Name: 在自抗性混合奇美体模型中, 光激活询问个体自反应萌发中心 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 了解光激活技术在自抗性混合骨髓嵌合体模型中的应用，用于研究小鼠自发自身免疫生发中心的细胞定位与分子机制。该方法为免疫学和自身免疫疾病治疗提供新见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SE Degn 是 Lundbeckfonden 会士和 Carlsberg 基金会杰出会士。本工作部分额外得到了 NNF 生物医学资助（SE Degn）的支持。

<ol><li>Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+World+Incidence+and+Prevalence+of+Autoimmune+Diseases+is+Increasing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Celiac+Disease%22%5BJournal%5D)">The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing.</a> International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+individual+cells+in+developing+organotypic+brain+slices+revealed+by+the+photoconvertable+protein+Kaede%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede.</a> Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%E2%80%9CKaede%E2%80%9D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+quantification+of+dendritic+cell+migration+and+antigen+trafficking+between+the+skin+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes.</a> Scientific Reports. 4, 6030(2014).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+single-molecule+photoswitching+in+the+GFP-like+fluorescent+protein+Dronpa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Degn, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Evolution+of+Autoreactive+Germinal+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers.</a> Cell. 170 (5), 913-926 (2017).</li>
<li>Berland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+7-dependent+loss+of+B+cell+tolerance+in+pathogenic+autoantibody+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice.</a> Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).</li>
<li>Chatterjee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C4+maintains+peripheral+B-cell+tolerance+in+a+myeloid+cell+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner.</a> European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).</li>
<li>Toubai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+GVHD+by+sex-mismatched+H-Y+antigens+in+the+absence+of+functional+radiosensitive+host+hematopoietic-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+germinal+centers+in+autoimmune+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice.</a> Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).</li>
<li>Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+through+mixed+chimerism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance through mixed chimerism.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前已建立大量小鼠自身免疫疾病模型，其中许多模型会自发形成生发中心16。然而，现有许多模型具有复杂的遗传背景，或存在淋巴细胞增殖或活化关键调控因子的突变，因而难以与报告基因小鼠品系进行杂交，也不适合用于研究自身免疫状态下正常淋巴细胞的行为。相比之下，本模型可“即插即用”地深入分析源自野生型的自身反应性生发中心B细胞，可灵活结合任何所需的转基因、基因敲除和报告基因系统，本文中以光激活型GFP为例。通过体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并利用双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。随后，可对来自单个生发中心的光激活淋巴细胞进行流式细胞术分析或分选，既可作为单细胞，也可进行群体分析。这些细胞可进一步开展分子和功能层面的下游实验，为自身免疫研究领域提供新的见解。
该实验操作的成功实施包含若干关键步骤。如代表性结果所示，通过照射（1,100 Rad）及供体骨髓重建，可有效替换受体的骨髓成分，从而在B细胞区室中实现接近完全的嵌合状态。这一点至关重要，因为残留的受体来源B细胞将导致生发中心群体中的一部分细胞呈现“暗区”特征。无论采用何种照射源，均需优化照射剂量和时间，以在对动物造成最小附带组织损伤的前提下，达到最大程度的骨髓清除效果。在重建过程中，采用骨粉碎法并移植总计2000万供体细胞，已被证实可稳定获得较高的重建效率。骨髓提取过程中保持无菌和低温（冰上操作），有助于维持供体骨髓细胞的高存活率。为获得目标供体骨髓比例，在对细胞进行分装计数时必须格外谨慎，包括计数操作本身以及取样用于计数的骨髓细胞亚群。将不同供体骨髓混合后共同离心沉淀，而非分别离心重悬后再混合，有助于防止细胞计数后供体比例发生偏移。
本方案中的混合骨髓嵌合体构建方法可独立使用，能够生成携带任何所需报告基因、转基因或基因敲除的自身反应性生发中心嵌合体。然而，该方法的一个局限性在于必须使用组织相容性匹配的供体。564Igi 小鼠品系处于 C57Bl/6J 近交系遗传背景上，因此其他供体和受体应具有 H-2b 近交系背景（或者 alternatively，可将 564Igi 品系回交至目标品系，并在新的遗传背景下验证其自身免疫表型）。辐射处理过程倾向于形成耐受性免疫环境17，某些次要组织相容性抗原的不匹配可能被耐受。然而，这一因素应充分考虑，尤其是在混合使用雄性和雌性供体和/或受体时，因为雌性可能对雄性限制性 Y 抗原产生免疫反应。
类似地，该实验方案中的光激活部分也可独立使用，并适用于多种不同场景。然而，目前PA-GFP报告基因仅与UBC启动子联用，该启动子在所有造血系细胞中具有活性，但在基质细胞中无活性。如引言部分所述，其他可光激活、可光转换或可光转化的报告基因品系也已存在，可根据实验条件的适当调整，替代PA-GFP使用。
在成像过程中，应确保激光波长远高于900 nm，以避免非目标区域的意外光激活，因为该波长不会激发PA-GFP。对于光激活本身，具体的参数设置（如激光功率和像素驻留时间）将取决于组织深度、所用的具体组织类型以及成像系统，每种应用都必须针对所使用的特定成像系统进行优化。操作时应注意避免对细胞造成光损伤，但同时必须确保在整个成像层中实现高效的光激活，以便为后续分析提供足够数量的已激活细胞。生发中心B细胞通常占脾脏或皮肤淋巴结B细胞总数的0.5%至约2%，从代表性结果（图5）可以看出，被光激活的单个生发中心B细胞可能占单个脾组织切片中总B细胞群体的约1%。因此，若要成功分析或分选大量细胞，需要处理大量的事件样本。

