利用透射式诺马尔斯基型差分干涉对比显微镜对等离激元纳米粒子进行光谱学研究

微分干涉相差显微镜在复杂环境中成像等离子体纳米颗粒方面优于暗场显微镜。然而，DIC 显微镜也需要更高的专业知识和技能才能获得可重复的结果。DIC 显微镜可提供高横向分辨率和浅景深。

在细胞内或复杂环境中监测纳米颗粒时，这两个特性都极为重要。首先，使用刻痕笔在每块玻璃盖玻片的中心位置轻轻划出一个浅而短的标记，然后按照随附的文字方案所述步骤清洁玻璃。接着，使用微量移液器从原始储存容器中取出 100 微升浓度为 0.5 毫克/毫升的金纳米颗粒溶液，并将其转移至一个 1.5 毫升离心管中。

将样品在6,000 ×g 条件下离心10分钟。离心结束后，用微量移液器移除上清液，以去除纳米颗粒溶液中过量的表面活性剂。接着，向离心管中加入100 µL超纯水。

轻轻涡旋样品以打散沉淀，随后立即超声处理20分钟，以充分重悬纳米颗粒聚集体。使用微量移液器将6 µL纳米颗粒溶液滴加到已清洁并划痕的玻璃盖玻片上。然后小心翻转盖玻片，将其放置在另一块较大的显微镜载玻片上方。

液滴应迅速在两片玻璃之间均匀铺开。注意避免两片玻璃之间产生气泡。用细线状指甲油封住盖玻片边缘，防止液体蒸发。

将样品放置在显微镜载物台上，并对准显微镜的物镜和聚光镜。调节焦距以找到包含样品的焦平面，并定位先前制作的划痕标记。对准该标记并微调焦距，直至纳米颗粒清晰可见。

为了确定聚光镜的准确位置，首先使用20倍物镜，采用科勒照明法进行调节，然后切换至80倍或100倍等高倍物镜。接着，在样品中选择一个用于成像的感兴趣区域。将该区域置于相机视野中心，并根据需要调节焦距。

如果显微镜采用的是 Senarmont 设计，首先将起偏器调整至接近最大背景消光的位置，然后逐渐旋转起偏器，使背景消光程度降低。此时背景强度将逐渐增加。当纳米颗粒相对于局部背景平均强度达到最大强度差时，即为最佳设置。

对于等离激元纳米粒子，通常在最大背景消光处或其附近相对较暗的背景下可获得最佳对比度。关闭室内照明，以防止杂散光干扰成像过程。放置一个半高全宽为10纳米的带通滤光片，其中心波长与局域表面等离激元共振的主要波长一致，以便观察目标区域。

接下来，调节光源强度或曝光时间，直至背景信号水平达到相机最大容量水平的5%至40%。在感兴趣区域内，任何物体的信号强度均不应超过相机最大强度水平的90%。使用一系列带通滤光片对样品成像，每个滤光片的半高全宽为10纳米，且整体覆盖整个目标波长范围。

通过调整曝光时间而非光源功率，确保图像间的背景强度差异保持在5%以内。更换滤光片后，在采集图像前重新对样本进行聚焦。将图像保存为未压缩的TIFF文件和/或软件的原生文件格式，以保留所有相关信息。

开始分析时，在 ImageJ 中打开图像。使用矩形工具在主要感兴趣区域周围绘制一个矩形。然后在工具栏中选择图像，进入缩放，选择“适合选区”。

成像窗口将放大所选区域。接下来，选择图像，进入调整菜单，选择亮度/对比度。为改善样本区域的观察效果，请调节图像的最小值、最大值、亮度和对比度。

这些调整不会改变科学数据，仅能更好地显示样品区域。现在再次使用矩形工具，在首个待测纳米颗粒周围绘制一个方框。该方框应仅略大于纳米颗粒的艾里斑。

选定后，转到“分析”菜单，选择“测量”。此时会弹出一个新窗口，显示所选框内像素的最小值、最大值和平均强度。保持框的原始尺寸不变，将该框拖动至紧邻颗粒且背景对比度相对均匀、无颗粒或污染物存在的区域。

再次使用测量工具确定背景区域的平均强度。对系列中所有图像中的每个颗粒重复此过程。然后将数据导出至电子表格，以计算每个颗粒在所有波长和角度下的对比度或强度。

输入以下方程以计算每个粒子的对比度。最后，通过以波长为 X 轴、对比度或强度为 Y 轴绘制数据，得到给定纳米粒子位置处的光谱分布图。为了确定最佳成像条件，这些金纳米球在多种偏振器设置下进行了成像。

在零度时，颗粒大多呈白色，中间有一条深色条纹。这表明纳米球样品发生了交叉偏振现象。当偏振器旋转至不同角度时，颗粒会在某一角落投下深色阴影。

然而，颗粒的对比度值会发生显著变化。对于此样品，最佳成像条件是偏振器偏转10度。此处绘制了金纳米球的对比度随波长的变化关系。

每个数据点代表每种粒径的 20 个纳米球的平均值。每种颗粒的峰值对比度会因其尺寸不同而略有偏移。对于金纳米棒等各向异性形状，强度和旋转的影响更为显著。

此处绘制了两种不同偏振器设置下波长与强度的关系。在每种情况下，亮侧的强度均明显强于暗侧。当样品台旋转180度时，单个金纳米棒在其局域表面等离子体共振波长处的强度分布显示出亮侧与暗侧之间显著的强度差异。

样本成像极为重要，需要显微镜操作者具备细心与耐心。如果你正在进行一项需要在多日内重复对样本成像的实验，那么划痕标记等参照物对于重新定位目标区域至关重要。

DIC显微镜正受到研究纳米颗粒的科研人员日益增长的关注，尤其是在动态和细胞环境中的研究。因为DIC在复杂的采样环境中能够提供最佳的空间分辨率。