Name: 基于传输的野武学型差分干涉对比显微镜对等离子体纳米粒子的光谱处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解差分干涉对比显微镜技术，用于等离子体纳米粒子的高分辨率单粒子光谱成像。该方法适用于复杂环境中金纳米粒子的制备与观测，为纳米技术研究提供可靠的实验方案。

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安东尼·S·斯坦德博士希望感谢俄亥俄大学纳米尺度与量子现象研究所（NQPI）提供的技术支持。本文&#160;由俄亥俄大学为 Stender 博士提供的启动资金资助完成。

1. 使用标准玻璃显微镜载玻片进行样品制备
<ol>
	<li>准备用于样品沉积的玻璃载玻片。 
	注意：在某些情况下，将玻璃保存在超纯水中可能比保存在乙醇中更合适。然而，长时间将玻璃保存在水或空气中会使玻璃逐渐变得疏水。
	<ol>
		<li>为获得最佳效果，请购买玻璃或石英显微镜载玻片和盖玻片。</li>
		<li>使用划痕笔在每片盖玻片中心轻轻划出短而浅的标记。</li>
		<li>即使购买的是“预清洁”玻璃，也应对所有显微镜用玻璃进行清洗，以去除玻璃碎屑、灰尘、粉末、有机残留物以及其他可能影响成像质量或样品沉积的污染物。 
		注意：以下清洗方法适用于本文所述类型的样品，并避免使用强腐蚀性化学品。强腐蚀性化学品可能腐蚀玻璃，且在操作和处置时需要更加谨慎。
		<ol>
			<li>将显微镜用玻璃放置在储存架上，再放入烧杯或染色缸中。切勿将显微镜用玻璃直接放置在烧杯或其他实验室玻璃器皿底部而不使用支架，因为每一片玻璃的每个表面都应充分暴露于清洗剂中。</li>
			<li>向容器中加入约 1 mL 液体洗涤剂（材料表），然后加水至满。超声处理 30 分钟。 
			注意：一旦开始清洗过程，操作玻璃时应始终佩戴手套，以避免在玻璃上留下指纹残留。</li>
			<li>将清洗容器中的液体倒入水槽中。用超纯水多次冲洗容器，直至完全去除洗涤剂残留。重新用超纯水注满容器。将装有显微镜用玻璃的容器再次超声处理 30 分钟。</li>
			<li>至少重复上述步骤一次。继续在水中进行额外的超声处理，直到明显确认所有洗涤剂痕迹均已去除。</li>
			<li>倒出清洗容器中的内容物，用超纯水冲洗容器，然后用乙醇重新注满容器。将显微镜用玻璃超声处理 30 分钟。</li>
			<li>将清洗容器中的内容物倒入废液容器中，再次用乙醇重新注满容器。盖上容器盖子，防止乙醇因蒸发而损失。将显微镜用玻璃保存在此容器中，直至实验时使用。只要载玻片保持在加盖容器内的乙醇中浸泡，即可长期保持清洁并可正常使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒溶液的制备
	<ol>
		<li>使用微量移液器从原始储存容器中取出 100 µL 的 0.05 mg/mL 金纳米颗粒溶液，并将其转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>以 6,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>用微量移液器移除上清液，以去除过量的表面活性剂。</li>
		<li>使用微量移液器向离心管中加入 100 µL 超纯水。 
		注意：如果首次无法完全移除所有上清液，可重复离心和重悬步骤。</li>
		<li>短暂涡旋混匀样品以重悬沉淀物，随后立即超声处理 20 分钟，以彻底重悬并分散纳米颗粒聚集体。 
		注意：若样品未立即使用，在将其沉积到显微镜用玻璃上之前，应再次超声处理 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品沉积
	<ol>
		<li>从储存容器中取出已清洗的盖玻片和显微镜载玻片，用加压氮气或氩气吹干。</li>
		<li>使用微量移液器将步骤 1.2.5 中的 6 µL 纳米颗粒溶液滴加到盖玻片上。为使液滴均匀铺展，小心地将另一块较大尺寸的玻璃（如另一片盖玻片或显微镜载玻片）覆盖在盖玻片上方。注意避免两片玻璃之间夹入气泡。
		<ol>
			<li>将样品基底翻转，用细线指甲油密封盖玻片边缘，以防止介质溶液蒸发。</li>
			<li>或者，若需对样品进行“干燥”成像，可在移除多余的玻璃片前，让溶液在盖玻片上静置 5–15 分钟。随后用加压氮气或氩气轻轻吹干盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若条件允许，应在样品制备后立即进行成像。若无法立即成像，应将样品存放在加盖容器（如培养皿）中，直至成像时使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 差示干涉对比成像
<ol>
	<li>对准物镜和聚光镜。
	<ol>
		<li>将样品放置到显微镜上后，找到包含样品的焦平面。首先定位并聚焦于先前制作的划痕标记，然后微调焦距直至纳米颗粒进入视野。</li>
