Name: 溶剂清除脑组织狂犬病病毒感染的高分辨率3D成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解免疫染色兼容的组织透明化技术，用于高分辨率三维可视化狂犬病病毒感染小鼠脑组织。该方法结合共聚焦激光扫描显微镜，实现深层组织成像与单细胞水平分析。

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作者感谢 Thomas C. Mettenleiter 和 Verena te Kamp 对手稿的审阅。本工作由梅克伦堡-前波美拉尼亚州联邦卓越计划与欧洲社会基金（ESF）资助（项目编号：KoInfekt，ESF/14-BM-A55-0002/16），以及弗里德里希-勒弗勒研究所内部合作研究基金关于丽沙病毒的资助（Ri-0372）。

使用了感染RABV且经PFA固定的存档脑组织材料。相关动物实验研究已由梅克伦堡-前波美拉尼亚州农业、食品安全与渔业局（LALFF M-V）所属的动物护理、使用及伦理委员会评估，并获得许可编号7221.3-2.1-002/11（小鼠）和7221.3-1-068/16（雪貂）的批准。动物实验中的常规护理和所用方法均依照批准的指南进行。
警告：本实验方案使用多种有毒和/或有害物质，包括多聚甲醛（PFA）、甲醇（MeOH）、过氧化氢（H2O2）、叠氮化钠（NaN3）、TBA、BA、BB 和 DPE。MeOH 和 TBA 高度易燃。为避免接触，应穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），并在通风橱内进行实验操作。废弃物应分别收集于适当的容器中，并根据当地法规进行处理。狂犬病毒被归类为生物安全等级（BSL）-2 病原体，因此通常可在 BSL-2 条件下操作。某些活动，包括可能产生气溶胶的操作、高病毒浓度的操作或涉及新型丽沙病毒的操作，可能需要 BSL-3 等级。建议高风险人员（包括动物饲养员和实验室工作人员）进行暴露前预防接种18,19。请参照当地主管部门的规定。
1. 脑组织固定与切片
<ol>
	<li>将脑组织样本置于适量的4%多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液PBS [pH 7.4]中）固定液中，在4 °C条件下固定至少48小时（组织与固定液体积比约为1:10 [v/v]）。</li>
	<li>用PBS清洗组织样本3次，每次至少30分钟，随后将样本保存于含0.02% NaN3的PBS溶液中，4 °C保存备用。</li>
	<li>使用振动切片机将组织切成厚度为1 mm的切片（刀片进给速率：0.3–0.5 mm/s，振幅：1 mm，切片厚度：1,000 µm）。</li>
	<li>为保持切片顺序的准确性，将每一片组织单独存放于多孔细胞培养板的孔中，加入含0.02% NaN3的PBS溶液，4 °C保存备用。</li>
</ol>
2. 甲醇样品预处理
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。需避免样品暴露于光照下。样品预处理的主要目的是通过甲醇（MeOH）处理改善抗体渗透性，并通过过氧化氢（H2O2）处理降低组织自发荧光14。
<ol>
	<li>配制20% (v/v)、40%、60% 和 80% 的甲醇（MeOH）水溶液。例如，配制20% MeOH溶液时，将10 mL 100% MeOH加入40 mL蒸馏水中，置于合适的可密封容器中，通过倒置混匀。</li>
	<li>将样品转移至大小合适的容器中（例如5 mL反应管）。注意选择对本实验所用试剂具有化学耐受性的材料。例如，聚丙烯适用，而聚苯乙烯不适用。 
	注意：本实验方案中的体积参数均基于5 mL反应管。若使用其他容器，请相应调整体积。</li>
	<li>将样品依次用已配制的系列浓度MeOH溶液（从低到高）各4 mL孵育，每种浓度孵育1小时。</li>
	<li>将样品用纯（100%）MeOH孵育2次，每次1小时。</li>
	<li>将样品冷却至4 °C（例如，置于实验室安全冰箱中）。</li>
	<li>配制漂白液（5% H2O2 甲醇溶液），例如将30% H2O2 储存液按1:6比例用纯（100%）MeOH稀释，并在4 °C预冷。</li>
	<li>从冷藏的样品中移除100% MeOH，加入4 mL预冷的漂白液（5% H2O2 甲醇溶液），在4 °C孵育过夜。</li>
	<li>将漂白液替换为4 mL 80% MeOH，孵育1小时。随后继续使用已配制的系列MeOH溶液，按浓度从高到低依次孵育各1小时，直至样品在4 mL 20% MeOH中孵育1小时。</li>
	<li>用4 mL PBS洗涤样品1次，每次1小时。</li>
</ol>
3. 免疫染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。为防止微生物生长，向本部分溶液中加入 NaN3，终浓度为 0.02%。组织样品通过非离子型去污剂 Triton X-100 和 Tween 20 处理以进一步增加通透性。使用正常血清阻断非特异性抗体结合。添加甘氨酸和肝素以降低免疫标记背景14。
