nm之间的发射光信号。对于 mTurquoise2 荧光，使用 458 纳米激发光，并通过顺序扫描收集 460 至 615 纳米之间的发射光。首先，用手指固定茎的对侧，使其稳定在目标切段位置。使用剃刀切取一段约三厘米的组织，并进行数次精细切割。将剃须刀片在含有自来水的培养皿中冲洗，并收集茎段。可对茎段进行染色，或直接将其置于显微镜载玻片上。若需染色，取一反应管，配制1毫升浓度为250微克/毫升的碘化丙啶溶液。用移液管从培养皿中移除自来水，加入碘化丙啶溶液，染色五分钟。随后移除碘化丙啶溶液，用水冲洗。使用精细镊子或细毛刷将染色后的切片转移至显微镜载玻片上。使用配备25倍水浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像。采用561纳米激光激发碘化丙啶荧光，并收集570至620纳米的发射光信号。采用405纳米激光激发驱动细胞系构建体编码的mTurquoise2荧光蛋白效应分子，并收集425至475纳米的发射光信号。首先，用镊子在茎尖下方两厘米处剪断茎。一手握住茎，用精细镊子去除花芽和较大的原基。为去除幼嫩的原基，将茎尖分生组织（SAM）固定在含有3%琼脂糖的培养皿中，保持直立位置。接下来，使用双目镜和镊子去除靠近茎尖分生组织（SAM）的幼嫩原基。将分离的 SAM 转移至含有 250 微克/毫升碘化丙啶溶液的离心管中。让样品染色 5 到 10 分钟，期间确保样品完全浸没在溶液中。将染色的 SAM 置于含有 3% 琼脂糖培养基的小型培养皿中，用双蒸水覆盖 SAM。使用配备 25 倍水浸式物镜的共聚焦激光扫描显微镜对分离的 SAM 进行成像。使用561纳米激光激发碘化丙啶荧光，并收集570至620纳米的发射光。使用405纳米激光激发mTurquoise2荧光蛋白，并收集425至475纳米的发射光。在Z方向上以0.5微米的步长采集跨度为50微米的图像序列。使用 DEX 诱导可导致根内皮层、韧皮部前体细胞和形成层，以及茎顶端分生组织中的干细胞特异性表达 mTurquoise2。为验证转激活效果，构建了一条编码次生细胞壁主转录因子 VND7 与 V16 激活域融合蛋白的效应子株系。分别用 15 微升 DEX 或 DMSO 单独处理五天后，制备茎切片以观察叶鞘起始部位的异位木质化现象。在诱导样品中，起始鞘细胞在碘化丙啶通道中显示出强烈的信号，部分细胞表现出木质部细胞壁典型的网状加厚结构。观看本视频后，您应清楚地了解如何在不同组织中诱导基因表达，以及如何为成像准备样品。通过该实验流程，已建立的驱动品系可与不同用户根据各自研究兴趣构建的多种效应子载体联合使用。该方法可帮助植物研究人员以节省时间的方式快速评估目标基因在特定细胞类型中表达或敲低的效果。这种细胞类型特异性的诱导系统需要使用皮质类固醇地塞米松。应避免直接接触，因此在处理过程中必须佩戴手套和口罩。

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科研

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Genetics

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