利用邻近结扎测定法在人类胰腺β细胞中原位内源性米托巴结物的可视化

该协议使我们能够监测人体组织中（如β细胞）的内源性食细胞复合物，促进关键转化相关组织中的线噬细胞研究。这种技术的一个优点是它能够可视化体内重要的食细胞复合物，在组织中具有罕见的可用性或小样本数。按照标准协议进行隔离后，在10毫升完整胰岛培养基中培养4至6倍10至第三个人类小岛，在37摄氏度下至少一天。

第二天，使用三倍放大的解剖光显微镜来计算文化中的单个人类小岛。每次治疗或感兴趣的情况选择40个小岛，放入1.5毫升的小岛介质管中。通过离心沉淀小岛，将颗粒重新悬浮在PBS的一毫升中，并辅以50微摩尔PR619。

反转管子，通过离心收集小岛，在新鲜的PBS加脱比酶抑制剂中进行第二次洗涤。第二次离心后，用125微升0.25%的三普辛加抑制剂将小岛分离成单细胞，在37摄氏度下进行三分钟，定期温和移液。在孵化结束时，用一毫升37摄氏度加热胰岛介质辅以PR619来阻止反应。

通过离心收集小岛，在新鲜 PBS 中洗两次，每次洗涤使用抑制剂。第二次洗涤后，在150微升新鲜PBS加抑制剂中重新暂停分离的小岛。对于单个小岛粘附和固定，细胞将细胞溶液固定到带磨砂的显微镜幻灯片上，并用疏水笔勾勒出细胞区域。

然后在室温下用4%甲醛和PBS将包围的细胞固定15分钟。对于小岛样品的免疫组织化学分析，在室温下用两次五分钟在PBS中清洗细胞，然后用10%驴血清和PBS加0.3%洗涤剂洗涤细胞，在室温下洗涤一小时。在阻断孵育结束时，用原发性小鼠抗体对泛素特异性肽酶8、原发性兔子抗体对neuregulin受体降解蛋白-1进行结合，并结合小鼠或兔子中未培养的β细胞识别标记，以便不干扰在4摄氏度过夜的接近结扎检测信号。

第二天早上，用两个五分钟的PBS洗涤样品在摇杆上。将抗山羊Cy5二级抗体加入新准备的接近结扎测定溶液。第二次洗涤后，用20微升探针溶液给每个小岛样品贴上标签，用塑料薄膜回收幻灯片，在37摄氏度下孵育一小时。

在孵育结束时，在摇杆上用两个五分钟的缓冲器A洗涤细胞，然后用20微升新鲜准备的结扎溶液进行孵育，每幻灯片每微升连接0.25个单位，在37摄氏度下孵育30分钟。在结扎结束时，用缓冲器 A 清洗细胞两次，每次洗涤两分钟。用 20 微升的扩增溶液覆盖每个样品，并辅以聚合酶，在 37 摄氏度下进行 100 到 120 分钟的孵育。

要准备细胞进行成像，在摇杆上每次清洗时在新鲜缓冲液 A 中清洗两次样品 10 分钟，然后用 0.1 倍缓冲液 B 清洗一次，在摇杆上清洗两分钟。最后一次洗涤后，用一滴含有DAPI的安装介质安装幻灯片，并使用手术刀在每个样品上小心地放置盖玻片，以压出任何气泡。然后密封盖玻片，边缘周围有清晰的指甲油。

要对样品进行成像，请将幻灯片放在能够捕获多个焦平面的显微镜的舞台上，然后选择 100 倍放大倍率。将 Z 堆栈高度设置为大约 0.45 微米，并设置适当的污渍、反染色和活细胞信号激发和发射参数。获取至少九个不同的焦平面图像。

为确保荧光图像背景信号和杂散光最小化，使用选择的标准图像处理软件使用二维反卷积近邻算法处理图像。要量化接近结扎测定相互作用，请打开 ImageJ 并打开接近结扎测定图像。从第一张大幅对焦图像开始，单击"图像"并选择"调整"和"阈值"。

调整阈值以删除所有非特定接近结扎分析信号，并记下阈值调整，以尝试在整个分析过程中保持信号一致。单击"进程"并选择二进制和"二进制"。确认"大小"设置为"大小"设置为无穷大，"循环"设置为零到 1，"显示"设置为"轮廓"并选中"显示结果"和"清除结果"框。

请注意在电子表格中分析的表示样本和 Z 堆栈位置的粒子数。然后单击"分析和分析粒子"以测量粒子。分析样本的所有对焦 Z 堆栈后，发送电子表格中样本的粒子总数以量化交互总数。

近位测定中使用的抗体是配体特异性的，不表现出任何重叠。正如所观察到的，分散协议在显微镜视野中获取单个细胞进行下游分析是高效的，在原人类小岛接近结扎测定染色后保留β细胞染色。利用所展示的技术，可以确定，在48小时接触棕榈酸盐后，神经素受体降解蛋白-1和泛素特异性肽酶8的相互作用减少，突出了这种测定的可行性，用于评估糖尿病刺激后的关键内源性三叶草因子。

人类小岛高效而温和的分散对于确保下游正确细胞群的定量至关重要。PLA 允许评估人类胰岛样本中的重要线粒体复合物，从而能够分析线粒体和具有生物学重要性人类患者样本，从而推动糖尿病研究领域向前发展。