<ol>
	<li>用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 对样品进行清洗，每次 1 小时，共清洗 2 次。</li>
	<li>在 37 °C 条件下，用 4 mL 的 0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M 甘氨酸/PBS 对样品进行透化处理，持续 2 天。</li>
	<li>将样品置于 4 mL 的 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% 正常血清/PBS 中，在 37 °C 下孵育 2 天，以阻断抗体的非特异性结合。 
	注意：为获得理想的阻断效果，应使用与二抗同一物种来源的正常血清。</li>
	<li>将样品置于 2 mL 的一抗溶液（3% 正常血清/5% DMSO/PTwH [含肝素的 PBS-Tween 20] + 一抗/抗体）中，在 37 °C 下孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换一抗溶液&#160;。
	<ol>
		<li>配制 PTwH 时，将肝素钠盐溶于蒸馏水中，配制成 10 mg/mL 的储存液（将此溶液分装后于 4 °C 保存）。将储存液加入 0.2% Tween 20/PBS 中，使其终浓度为 10 µg/mL。 
		注意：选择合适的一抗稀释比例可能需要优化。通常可从常规免疫组织化学推荐的浓度开始尝试。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 4 mL 的 PTwH 对样品清洗 1 天，期间至少更换 4–5 次洗涤缓冲液，并将最后一次洗涤液过夜保留。</li>
	<li>将样品置于 2 mL 的二抗溶液（3% 正常血清/PTwH + 二抗/抗体）中，在 37 °C 下孵育 5 天。孵育 2.5 天后更换二抗溶液。
	<ol>
		<li>将二抗/抗体以 1:500 的比例稀释于二抗溶液中（即 2 mL 溶液中加入 4 µL 二抗）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤 3.5 所述方法对样品清洗 1 天，并将最后一次洗涤液过夜保留。</li>
</ol>
4. 细胞核染色
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照下。如无需进行核染色，或TO-PRO-3的激发波长/发射光谱需用于其他荧光染料的激发或检测，则可省略此步骤。
<ol>
	<li>将核酸染料 TO-PRO-3 用 PTwH 按 1:1,000 稀释，将样品在 4 mL 核染色液中孵育 5 小时。</li>
	<li>按照步骤 3.5 所述方法洗涤样品 1 天，最后一次洗涤过夜。 
	注意：洗涤完成后，样品可在 4 °C 的 PBS 中保存，直至进行光学透明处理。</li>
</ol>
5. 组织透明化
注意：所有孵育步骤均需在温和振荡条件下进行，除非另有说明，均在室温下操作。避免样品暴露于光照。组织样品经梯度浓度的TBA溶液脱水处理。由于免疫染色需要水相溶液，所有染色步骤必须在组织透明化之前完成。通过BA、BB和DPE混合液处理实现光学透明和折射率匹配。透明化溶液中添加DL-α-生育酚作为抗氧化剂13。
<ol>
	<li>配制30% (v/v)、50%、70%、80%、90% 和 96% 的TBA水溶液。例如，配制30% TBA溶液时，将15 mL 100% TBA加入35 mL蒸馏水中，置于合适的可密封容器中，通过倒置混匀。 
	注意：TBA的熔点为25–26 °C，因此在室温下通常呈固态。为配制TBA溶液，需将密封良好的TBA瓶置于37 °C的培养箱或水浴中加热。</li>
	<li>依次用4 mL已配制的TBA溶液（按浓度从低到高）对样品进行脱水处理，每种浓度处理2小时。96% TBA溶液可过夜放置。</li>
	<li>进一步用纯（100%）TBA对样品脱水2小时。</li>
	<li>配制透明化溶液BABB-D15。 
	注意：BABB-D15是BA与BB（BABB）的混合物，再按x:1的比例与DPE混合，其中x为该溶液名称中指定的数值，本例中为15。
	<ol>
		<li>配制BABB时，按1份BA与2份BB的比例混合。</li>
		<li>按15:1的比例混合BABB与DPE。</li>
		<li>加入0.4 vol%的DL-α-生育酚（维生素E）。 
		注意：例如，配制20 mL BABB-D15时，将6.25 mL BA与12.5 mL BB混合，加入1.25 mL DPE，并补充0.08 mL DL-α-生育酚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用透明化溶液处理样品，直至其呈现光学透明（2–6小时）。</li>
	<li>样品可在BABB-D15中于4 °C避光保存，直至进行封片与成像。</li>
</ol>
6. 样品安装
<ol>