过去几十年中，自身免疫性疾病的发病率迅速上升，尤其是在西方社会。如今，自身免疫性疾病在西方世界最常见致病和致死原因中位列第三1。关于自身免疫性疾病的发生与发展，许多基本问题仍未得到解答。要深入理解疾病的潜在机制和细胞动态，一个关键要求是将细胞亚群的微解剖学定位与下游的分子或功能分析精确关联起来。在过去十年中，一系列稳定的光转化、光激活或光切换生物荧光探针被开发出来，并被整合到报告基因小鼠品系中，从而实现了在小鼠模型中对特定细胞亚群进行精确的微解剖学标记与追踪。
Kaede 是一种来源于石珊瑚的光转化荧光蛋白，在暴露于紫光或紫外光后，会不可逆地从绿色荧光转变为红色荧光2。最初被用于追踪发育中器官型脑切片中单个细胞的动态行为3，随后构建的Kaede基因敲入小鼠使得在活体内监测细胞运动成为可能，该系统已被应用于分析免疫细胞向淋巴结的迁移及其离开过程4。此后，该方法通过第二代报告系统得到了进一步优化5。另一种类似的报告蛋白是Dendra6，最近已被用于在活体内追踪淋巴结转移7。
首个开发出的光激活蛋白是一种经过单点突变（T203H）改造的绿色荧光蛋白（GFP），其在450至550 nm波长范围内的吸收能力极低8。经紫光照射激活后，该光激活绿色荧光蛋白（PA-GFP）的吸收峰从约400 nm转变为约500 nm，在488 nm波长激发下荧光强度提升约100倍。通过构建所有造血细胞均表达PA-GFP的转基因小鼠，首次实现了对生发中心解剖结构明确的明区与暗区中B细胞筛选过程的深入分析9。
光激活是从非荧光状态不可逆地转变为荧光状态的过程，而光转化则是从一种波长向另一种波长的单向转变。&#160; 光控开关蛋白能够在两种条件下穿梭10这一能力最近被用于实现对蛋白质活性的光学调控11.
利用PA-GFP报告基因，我们最近在一种新型的自发性狼疮样自身免疫模型中表征了单个生发中心的B细胞受体库12。该模型基于混合嵌合体，其中1份骨髓携带针对核糖核蛋白复合物具有特异性的自身反应性B细胞受体基因敲入（564Igi13,14），另与2份来自任意所需供体的骨髓混合。在重建后约6周，机体达到稳态，此时脾脏和皮肤淋巴结中出现自发性自身反应性生发中心。值得注意的是，生发中心B细胞群体几乎完全（约95%）由非564Igi来源的细胞组成，而这些野生型来源的B细胞已转变为自身反应性。因此，该模型允许采用“即插即用”方式，结合各种转基因、基因敲除和报告系统，对自身反应性生发中心B细胞进行分析。本文中，我们描述了构建携带PA-GFP报告基因的混合嵌合体并诱导其形成自发性自身反应性生发中心的实验流程。通过体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并使用双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。来自单个生发中心的光激活淋巴细胞可进一步通过流式细胞术进行分析，或通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分选，继而开展后续分子和功能分析。对单个生发中心来源的自身反应性淋巴细胞进行分析的能力，可直接应用于自身免疫疾病领域的深入研究，同时本文所述技术与方法也可拓展至感染性疾病和肿瘤转移研究的相关领域。