		<li>为确定聚光镜的精确位置，采用科勒照明法。5 在高倍放大（80x，100x）下实现科勒照明时，可先在较低倍率（如20x）下设置科勒照明，更易于成功。 
		注意：通常情况下，在对单个样品成像过程中无需重新调整科勒照明。然而，当更换新的载玻片时，建议验证科勒照明是否已正确设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化对比度设置。
	<ol>
		<li>选择样品中用于成像的兴趣区域。将该区域置于相机视场中心，并根据需要调整焦距。
		<ol>
			<li>若显微镜采用德·塞纳蒙设计，起始时将起偏器设置在接近最大背景消光的位置，然后逐渐旋转起偏器以降低背景消光程度。此时背景强度将逐步增加。</li>
			<li>若显微镜不具备德·塞纳蒙设计，则起始时光路设置为最大背景消光状态。在此情况下，逐步调节物镜棱镜位置以降低背景消光。 
			注意：理想设置应在纳米颗粒与其局部背景平均值之间的强度差异（即对比度）达到最大时实现。对于等离激元纳米颗粒，通常在背景较暗、即接近最大背景消光的设置下获得最佳对比度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对样品成像。
	<ol>
		<li>关闭室内照明，防止杂散光干扰成像过程。</li>
		<li>使用科学成像相机观察纳米颗粒时，确定最佳背景水平。使用中心波长与主要局域表面等离激元共振（LSPR）波长一致、半高全宽（FWHM）为10 nm的带通滤光片观察兴趣区域。调节光源强度或曝光时间，使背景水平处于相机最大容量水平的15%–40%范围内，且兴趣区域内任何物体的信号强度均不超过相机最大强度水平的90%。 
		注意：步骤2.3.2的目的是在切换滤光片时避免传感器饱和。理想的背景水平因样品和相机而异。完成此步骤后，可调整曝光时间，但不得再调整光源强度。</li>
		<li>使用一系列半高全宽（FWHM）均为10 nm的带通滤光片对样品进行成像，这些滤光片共同覆盖整个目标波长范围。通过调节曝光时间，确保各图像之间的背景强度保持一致（相互差异约在5%以内）。每次更换滤光片后，在采集图像前需重新对样品聚焦。</li>
		<li>将图像保存为未压缩的TIFF文件和/或软件原生文件格式，以保留全部信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>旋转样品。
	<ol>
		<li>在采集完样品原始位置的图像后，可将样品在光路中旋转，并在多个取向下进行成像。以固定角度间隔（例如10°或15°）在整个180°或360°范围内进行旋转。 
		注意：旋转操作需要配备可旋转样品台。</li>
		<li>与步骤2.1–2.3相同，调节相机设置，确保各图像间背景水平一致。 
		注意：不得对科勒照明进行任何调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 ImageJ 进行数据分析
注意：以下计算可在多种软件包中进行，有时也可在用于采集图像的原始程序中完成。ImageJ 是美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费软件。
<ol>
	<li>计算颗粒对比度或强度。
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 打开图像。</li>
		<li>选择 矩形 工具并在主要感兴趣区域周围绘制一个矩形。</li>
		<li>在工具栏中，选择 图像，然后 缩放，然后 To Selection成像窗口将放大所选区域。</li>
		<li>在工具栏中，选择 图像，然后 调整，然后 亮度/对比度. 此时将出现一个新窗口。为更清晰地观察样本区域，请调节以下四个参数：最小值、最大值、亮度和对比度。这些调整不会改变科学数据，仅用于改善样本区域的可视效果。 
		注意：步骤 3.1.3 和 3.1.4 可多次执行，且顺序可颠倒。</li>
		<li>再次使用矩形工具，在首个待测纳米颗粒周围绘制一个方框。该方框应仅略大于纳米颗粒的艾里斑。</li>
		<li>在工具栏中，选择 分析，然后 测量一个新窗口会出现，报告所选方框内像素的最小值、最大值和平均强度。</li>
		<li>将用于测量纳米颗粒的方框拖动至颗粒紧邻的区域，该区域背景对比度相对均匀，且无其他颗粒或污染物存在。保持方框的原始尺寸不变。</li>
		<li>使用测量工具确定背景区域的平均强度。</li>
		<li>测量每个剩余颗粒及其相邻的背景区域。</li>
		<li>对系列中所有图像的每个颗粒重复该过程。</li>
		<li>将数据导出至电子表格，以计算所有波长和角度下每个颗粒的对比度或强度。</li>
		<li>使用以下公式计算每个颗粒的对比度13,14,15: 
		<img alt="颗粒对比度公式：（颗粒最大值 - 颗粒最小值）/ 背景均值，方程。" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程"> 
		注意：使用此方程时，颗粒对比度应始终保持 &gt; 0.</li>
		<li>通过将测得的颗粒最大强度除以背景平均值，计算颗粒经背景校正后的最大值： 
