在自抗性混合奇美体模型中, 光激活询问个体自反应萌发中心

这种自发自反应细菌中心的生理相关嵌合模型允许将体内细胞定位与下游分子分析联系起来。自反应细菌中心的混合嵌合模型的主要优点是它的多功能性和边缘性，允许对几乎任何所需的细胞子集或分子通路进行询问。这种自身免疫性疾病发展模型的生理相关性使新的见解，可能有助于新疗法的进步。

这种骨髓嵌合模型可用于免疫学、免疫肿瘤学和干细胞研究。光激活组件具有广泛的用途，因为它将组织定位与下游细胞分析连接在一起。骨髓的准备和重组以及体内标记和组织外植步骤都是技术上复杂的程序，非常适合视觉演示。

要提取供体564Igi小鼠股骨和头骨，从一个后肢去除皮肤，并弹出膝盖和脚踝关节通过用力拉脚。继续打断脚踝关节。然后，将脚拉向身体，同时抓住头骨，从而从头骨中剥离肌腱和肌肉。

打破膝盖关节释放头骨，将骨骼拉向身体，同时抓住股骨，将肌腱和肌肉从股骨上剥离。然后，在臀部关节做一个切口，在将股骨从臀部插座中拉出之前，先切下肌腱。以类似方式去除反向后肢骨骼后，用粗纸巾小心地揉揉骨骼，取出剩余的肌肉和结缔组织，并在冰冷的骨髓缓冲液中冲洗剥离的骨骼。

然后，使用Dumont七号钳将骨骼转移到冰上新鲜骨髓缓冲液的容器中。要提取骨髓细胞，请用冰冷的骨髓缓冲液冲洗砂浆，并使用10毫升血清学移液器用10毫升的新鲜冰冷骨髓缓冲液代替洗涤缓冲液。使用钳子将骨骼转移到砂浆上，并使用刺粉碎和研磨骨骼以释放骨髓。

在通过 70 微米细胞过滤器将骨髓溶液传递到冰上 50 毫升锥形管之前，使用 10 毫升移液器收集骨髓提取物。然后，用另外10毫升的新鲜冰冷骨髓缓冲液冲洗砂浆，以确保细胞完全恢复。要准备供体悬浮液，请将适当体积的光活性 GFP 和 564Igi 供体骨髓混合在 50 毫升锥形管中，然后通过离心对细胞进行颗粒状。

将混合细胞颗粒以每毫升冰冷骨髓缓冲液的1倍10浓度重新填充至8个细胞，然后将细胞转移到冰面上预冷的1.5毫升微离心管中。接下来，确认麻醉CD45.1接受者小鼠对手足趾捏缺乏反应，轻拂供体骨髓细胞管，以确保充分再吸血。将 200 微升的骨髓混合成一个 0.3 毫升、30 量的胰岛素注射器，并在接受者侧侧轻轻伸展眼睛上方和下方的皮肤，稍微弹出眼睛。

小心地将注射器的尖端以大约 30 度角插入眼窝前部，注意避免眼睛和周围组织。当针头接触眼窝下划线的骨骼时，在使用稳定压力缓慢注射供体骨髓之前，缩回约0.5毫米的针头。然后，将鼠标返回其笼中，并服用抗生素水，进行监测，直到完全恢复。

为了给波光石淋巴结贴上标签，在18微升PBS中稀释两个标有植物红素的鼠抗小鼠CD169抗体微升，并在一块塑料石蜡膜上加入两个10微升的抗体液滴。用30分针将每个液滴装入一个0.3毫升胰岛素注射器，并注射10微升抗体到麻醉受援动物的脚垫中。在收获淋巴结之前，在平坦的表面上放置一个方形盖玻片，并使用真空润滑脂加载的五毫升注射器，用每个边缘约一到两毫米的润滑脂追踪盖玻片的边缘。

将腔室转移到冷、平坦的表面，用冰冷的骨髓缓冲液填充真空润滑脂室。要进入细胞淋巴结，使用直的细剪刀在安乐死动物的膝盖坑下方的皮肤做切口，并沿着腿筋线向上延伸，几乎到臀部关节。使用Dumont五号或七号钳子，将皮肤的每个外露皮瓣向外拉，以暴露罂粟花中的组织，并使用钳子小心地进入 fossa 只是中到流行静脉。

在使用拇指和食指将四头肌肌肉从前侧靠近到膝盖之前，打开并关闭沿腿部轴的钳子，以暴露潜在的流行淋巴结，将淋巴结从 fossa 中弹出。将钳子滑到淋巴结下方，将节点从周围组织中释放出来，并放在真空润滑脂室中。收集第二个淋巴结后，将第二个盖玻片放在真空润滑脂边缘上，然后轻轻按下以关闭腔室，小心挤出所有气泡。

要识别收获的脾脏组织样本中的胚芽中心，请将成像室放在双光子荧光显微镜的舞台上，并使用 3.5 毫升塑料转移移液器将一滴蒸馏水放在上盖玻片上。降低目标直到接触点，并使用透光聚焦在组织顶部。切换到暗模式和双光子激发，并调谐到 940 纳米的激光。

找到与组织表面附近的 CD169 染色接壤的个别白浆区域，并通过与中央动脉相关的第二次谐波生成识别边缘淋巴护套。在近间淋巴护套和边缘区域之间的区域中，识别是否存在高度自发光、活化的可激活体巨噬细胞，并使用这些地标，在单个细菌中心区域周围绘制一个感兴趣的区域。然后，在切换到 830 纳米的激发波长之前，从组织表面开始，使用约 3 微米的步长大小，然后设置大约 100 到 150 微米的 Z 堆栈。

关闭或调暗所有通道，以防止照片损坏探测器，并成像堆栈。然后，切换回 940 纳米的激发波长，然后重新打开通道，扫描堆栈以确认有效的照片激活和整个图像堆栈中无光损。混合骨髓嵌合体血清显示重组后六周B细胞数正常化，低频为9D11-阳性循环B细胞，该细胞来自564Igi隔间。

在总淋巴细胞门内，残余接受者衍生细胞的频率较低，其中约6%为CD45.1衍生细胞，表明B细胞室中几乎完全的切变程度和光活性GP骨髓衍生B细胞的主导性，这是564Igi衍生B细胞严重阴性选择的结果。如所观察到，带 CD169 的体内标记有助于对边缘区域进行可靠的可视化。第二次谐波信号在含胶原蛋白的结构元素和主要容器中是明显的，包括近动脉淋巴护套的中央动脉和高度自发光的、与细菌中心活动相关的可激活的可激活体巨噬细胞。

综合起来，这些数据允许识别可能包含单个光激活细菌中心的兴趣区域。下游流细胞测量评估进一步确认存在规范化的B细胞舱号、自发的生殖中心群体和光激活的生殖中心B细胞的子集。重要的是将外植、光激活和组织处理步骤的总周转时间限制在四到六个小时，以确保足够的细胞生存能力。

光激活细胞可以流动排序，并受单细胞测序，例如，描述单个细菌中心的B细胞受体序列。混合嵌合模型允许在一个新的深度探索自反应细菌中心生物学，例如，提供对表位传播过程如何展开的见解。请注意，双光子显微镜的光源是非常强大的脉冲 4 类激光器，可能会严重损坏眼睛。