<table><tbody><tr><td>抗体，9D11-A568</td><td>本实验室制备</td><td></td><td>9D11 杂交瘤细胞系，由 MC Carroll 惠赠，使用 Biotium 92255 试剂盒标记</td></tr><tr><td>抗体，9D11-A647</td><td>本实验室制备</td><td></td><td>9D11 杂交瘤细胞系，由 MC Carroll 惠赠，使用 Nordic Biosite ABD-1031 试剂盒标记</td></tr><tr><td>抗体，FITC 标记抗小鼠 CD45.1</td><td>Biolegend</td><td>110705</td><td></td></tr><tr><td>抗体，Pacific Blue 标记抗小鼠/人 GL7 抗原（T 和 B 细胞活化标志物）</td><td>Biolegend</td><td>144613</td><td></td></tr><tr><td>抗体，PE 标记抗小鼠 CD169（Siglec-1）</td><td>Biolegend</td><td>102703</td><td></td></tr><tr><td>抗体，PE/Cy7 标记抗小鼠 CD38</td><td>Biolegend</td><td>102717</td><td></td></tr><tr><td>抗体，PerCP/Cy5.5 标记抗小鼠/人 CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103235</td><td></td></tr><tr><td>毛细管，Mylar 包裹，肝素化</td><td>Fisher Scientific</td><td>211766</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，70 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>锥形管，50 mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，方形，22×22 mm，厚度 0.13–0.17 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，70%</td><td>VWR</td><td>8301.360</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪，FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪，LSRFortessa SORP</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td>特殊订制产品，配备 4 个激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm）</td></tr><tr><td>润滑脂，高真空级，Dow Corning</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板，Burker-T&amp;uuml;k</td><td>VWR</td><td>630-1544</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，IsoFlo vet.</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液（Lympholyte-M 细胞分离介质）</td><td>Cedarlane</td><td>CL5035</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL（Eppendorf）</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.550</td><td></td></tr><tr><td>显微镜，双光子</td><td>Prairie Technologies（现为 Bruker）</td><td>-</td><td>特殊订制 Ultima In Vivo 双光子显微镜</td></tr><tr><td>研钵，带嘴，未上釉，75 ml</td><td>VWR</td><td>410-0110</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1063290500</td><td></td></tr><tr><td>针头，18 号</td><td>BD Medical</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>VWR</td><td>87,769,290</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>d8537</td><td></td></tr><tr><td>研杵式匀浆器</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td></td></tr><tr><td>研杵，未上釉，175 mm</td><td>VWR</td><td>410-0122</td><td></td></tr><tr><td>移液管，刻度，10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>移液器，塑料转移头</td><td>Sarstedt</td><td>861,172,001</td><td></td></tr><tr><td>塑料石蜡膜（Parafilm M）</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>板，96 孔</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>手术镊，Student Dumont #5 镊子</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>手术镊，Student Dumont #7 镊子</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>手术剪，Student 细剪，直型</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>注射器，10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES1</td><td></td></tr><tr><td>注射器，20 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES1</td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05S1</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器，0.3 cc</td><td>BD Medical</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Tribrissen vet. 24% 注射液，每毫升含 200 mg 磺胺嘧啶和 40 mg 甲氧苄啶</td><td>MSD Animal Health</td><td>431577</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>VWR</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>活率染料，eBioscience 可固定活率染料 eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr></tbody></table>