	<li>使用3D打印机打印&#160;成像室及盖子（材料：共聚酯[CPE]，喷嘴：0.25 mm，层高：0.06 mm，壁厚：0.88 mm，壁数：4，填充率：100%，无需支撑结构；相应的.STL文件可在以下位置找到） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59402/3D_ImagingChamber.stl" target="_blank">补充材料</a> 本方案的</li>
	<li>组装成像室（图2).
	<ol>
		<li>将圆形盖玻片（直径：30 mm）用RTV-1（单组分室温硫化）硅橡胶固定在成像室上。用蘸水的棉签除去多余的硅橡胶，并过夜固化。</li>
		<li>将圆形盖玻片（直径：22 mm）用RTV-1硅橡胶固定在盖子上。移除&#160;过量硅橡胶&#160;用沾水的棉签擦拭，并过夜固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品放入成像腔室，加入少量BABB-D15，盖上盖子。通过入口用皮下注射针头（27 G × 3/4 英寸 [0.40 mm × 20 mm]）向腔室内注满BABB-D15。</li>
	<li>用RTV-1硅橡胶密封成像室的入口并封堵。在避光条件下过夜固化。</li>
</ol>
7. 成像与图像处理
<ol>
	<li>通过选择相应的激光谱线以匹配所用的荧光染料来设置图像采集参数。调整每个检测器的检测范围，以防止不同通道之间的信号重叠。 
	注：Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的典型检测范围分别为 500–550 nm、590–620 nm 和 645–700 nm。</li>
	<li>选择采集参数，定义 z 轴堆栈的上、下边界，并采集图像堆栈。 
	注：典型的采集参数包括：逐帧扫描，像素大小为 60–90 nm，z 轴步长为 0.5 µm，线平均为 1，扫描速度为 400 Hz，针孔大小为 1 阿贝单位。</li>
	<li>使用适当的图像分析软件（例如 Fiji）处理图像堆栈，以生成三维投影或进行深入分析。 
	注：由于所采集图像文件体积较大，通常需要使用工作站进行处理。
	<ol>
		<li>在 Fiji 中打开采集或图像文件（文件 | 打开 | 选择文件）。
		<ol>
			<li>若使用 .LIF 文件，例如，在 Bio-Formats 对话框窗口中选择或取消选择所需选项。使用 Hyperstack 查看堆栈。除此之外，无需进行其他特定选择或勾选。点击 确定。</li>
			<li>如果文件包含多个图像堆栈，请选择需要分析的堆栈，并点击 确定 确认。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将合并的图像拆分为各个独立通道（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 拆分通道），对每个通道执行漂白校正（图像 | 调整 | 漂白校正），并选择 简单比率法（背景强度：0.0）。 
		注：在某些情况下，例如信号无明显的线性衰减或整体信号过弱时，简单比率法 可能失效。此时可尝试 指数拟合法，或跳过漂白校正步骤。</li>
		<li>使用滑块调整每个通道的亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度 | 对比度）。</li>
		<li>合并各通道（图像 | 颜色 | 合并通道），生成复合图像（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 生成复合图像），并将其转换为 RGB 格式（图像 | 颜色 | 通道工具，然后选择 更多 | 转换为 RGB）。</li>
		<li>如有必要，调整图像堆栈大小以减少计算时间和文件体积（图像 | 调整 | 大小，勾选两个选项并启用双线性插值）。</li>
		<li>生成三维投影（图像 | 堆栈 | 3D 投影）。选择 最亮点投影法 作为投影方式，并将切片间距设置为与所采集图像堆栈的 z 轴步长一致。为获得最佳质量，将旋转角度增量设为 1，并启用插值功能。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。</li>
		<li>如有必要，将三维投影图像转换回 8 位格式（图像 | 类型 | 8 位），重新调整亮度和对比度（使用相应滑块：图像 | 调整 | 亮度 | 对比度），然后按照步骤 7.3.4 所述方法将图像堆栈重新转换为 RGB 格式。</li>
		<li>将三维投影保存为 .TIF 文件（图像格式）和 .AVI 文件（视频格式）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，组织透明化技术的复兴与进一步发展2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14，为获取器官组织的高通量图像堆栈开辟了许多新的可能性。这为研究包...

