溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

该方案可实现病毒侵染的可视化，并深入揭示侵染环境及其周围细胞背景在时空上的动态变化。免疫染色技术适用于深层组织成像，不仅可用于检测病毒，还可利用不同细胞的特异性标记物区分多种细胞亚群。为进行免疫染色前的组织固定，需将脑组织样本置于体积比为1:10的4%多聚甲醛PBS溶液中，在4摄氏度条件下固定至少48小时。

固定结束后，将组织样本在 PBS 中洗涤三次，每次至少 30 分钟，然后将样本转移至含 0.2% 叠氮化钠的 PBS 中，于 4 摄氏度保存。接着使用振动切片机，将刀片进给速度设置为 0.3 至 0.5 毫米/秒，将组织切成 1 毫米厚的切片。将切片置于新鲜的含 0.2% 叠氮化钠的 PBS 中，于 4 摄氏度保存。

进行甲醇预处理时，将样品浸入梯度递增的甲醇系列中，每个孵育步骤在室温下轻轻振荡孵育一小时，具体操作如所示。最后一次孵育后，将样品冷却至4摄氏度。用4毫升预冷的漂白液替换100%甲醇，在4摄氏度下过夜孵育。

第二天早晨，将漂白液更换为4毫升新鲜的80%甲醇，在室温下孵育1小时。随后将样品浸入甲醇的递减系列溶液中，顺序与之前相反，在20%甲醇浸洗后，用4毫升PBS洗涤样品一次，每次1小时。对于脑组织切片的免疫染色，先用4毫升含0.2%Triton X-100的PBS洗涤样品两次，每次1小时；随后在37摄氏度下，使用4毫升含0.2%Triton X-100、20%二甲基亚砜和0.3摩尔甘氨酸的PBS溶液进行通透处理，持续两天。

用含有0.2% Triton X-100、10%二甲基亚砜和6%正常血清的PBS溶液4毫升，在37摄氏度下封闭两天，以阻断非特异性结合。封闭孵育结束后，在37摄氏度下用2毫升一抗溶液对样品进行标记，孵育五天，并在第2.5天时更换一次抗体溶液。随后，用含有0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS溶液4毫升洗涤样品一天，期间至少更换洗液4至5次，并将最后一次洗涤液过夜保留。

第二天，在37摄氏度下，将样品置于2毫升二抗溶液中孵育5天。随后，用4毫升新鲜的含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS溶液洗涤样品，操作如所示。对样品进行细胞核染色时，将样品置于4毫升核酸染料TO-PRO-3中，在避光条件下孵育5小时。

孵育结束后，按照所示方法，用含0.2% Tween 20和10微克/毫升肝素的PBS缓冲液洗涤样品，随后将样品置于浓度递增的叔丁醇系列溶液中进行脱水，每次浸入持续两小时。在90%叔丁醇溶液中处理后，将样品转移至96%叔丁醇溶液中过夜。次日早晨，再用100%叔丁醇进一步脱水两小时，然后将组织切片置于新配制的BABB-D15溶液中透明化处理两至六小时，直至组织在光学上完全透明。

随后可将样品置于避光的 BABB-D15 中保存，直至进行封片和成像。样品封片时，使用 3D 打印机打印成像腔室及盖子。用单组分室温硫化硅橡胶将直径为 30 毫米的盖玻片固定在成像腔室上。

同样，将一个22毫米的盖玻片安装到盖子上。使用蘸水的棉签清除两个环上多余的硅橡胶，然后静置过夜使橡胶固化。第二天，将样品放入成像室，并在插入盖子前向室内加入少量BABB-D15。

使用皮下注射针通过入口将BABB-D15注入腔室，并在用硅橡胶密封成像室之前堵住入口。为设置图像采集，请根据所用荧光染料选择合适的激光线，并调整每个检测器的检测范围，以防止通道间的信号重叠。然后设定采集参数，确定Z轴堆栈的上下边界，并采集图像堆栈。

要生成图像堆栈的3D投影，请在Fiji中打开图像文件，然后选择图像 颜色 通道工具 更多 并拆分通道，将合并的图像拆分为各个独立通道。对每个通道的图像进行漂白校正时，选择图像 调整 漂白校正，并选择简单比率法。使用滑块调节每个通道的亮度和对比度，然后选择图像 颜色 合并通道。

勾选“创建复合图像”选项。将图像转换为RGB格式，然后选择“图像堆栈”和“3D投影”以生成3D投影。投影方法选择“最亮点”，并将切片间距设置为与所获取图像堆栈的Z步长大小一致。

为获得最佳质量，将旋转角度增量设置为1，并启用插值。根据需要调整总旋转角度、透明度阈值和不透明度。然后将3D投影保存为TIFF和AVI两种文件格式。

通过针对狂犬病病毒磷蛋白复合物的免疫染色，可在小鼠脑组织厚切片中观察到感染神经元细胞的分层结构。随后，可对获取的图像序列进行无缝三维重建。由于图像序列具有高分辨率，感染情况可被评估至单细胞水平，从而能够对例如目标细胞内抗原的丰度与分布等特征作出判断。

除了小鼠脑组织外，该方案还可应用于其他动物物种的脑组织样本。例如，从感染狂犬病病毒的雪貂脑部不同区域获取的切片显示出不同程度的病毒感染。星形胶质细胞可通过胶质纤维酸性蛋白的表达进行鉴别，而神经突则可特异性地针对微管相关蛋白 II 进行染色。同时，可对病毒蛋白进行共染色，以评估感染细胞与特定细胞亚群之间的关系。

对于免疫染色，选择合适的抗体以检测目标蛋白至关重要。尽管标准免疫组织化学的抗体浓度通常是一个良好的起点，但某些抗体可能需要进一步优化。本方案中使用的多种化学试剂具有有害性质。

在通风橱中进行相应实验，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。