通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

自身免疫性疾病带来了重大的健康负担。关于自身免疫性疾病的发病机制与进展过程，仍有许多基本问题尚未解答。要深入理解疾病背后的机制和细胞动态，一个关键需求是能够将特定细胞亚群的微解剖定位与后续的分子或功能分析精确关联起来；而这一目标在传统上难以实现。近年来，稳定的光激活生物荧光探针的开发及其在报告基因小鼠品系中的应用，使得在小鼠模型中对特定细胞亚群进行精确的微解剖标记与追踪成为可能。本文中，我们以一种新型嵌合型自身免疫模型与光激活报告系统相结合为例，阐述如何通过分析单个生发中心来源的自身反应性淋巴细胞，为自身免疫研究提供新的见解。我们展示了一种构建混合嵌合小鼠的方法，这些小鼠可自发形成由携带光激活绿色荧光蛋白报告基因的淋巴细胞组成的生发中心。利用体内标记策略，可在离体淋巴组织中可视化单个生发中心，并通过双光子显微镜对其中的细胞成分进行光激活。来自单个生发中心的光激活淋巴细胞随后可被流式细胞术分析或分选，既可作为单细胞，也可批量处理，并可用于进一步的分子与功能分析。该方法可直接应用于自身免疫研究领域，为该领域带来新的认识；同时，骨髓嵌合小鼠的构建方法以及光激活操作流程也可广泛应用于感染性疾病和肿瘤转移等研究领域。