传统的组织学技术主要依赖于器官组织的薄切片，这本质上只能对复杂的三维环境提供二维的观察视角。尽管从原理上可行，但通过连续薄切片进行三维重建需要复杂的技术流程，包括切片过程本身以及后续获取图像的计算机内联配准1。此外，切片后z轴体积的无缝重建至关重要，因为由于图像平面不重叠、染色差异以及切片刀等物理因素对组织造成的破坏，可能导致机械和计算伪影持续存在。相比之下，对完整厚组织样本进行纯光学切片可获得重叠的图像平面（过采样），从而促进三维重建。这对于分析复杂细胞群体中的感染过程尤其有利（例如，在周围胶质细胞和免疫细胞背景下研究神经元网络）。然而，厚组织切片本身存在光散射以及抗体难以深入渗透到组织内部等固有障碍。近年来，已开发并优化了多种技术以克服这些问题2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。本质上，这些方法通过使用水性2,3,4,5,6,7,8,9或有机溶剂基10,11,12,13溶液处理，使目标组织在光学上变得透明。3DISCO（溶剂清除器官的三维成像）11,12及其后续改进方法uDISCO（终极溶剂清除器官三维成像）13的提出，提供了一种相对快速、简单且成本低廉且具有优异透明化效果的工具。该透明化方案的主要成分是有机溶剂tert-丁醇（TBA）、苯甲醇（BA）、苯甲酸苄酯（BB）和二苯醚（DPE）。随后发展并引入了iDISCO（免疫标记兼容的溶剂清除器官三维成像）14——一种兼容的免疫染色方案，进一步优于现有方法，实现了对目标抗原的深层组织标记，并支持免疫染色样本的长期保存。因此，结合iDISCO14与uDISCO13，可利用常规共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对大块组织切片（厚达1 mm）中经抗体标记的蛋白质进行高分辨率成像。
完整保留器官在三维空间中的复杂结构对于脑组织而言尤为重要。神经元是一种高度异质性的细胞亚群，其三维形态因神经突起的投射方式而表现出极大的多样性（由Masland15综述）。此外，大脑由多个区室和亚区室组成，每个区室均包含不同类型的细胞亚群及其特定比例，包括胶质细胞和神经元（由von Bartheld等16综述）。作为一种嗜神经病毒，狂犬病病毒（RABV，由Fooks等17综述）主要感染神经元，并利用神经元的运输机制从初始感染部位沿轴突逆向迁移至中枢神经系统（CNS）。本文所述方案（图1A）可用于对感染脑组织获得的大体积、连续图像堆栈进行免疫染色辅助下的RABV及RABV感染细胞的检测与可视化。该方法可实现对感染微环境无偏倚、高分辨率的三维评估。该方案适用于多种物种的脑组织样本，可在固定后立即进行，也可在样本经多聚甲醛（PFA）长期保存后实施，并允许对染色并透明化处理的样本进行数月的保存和重复成像。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>41218</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BB6630-500ML</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Carl Roth</td><td>4720.2</td><td>多种缓冲液</td></tr><tr><td>二苯醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240834-100G</td><td>透明化试剂</td></tr><tr><td>DL-&amp;alpha;-生育酚</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17039</td><td>抗氧化剂</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SBZ</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Carl Roth</td><td>3908.2</td><td>降低背景信号</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Merck</td><td>S26-100ML</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>降低背景信号</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液（30%）</td><td>Carl Roth</td><td>8070.2</td><td>样品漂白</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth</td><td>4627.4</td><td>样品预处理</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>用于配制固定液的结晶粉末</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td>防止储存液中微生物生长</td></tr><tr><td>叔丁醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>33278</td><td>组织透明化过程中的样品脱水</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher</td><td>T3605</td><td>核酸染料</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>吐温20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 反应管</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>样品管</td></tr><tr><td>圆形盖玻片（直径：22 mm）</td><td>Marienfeld</td><td>0111620</td><td>成像腔室的组成部分</td></tr><tr><td>圆形盖玻片（直径：30 mm）</td><td>Marienfeld</td><td>0111700</td><td>成像腔室的组成部分</td></tr><tr><td>皮下注射针头（27 G x &amp;frac34;&amp;rdquo; [0.40 mm x 20 mm]）</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td>向成像腔室中加入透明化溶液</td></tr><tr><td>RTV-1 硅橡胶</td><td>Wacker</td><td>Elastosil E43</td><td>用于组装成像腔室的粘合剂</td></tr><tr><td>Ultimaker CPE 2.85 mm 透明材料</td><td>Ultimaker</td><td>8718836374869</td><td>3D 打印机用共聚酯丝材，用于打印成像腔室部件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;技术设备与软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 2+</td><td>打印成像腔室</td></tr><tr><td>自动水浸系统</td><td>Leica</td><td>15640019</td><td>软件控制的水泵</td></tr><tr><td>台式轨道摇床</td><td>Elmi</td><td>DOS-20M</td><td>室温下样品孵育（约 150 rpm）</td></tr><tr><td>加热型台式轨道摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G24 Environmental Shaker</td><td>37 &amp;deg;C 下样品孵育（约 150 rpm）</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 TCS SP5</td><td>倒置共聚焦显微镜，用于样品成像</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH (ImageJ)</td><td>开源软件（v1.52h）</td><td>基于 ImageJ 的图像处理软件包</td></tr><tr><td>长工作距离水浸物镜</td><td>Leica</td><td>15506360</td><td>HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>样品切片</td></tr><tr><td>工作站</td><td>Dell</td><td>Precision 7920</td><td>CPU：Intel Xeon Gold 5118&lt;br/&gt; GPU：Nvidia Quadro P5000&lt;br/&gt; 内存：128 GB 2666 MHz DDR4&lt;br/&gt; 固态硬盘：2 TB</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 RABV N 抗体</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>通过杆状病毒表达并经 His 标签纯化的 RABV 核蛋白 N 免疫山羊获得的单特异性多克隆山羊抗 RABV N 血清&lt;br/&gt; 稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>兔抗 GFAP 抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>多克隆抗体（RRID:AB_10013382）&lt;br/&gt; 稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>兔抗 MAP2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td>多克隆抗体（RRID:AB_776174）&lt;br/&gt; 稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>兔抗 RABV P 160-5 抗体</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>通过杆状病毒表达并经 His 标签纯化的 RABV 磷蛋白 P 免疫兔子获得的单特异性多克隆兔抗 RABV P 血清（参见参考文献 23：Orbanz 等，2010）&lt;br/&gt; 稀释比例：1:1,000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>根据偶联的荧光染料而定</td><td>高度交叉吸附&lt;br/&gt; 稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>根据偶联的荧光染料而定</td><td>高度交叉吸附&lt;br/&gt; 稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>根据偶联的荧光染料而定</td><td>高度交叉吸附&lt;br/&gt; 稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>根据偶联的荧光染料而定</td><td>高度交叉吸附&lt;br/&gt; 稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>根据偶联的荧光染料而定</td><td>高度交叉吸附&lt;br/&gt; 稀释比例：1:500</td></tr></tbody></table>

溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

通过免疫标记技术对组织和器官中的感染过程进行可视化，是现代感染生物学的一项关键方法。该技术能够观察和研究病原体在器官组织内的分布、嗜性及丰度，从而为疾病的发生与发展提供关键数据。利用传统的显微镜方法，免疫标记主要局限于从石蜡包埋或冷冻样本中获取的薄切片。然而，这些薄切片有限的二维成像平面可能导致丢失有关受感染器官复杂结构及感染细胞微环境的重要信息。目前，新型多色、兼容免疫染色的组织透明化技术为研究病毒感染器官组织的高通量三维图像堆栈提供了相对快速且经济的方法。通过将组织暴露于有机溶剂中，使其在光学上变得透明，从而匹配样本的折射率，显著减少光散射。因此，结合长工作距离物镜，可利用常规共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对厚度达1 mm的大块组织进行高分辨率成像。本文介绍了一种在组织透明化后进行深层组织成像的实验方案，用于可视化狂犬病病毒感染脑组织中的病毒分布，以研究病毒致病机制、传播途径、嗜性及神经侵入等科学问题。

结合iDISCO14与uDISCO13技术，并利用高分辨率共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），可深入揭示狂犬病病毒（RABV）感染脑组织及其周围细胞环境的时空分辨率与可塑性。
通过RABV磷蛋白（P）的免疫染色，可以在小鼠脑组织厚切片中观察到被感染神经元细胞的复杂层次结构（图3）。随后，可对获取的图像堆栈进行无缝三维重建（图3A, B，右侧面板；动态图1）。当使用来源于与器官组织相同物种的一抗或针对该物种的二抗时，需格外谨慎。在小鼠脑组织上使用抗小鼠IgG抗体会导致血管系统出现明显染色（图3B，左侧面板）。由于图像堆栈具有高分辨率，感染情况可评估至单细胞水平（图4</st...

新型的组织透明化技术（如溶剂清除器官的终极三维成像）可与免疫染色兼容，能够实现狂犬病病毒脑部感染及其复杂细胞环境的三维可视化。通过对厚的抗体标记脑组织切片进行光学透明化处理，可增加成像深度，并实现共聚焦激光扫描显微镜下的三维分析。

通过免疫标记对组织和器官中感染过程进行可视化，是现代感染生物学的一项关键方法。观察和……

该方案可实现病毒侵染的可视化，并深入揭示侵染环境及其周围细胞背景在时空上的动态变化。免疫染色技术适用于深层组织成像，不仅可用于检测病毒，还可利用不同细胞的特异性标记物区分多种细胞亚群。为进行免疫染色前的组织固定，需将脑组织样本置于体积比为1:10的4%多聚甲醛PBS溶液中，在4摄氏度条件下固定至少48小时。固定结束后，将组织样本在 PBS 中洗涤三次，每次至少 30 分钟，然后将样本转移至含 0.2% 叠氮化钠的 PBS 中，于 4 摄氏度保存。接着使用振动切片机，将刀片进给速度设置为 0.3 至 0.5 毫米/秒，将组织切成 1 毫米厚的切片。将切片置于新鲜的含 0.2% 叠氮化钠的 PBS 中，于 4 摄氏度保存。进行甲醇预处理时，将样品浸入梯度递增的甲醇系列中，每个孵育步骤在室温下轻轻振荡孵育一小时，具体操作如所示。最后一次孵育后，将样品冷却至4摄氏度。用4毫升预冷的漂白液替换100%甲醇，在4摄氏度下过夜孵育。第二天早晨，将漂白液更换为4毫升新鲜的80%甲醇，在室温下孵育1小时。随后将样品浸入甲醇的递减系列溶液中，顺序与之前相反，在20%甲醇浸洗后，用4毫升PBS洗涤样品一次，每次1小时。对于脑组织切片的免疫染色，先用4毫升含0.2%Triton X-100的PBS洗涤样品两次，每次1小时；随后在37摄氏度下，使用4毫升含0.2%Triton X-100、20%二甲基亚砜和0.3摩尔甘氨酸的PBS溶液进行通透处理，持续两天。