		<img alt="颗粒测量校正方程；显示校正后最大值与背景均值的公式" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程"></li>
		<li>同样，通过将测得的最小粒子强度除以背景均值，计算经背景校正后的最小值： 
		<img alt="静态平衡公式，使用测量值和背景均值对粒子最小值进行调整后的方程。" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程"> 
		注意：根据计算，最大值应大于1，而最小值应小于1。可将每个数值减去“1”，使平均背景值基本为零，最大值以正值表示，最小值以负值表示。16后一种方法使分析人员能够分别考察各偏振场中的变化情况，在研究各向异性粒子时尤为有用。</li>
		<li>在给定纳米颗粒位置处绘制光谱轮廓图，应以波长为横轴，对比度或强度为纵轴进行作图。</li>
		<li>在特定波长下绘制旋转轮廓图时，将旋转角度沿 x 轴绘制，将对比度或强度沿 y 轴绘制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPluta%2C+M+%22Advanced+Light+Microscopy%22">Advanced Light Microscopy</a>. 2, Elsevier. 146-197 (1989).</li>
<li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li>
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<li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+All+That%27s+Gold+Does+Glitter%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li>
<li>Maier, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaier%2C+SA+%22Plasmonics%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Plasmonics: Fundamentals and Applications</a>. , Springer US. (2007).</li>
<li>Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%3A+Selectively+Imaging+Nanoparticle+Probes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).</li>
<li>Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).</li>
<li>Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Stimulated+Uncapping+Process+of+Gold-Capped+Mesoporous+Silica+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).</li>
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<li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles%3A+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li>
<li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用微分干涉差（DIC）显微镜成像时，在采集数据前优化光学组件至关重要。即使在实验过程中对偏振器进行微小调整，也可能对最终数据产生显著影响6。此外，不同样品材料需要不同的偏振器设置。尽管本实验中采用了较大的步长以展示偏振角的影响，但在实际实验中，必须将偏振器的设置在最佳对比度位置的1°–2°范围内进行优化。偏振器的设置角度也应记录下来，以供后续参考。建议始终在交叉偏振器（0°）点的同一侧进行操作。来回切换并无优势，反而可能因阴影图案的反转而导致混淆。
其次，计划进行光谱分析时，监测背景强度至关重要。最佳方法是通过调整相机曝光时间，或在光路中添加中性密度滤光片来实现。调节光圈或光源强度可能会影响柯勒照明，并改变对比度值。背景在样品上的分布应相对均匀，以确保选择不同的背景区域不会影响对比度的计算结果。应避免使用周围没有干净背景区域的样品。此外，背景强度的初始设置既不能过高，也不能过低。若背景强度设置过高，部分信号可能超出相机的最大检测范围，导致这些区域的对比度无法计算；若背景强度设置过低，则难以在微分干涉差（DIC）信号的暗部与背景信号之...