混合骨髓嵌合体的制备
本方案可稳定地获得混合骨髓嵌合小鼠，B细胞区室的嵌合程度接近完全，代表性结果如图1所示（统计学显著性请参见12）。血清分型显示，重建6周后B细胞数量恢复正常（图1A），来源于564Igi区室的循环B细胞中，9D11（独特型）阳性细胞频率较低（图1B）。在总淋巴细胞门控范围内，残留的受体来源细胞频率较低，约为6% CD45.1（Q1），表明整体嵌合程度约为94%（图1C）。在供体区室（CD45.1-，Q4+Q3）中，564Igi（Q4）与PA-GFP（Q3）的比例约为23%比77%。该比例略低于输入时的33%比66%，原因在于来源于564Igi区室的B细胞经历了强烈的阴性选择12。如图1D所示，B细胞区室几乎完全嵌合（99.9% CD45.1-），且以PA-GFP骨髓来源的B细胞（Q3）为主，这是由于564Igi来源的B细胞受到强烈阴性选择所致。
组织的收获、处理及流式细胞术分析
图2 和 图3 展示了新鲜分离的淋巴结和脾脏切片的离体操作流程及结果。图4 展示了在离体脾切片中对单个生发中心区域进行活体标记和光激活的代表性结果。如图所示（图4A），使用 CD169-PE 进行的活体标记有效地标记了边缘区（红色，标示为“MZ”）。二次谐波信号出现在含胶原的结构成分和主要血管（蓝色）中，包括动脉周围淋巴鞘（PALS）的中央小动脉。具有强自发荧光的活化吞噬细胞样巨噬细胞与生发中心活动相关（箭头所示）。综上所述，通过识别边缘区、PALS 和吞噬细胞样巨噬细胞，可确定一个可能包含单个生发中心的兴趣区域。该兴趣区域的光激活过程如 图4B 所示。结果表明，光激活在微解剖学上具有高度精确性9，可产生明确的激活区域。所展示的结果还进一步证实了在重建的嵌合体中存在高密度的 PA-GFP+ 淋巴细胞以及自发形成的生发中心。后续流式细胞术分析进一步验证了B细胞区室数量的正常化（图5D）、自发生发中心细胞群的存在（图5E），以及存在已被光激活的生发中心B细胞亚群（图5F）。
因此，本方案提供了一种稳健的方法，用于制备含有自发性自身反应性生发中心的混合骨髓嵌合体，其中生发中心主要由携带光激活报告基因的野生型来源B细胞构成。这继而允许对单个生发中心进行后续分析（图示概览见 图6).
<img alt="流式细胞术分析，点图，细胞标记物，荧光，FSC-H，B220-PerCP-Cy5.5，CD45.1-FITC。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 致死剂量照射的CD45.1受体小鼠（CD45.1+，PA-GFP−）在接受564Igi（CD45.1−，PA-GFP−）:PA-GFP（CD45.1−，PA-GFP+）混合嵌合体移植后6周，外周血嵌合程度的流式细胞术分析。 A) 对单个淋巴细胞进行预设门控后，显示B220+ B细胞的设门图。 B) 来自图A的子门控图，显示B细胞群体中9D11+（独特型）的比例。 C) 对单个淋巴细胞进行预设门控后，PA-GFP与CD45.1的散点图。 D) 来自图A中B细胞子门的PA-GFP与CD45.1散点图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="啮齿类动物耳部注射及组织提取操作；包含结果的连续特写图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2： 用于成像和光激活的腘淋巴结采集与安装操作流程。 A) 在膝关节下方做切口，并向上延伸至髋关节，将切口边缘向两侧拉开，以暴露腘窝（箭头所示）。 B) 打开覆盖的脂肪垫，暴露腘淋巴结（箭头所示）。 C) 从窝内取出腘淋巴结。 D) 对对侧重复该操作，并将两个淋巴结置于双面盖玻片/真空润滑脂腔室中，腔室内充满 BM 缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织提取；实验设置、解剖结果、潜在肿瘤分析、显微镜研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：用于成像和光激活的脾脏采集与安装操作流程。A) 在肋骨下方的前正中线处做一开口，并沿身体延伸至后腋线，牵开切口边缘以暴露脾脏尖端（箭头所示）。B) 牵出脾脏并将其切除，切成薄片（1–2 mm），然后置于双面盖玻片/真空油脂腔室内，腔室内已加入 BM 缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像：生发中心分析，淋巴组织，放大后的细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4： 光激活。A) 脾脏中生发中心在光激活前的双光子显微图像。在脾脏收获前，通过体内标记抗CD169-PE对边缘区进行染色（红色，以“MZ”标示）。含有胶原的结构（与被膜和主要血管相关）显示出明显的二次谐波信号（蓝色）。箭头标示出具有高度自发荧光的、与生发中心活动相关的吞噬细胞碎片巨噬细胞。成像使用940 nm激发光进行。左上角的比例尺表示200 µm。B) 与A相同，但在830 nm下进行光激活后。现在可在由边缘区界定并包含先前所识别的吞噬细胞碎片巨噬细胞的兴趣区域内观察到光激活的细胞（绿色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析示意图；识别淋巴细胞、单细胞、活细胞、B220+、生发中心B细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5： 光激活生发中心B细胞的流式细胞术分析。 A) 淋巴细胞门的前向散射与侧向散射图。 B) 在淋巴细胞门内，前向散射面积相对于前向散射高度的图，以及由此确定的单细胞门。 C) 在单细胞门内基于活力染料排除法的图，以及由此确定的活细胞门。 D) B220+ B细胞的设门。 E) 生发中心B细胞的设门，定义为B220+门内CD38lo GL7hi的细胞。 F) 在生发中心B细胞群体中光激活细胞的设门，定义为共表达非激活态与光激活态PA-GFP的细胞亚群。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="骨髓嵌合过程；包含流式细胞术、血清分型、光转化、成像结果的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：实验方案的图形化概述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了生成具有自发性自身免疫生发中心的混合型小鼠骨髓嵌合体的方法，其中自身反应性淋巴细胞携带一种光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）报告基因。该系统能够将组织中细胞的定位与后续的分子及功能分析相联系。