用含有0.2% Triton X-100、10%二甲基亚砜和6%正常血清的PBS溶液4毫升，在37摄氏度下封闭两天，以阻断非特异性结合。封闭孵育结束后，在37摄氏度下用2毫升一抗溶液对样品进行标记，孵育五天，并在第2.5天时更换一次抗体溶液。随后，用含有0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS溶液4毫升洗涤样品一天，期间至少更换洗液4至5次，并将最后一次洗涤液过夜保留。第二天，在37摄氏度下，将样品置于2毫升二抗溶液中孵育5天。随后，用4毫升新鲜的含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS溶液洗涤样品，操作如所示。对样品进行细胞核染色时，将样品置于4毫升核酸染料TO-PRO-3中，在避光条件下孵育5小时。孵育结束后，按照所示方法，用含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS缓冲液洗涤样品，随后将样品置于浓度递增的叔丁醇系列溶液中进行脱水，每次浸入持续两小时。在90%叔丁醇溶液中处理后，将样品转移至96%叔丁醇溶液中过夜。次日早晨，再用100%叔丁醇进一步脱水两小时，然后将组织切片置于新配制的BABB-D15溶液中透明化处理两至六小时，直至组织在光学上完全透明。随后可将样品置于避光的 BABB-D15 中保存，直至进行封片和成像。样品封片时，使用 3D 打印机打印成像腔室及盖子。用单组分室温硫化硅橡胶将直径为 30 毫米的盖玻片固定在成像腔室上。同样，将一个22毫米的盖玻片安装到盖子上。使用蘸水的棉签清除两个环上多余的硅橡胶，然后静置过夜使橡胶固化。第二天，将样品放入成像室，并在插入盖子前向室内加入少量BABB-D15。使用皮下注射针通过入口将BABB-D15注入腔室，并在用硅橡胶密封成像室之前堵住入口。为设置图像采集，请根据所用荧光染料选择合适的激光线，并调整每个检测器的检测范围，以防止通道间的信号重叠。然后设定采集参数，确定Z轴堆栈的上下边界，并采集图像堆栈。要生成图像堆栈的3D投影，请在Fiji中打开图像文件，然后选择图像 颜色 通道工具 更多 并拆分通道，将合并的图像拆分为各个独立通道。对每个通道的图像进行漂白校正时，选择图像 调整 漂白校正，并选择简单比率法。使用滑块调节每个通道的亮度和对比度，然后选择图像 颜色 合并通道。勾选“创建复合图像”选项。将图像转换为RGB格式，然后选择“图像堆栈”和“3D投影”以生成3D投影。投影方法选择“最亮点”，并将切片间距设置为与所获取图像堆栈的Z步长大小一致。为获得最佳质量，将旋转角度增量设置为1，并启用插值。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。然后将3D投影保存为TIFF和AVI两种文件格式。通过针对狂犬病病毒磷蛋白复合物的免疫染色，可在小鼠脑组织厚切片中观察到感染神经元细胞的分层结构。随后，可对获取的图像序列进行无缝三维重建。由于图像序列具有高分辨率，感染情况可被评估至单细胞水平，从而能够对例如目标细胞内抗原的丰度与分布等特征作出判断。除了小鼠脑组织外，该方案还可应用于其他动物物种的脑组织样本。例如，从感染狂犬病病毒的雪貂脑部不同区域获取的切片显示出不同程度的病毒感染。星形胶质细胞可通过胶质纤维酸性蛋白的表达进行鉴别，而神经突则可特异性地针对微管相关蛋白 II 进行染色。同时，可对病毒蛋白进行共染色，以评估感染细胞与特定细胞亚群之间的关系。对于免疫染色，选择合适的抗体以检测目标蛋白至关重要。尽管标准免疫组织化学的抗体浓度通常是一个良好的起点，但某些抗体可能需要进一步优化。本方案中使用的多种化学试剂具有有害性质。在通风橱中进行相应实验，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。

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溶剂清除脑组织狂犬病病毒感染的高分辨率3D成像

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

该病毒可感染大脑皮层中的锥体神经元，表达的病毒蛋白定位于细胞质内称为包涵体的颗粒状结构中。...

检测狂犬病病毒感染小鼠脑组织中的病毒蛋白

本视频展示了在感染小鼠脑组织中进行免疫组织化学染色以检测狂犬病病毒抗原的方法。该过程包括脱蜡和酒精处理，随后进行蛋白酶消化处理以增强抗原的可及性。免疫组织化学染色结果显示红色沉淀物，证实组织切片中存在狂犬病病毒抗原。...

一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学染色方法

来源： Zaeck, L., et al. 溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像。J. Vis. Exp. (2019)。...

小鼠脑组织中狂犬病病毒感染的三维可视化

直接快速免疫组织化学检测法（DRIT）是被世界动物卫生组织和世界卫生组织（OIE/WHO）认可的狂犬病诊断直接荧光抗体（DFA）检测的替代方法。该检测可在现场应用，利用光学显微镜对脑组织涂片进行检测，约1小时内即可完成。...

增强型狂犬病监测：采用直接快速免疫组织化学检测法

本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。...

免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。...

定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

本文介绍了一种利用嵌合型HIV病毒（EcoHIV）建立新型大鼠主动HIV感染模型的实验方案，该模型对于深入理解HIV-1在脑组织中的病毒储存库，以及研究HIV相关性神经认知功能障碍及其共病（如药物滥用）具有重要意义。...

一种大鼠的EcoHIV脑部感染模型

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。...

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

了解免疫染色兼容的组织透明化技术，用于高分辨率三维可视化狂犬病病毒感染小鼠脑组织。该方法结合共聚焦激光扫描显微镜，实现深层组织成像与单细胞水平分析。

溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

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