自身免疫性疾病带来了重大的健康负担。关于自身免疫性疾病的发病机制与进展过程，仍存在诸多尚未解决的基本科学问题……

这种具有生理相关性的自发自身反应性生发中心嵌合模型，能够将体内细胞定位与下游分子分析相联系。该自身反应性生发中心混合嵌合模型的主要优势在于其多功能性和边缘特性，可用来研究几乎所有期望的细胞亚群或分子通路。此自身免疫性疾病发展模型具备的生理相关性，有助于获得新的认识，可能推动新型疗法的开发。这种骨髓嵌合体模型可用于免疫学、免疫肿瘤学和干细胞研究。光激活组分具有广泛的应用性，因为它将组织定位与下游细胞分析联系起来。骨髓制备与重建、体内标记以及组织外植等步骤均为技术上较为复杂的操作，非常适合通过可视化演示进行展示。为了提取供体564Igi小鼠的股骨和胫骨，先去除一条后肢的皮肤，用力拉脚使膝关节和踝关节脱位。接着，折断踝关节。然后，在固定胫骨的同时将脚向身体方向拉动，从而剥离附着在胫骨上的肌腱和肌肉。折断膝关节以分离胫骨，同时握住股骨将骨向身体方向拉动，以剥离股骨上的肌腱和肌肉。随后，在髋关节处做一切口，切断肌腱后将股骨从髋臼中抽出。以类似方式去除对侧后肢骨骼后，用粗糙的纸巾轻轻擦拭骨骼，以去除残留的肌肉和结缔组织，并将剥离干净的骨骼用预冷的骨髓缓冲液冲洗。然后，使用Dumont 7号镊子将骨骼转移至盛有预冷骨髓缓冲液的容器中，置于冰上。为提取骨髓细胞，先用冰冻的骨髓缓冲液冲洗研钵，再用10毫升血清移液管将冲洗液替换为10毫升新鲜的冰冻骨髓缓冲液。用镊子将骨骼转移至研钵中，用研杵碾压并研磨骨骼，以释放骨髓细胞。使用10毫升移液管收集骨髓提取物，然后将骨髓溶液通过70微米细胞滤筛，滤入置于冰上的50毫升锥形管中。随后，用额外10毫升新鲜的冰冻骨髓缓冲液冲洗研钵，以确保细胞的完全回收。为制备供体悬液，将适量的光激活型GFP和564Igi供体骨髓混合于50毫升锥形管中，并通过离心沉淀细胞。将混合的细胞沉淀重悬于冰上预冷的骨髓缓冲液中，浓度为每毫升含一乘以十的八次方个细胞，并将细胞转移至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。接着，确认麻醉后的CD45.1受体小鼠对脚趾夹捏无反应，并轻轻弹击供体骨髓细胞管，以确保细胞充分重悬。将200微升骨髓混合液吸入一支0.3毫升、30号针头的胰岛素注射器中，将受体小鼠侧放，轻柔地拉伸眼周上下方的皮肤，使眼球轻微突出。将注射器针尖以约30度角小心插入眼眶前部，注意避开眼球及周围组织。当针尖触及眼眶下方的骨骼时，先将针头回撤约0.5毫米，然后施加稳定压力，缓慢注入供体骨髓。随后，将小鼠放回笼中，自由饮用含抗生素的水，并持续监测直至完全恢复。为了标记腘窝淋巴结，将2微升藻红蛋白标记的抗小鼠CD169大鼠抗体加入18微升磷酸盐缓冲液中稀释，然后将10微升抗体溶液滴加两滴于一片塑料石蜡膜上。用一支0.3毫升胰岛素注射器（带30号针头）吸取每滴抗体溶液，向麻醉后的受体动物足垫内注射10微升抗体。在采集淋巴结前，将一方形盖玻片置于平坦表面，并用装有真空脂的5毫升注射器沿盖玻片边缘涂抹一圈油脂，距离各边缘约1至2毫米。将腔室转移至冰冷的平坦表面，并用冰冻的骨髓缓冲液填充真空润滑脂腔室。为了获取腘淋巴结，使用直的精细剪刀在已处死受体动物膝窝下方的皮肤处做一切口，并沿腿后肌线向上延伸切口，直至接近髋关节。使用Dumont 5号或7号镊子将暴露的皮肤瓣向外牵拉，以显露腘窝区域的组织，并用镊子小心地从腘静脉内侧进入腘窝。沿腿部轴线开合镊子，暴露其下方的腘窝淋巴结，然后用拇指和食指从膝关节前方近端捏住股四头肌，使淋巴结从窝中弹出。将镊子滑至淋巴结下方，将其从周围组织中分离，并放入真空油脂腔内。收集第二个淋巴结后，将第二张盖玻片置于真空油脂环上，轻轻按压以闭合腔室，注意挤出所有气泡。为了鉴定收获的脾组织样本中的生发中心，将成像腔室置于双光子荧光显微镜的载物台上，并使用3.5毫升塑料移液管在上层盖玻片表面滴加一滴蒸馏水。降低物镜直至接触点，利用透射光对准组织表面进行聚焦。切换至暗场模式并启用双光子激发，将激光调谐至940纳米。在组织表面附近，找到由 CD169 染色界定的独立白髓区域，并通过与中央小动脉相关的二次谐波信号识别动脉周围淋巴鞘。在动脉周围淋巴鞘与边缘区之间的区域，识别出具有强自发荧光的活化吞噬细胞样巨噬细胞的存在，并利用这些解剖标志，在单个生发中心区域周围绘制一个感兴趣区域。随后，从组织表面开始，设置深度约为 100 至 150 微米的 Z 轴层扫，步长约为 3 微米，然后切换至 830 纳米的激发波长。关闭或调暗所有通道以防止探测器受到光损伤，并对图像层进行成像。随后切换回 940 纳米的激发波长，重新打开通道，扫描整个图像层以确认光激活效率良好，并确保在整个图像层中无光损伤现象。混合骨髓嵌合体的血清型分析显示，在重建后六周 B 细胞数量恢复正常，其中来自 564Igi 区室的 9D11 阳性循环 B 细胞频率较低。在全部淋巴细胞门控范围内，残留的受体来源细胞频率较低，其中约6%为CD45.1来源，表明总体嵌合程度约为94%。B细胞区室几乎完全嵌合，并以光激活型GFP骨髓来源的B细胞为主，这是由于564Igi来源的B细胞经历了强烈的阴性选择所致。如观察所示，使用CD169进行体内标记可有效可视化边缘区。二次谐波信号出现在含胶原的结构成分和主要血管中，包括动脉周围淋巴鞘的中央小动脉，以及与生发中心活动相关的具有强自发荧光的活化吞噬性巨噬细胞。综上所述，这些数据可用于确定一个可能包含单个光激活生发中心的兴趣区域。后续的流式细胞术分析进一步证实了归一化的B细胞区室数量、自发形成的生发中心细胞群，以及一部分被光激活的生发中心B细胞的存在。为确保足够的细胞活力，必须将组织取出、光激活及组织处理等步骤的总周转时间控制在4至6小时之内。光激活的细胞可通过流式分选并进行单细胞测序，例如用于表征单个生发中心的B细胞受体库。混合嵌合体模型使得对自身反应性生发中心生物学的研究达到了新的深度，例如揭示了表位扩散过程的展开机制。需要注意的是，双光子显微镜所用的光源为高功率脉冲四类激光器，可能对眼睛造成严重损伤。

interrogating-individual-autoreactive-germinal-centers

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在自抗性混合奇美体模型中, 光激活询问个体自反应萌发中心

在本研究描述的动物模型中，将针对Ⅶ型胶原蛋白一段200个氨基酸（aa...

粒细胞依赖性自身抗体诱导的皮肤水疱形成

本视频展示了一种通过观察混合T细胞群体与携带同种异体抗原的树突状细胞相互作用（导致免疫突触形成）来评估T细胞同种反应性的方法。利用差异染色，并通过流式细胞术对含有免疫突触的双细胞聚集体进行定量分析，可揭示T细胞的同种反应性。...

在混合T细胞群体中测量异体反应性

通过空间调制多焦点双光子显微镜的激发模式，可在成年小鼠淋巴结中实现高达120 µm深度的高分辨率活体成像，并增强对比度。在100 µm深度处，测得的分辨率为487 nm（横向）和551...

高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。...

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8...

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。...

活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

了解光激活技术在自抗性混合骨髓嵌合体模型中的应用，用于研究小鼠自发自身免疫生发中心的细胞定位与分子机制。该方法为免疫学和自身免疫疾病治疗提供新见解。

通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

探索更多视频