自20世纪80年代以来，微分干涉相差（DIC）显微镜技术在很大程度上被视为生物科学领域内用于微尺度物体成像的重要方法。然而，在20世纪50年代和60年代该技术发展的初期，其设计初衷是作为一种材料科学的研究技术1。随着近年来等离激元纳米颗粒相关材料科学的进展，利用光学显微镜对材料进行表征的研究兴趣日益增加。
目前已有多种光学技术可用于纳米材料的表征（例如暗场、明场、偏振光、荧光等）。暗场技术在纳米颗粒研究中应用广泛，但它仅依赖散射光的收集，对复杂样品提供的信息有限2。荧光技术可能有用，但仅适用于能够发光或可被适当染色的样品。微分干涉差显微镜（DIC）具备若干特性，使其成为纳米颗粒分析的有力工具。相较于其他方法，尤其是针对等离激元纳米颗粒，DIC最常被提及的优势包括：无需样品染色、无晕轮效应、景深浅以及横向分辨率高3。此外，DIC还具备其他对等离激元纳米颗粒研究具有价值的优点。首先，系统内存在两个固有且正交的偏振场，可同时用于光谱测量2。其次，纳米颗粒的去偏振信号不会被最终图像所捕获2，而这一点在暗场光谱测量中可能引发严重关注。
本文的目的是提供一种利用透射光诺马尔斯基微分干涉相衬（DIC）显微镜对等离激元纳米颗粒进行光谱分析的清晰方法。尽管DIC是一种可应用于多种不同材料的强有力技术，但在对纳米颗粒成像时，该技术的操作需要极高的技巧和深入的理解。基于透射的诺马尔斯基DIC显微镜具有复杂的光路1，本文仅作简要回顾。DIC的光路如图1所示。光源首先通过起偏器和一个分束诺马尔斯基棱镜，再经聚光镜聚焦到样品平面，光线穿过样品后进入物镜。随后，光线经过一个合束诺马尔斯基棱镜和检偏器，最终到达探测器。两个偏振器以及诺马尔斯基棱镜对于DIC图像的形成至关重要，它们负责产生DIC的两束正交偏振光场1。对于希望进一步了解诺马尔斯基DIC显微镜工作原理与光路，或诺马尔斯基DIC与其他类型DIC之间差异的读者，可参考其他关于这些主题的优秀文献资料1,4,5,6,7。
在对等离激元纳米颗粒进行光谱学研究之前，无论使用诺马尔斯基微分干涉相衬（DIC）、暗场还是其他任何显微技术，理解其基本性质同样至关重要。在等离激元领域，纳米颗粒被定义为尺寸在10-100 nm量级的微粒8,9。纳米颗粒可以具有多种形状（例如球形、棒状、星形、哑铃形等），其大多数重要特性源于与电磁波谱中紫外-可见-近红外范围光的相互作用。术语“等离激元”并不仅限于纳米颗粒10；然而，在讨论纳米颗粒时，它通常指局域表面等离激元共振（LSPR）。LSPR是一种现象，即纳米颗粒中的导带电子由于与特定频率且相对较窄频带的电磁辐射发生库仑相互作用而产生振荡8。在相同频率下，等离激元纳米颗粒表现出增强的光吸收和散射能力，使其可通过光学显微镜观察。在许多情况下，优选在聚光镜前放置带通滤光片以观察纳米颗粒2，从而提高成像对比度，并消除无法激发LSPR效应的光。使用滤光片还使得开展单颗粒光谱学实验成为可能。
局域表面等离激元共振（LSPR）相关的光学行为高度依赖于纳米颗粒的尺寸和形状，可通过多种光学显微技术进行研究。然而，为了解析具有各向异性（即非球形）形状的等离激元纳米颗粒的取向信息，必须利用光场的偏振特性。通过以微小角度逐步精确旋转光的偏振方向或样品基底，可以监测单个纳米颗粒的取向依赖性光谱特性。旋转与偏振手段还可用于判断光谱特征源于纳米颗粒表面电子的偶极振荡还是高阶振荡。然而，对于各向同性（即球形）纳米颗粒而言，在偏振光下旋转样品时，其光谱轮廓基本保持不变。
当通过微分干涉相差显微镜观察时（图2），纳米颗粒在灰色背景上呈现出明暗相间的盘状阴影外观。当球形纳米颗粒发生旋转或带通滤光片改变时，其外观特征保持不变；然而，随着滤光片中心波长与球形颗粒唯一的偶极局域表面等离子体共振（LSPR）波长的偏离程度增大，颗粒将逐渐从视野中消失11纳米棒在旋转过程中其外观可能会发生显著变化2纳米棒具有两个表现出偶极行为的局域表面等离子体共振（LSPR）谱带，其位置取决于纳米棒的物理尺寸。当纳米棒的长轴方向与微分干涉差显微镜（DIC）某一偏振场平行时，若使用对应于该LSPR波长的带通滤光片进行观察，艾里斑将呈现全白色或全黑色。旋转样品后 90°，它将呈现相反的颜色。或者，由于纳米棒的横向轴与纵向轴垂直，当在匹配两个轴向LSPR波长的滤光片之间切换时，纳米棒将呈现相反的颜色。在其他取向和滤光片设置下，纳米棒将更类似于球形，呈现出多种阴影投影的艾里斑图案。对于具有横向轴的纳米棒 &lt; 25 nm时，使用微分干涉相差显微镜检测该局域表面等离子体共振波长处的信号可能较为困难。
进行单颗粒光谱分析时，使用正确的光学元件并对其进行正确对准至关重要。必须使用能够支持微分干涉差（DIC）显微镜的物镜。对于单颗粒实验，80倍或100倍的油镜最为理想。诺马尔斯基DIC棱镜通常有三种类型：标准型、高对比度型和高分辨率型。选择何种类型主要取决于实验目的和纳米颗粒的尺寸。标准棱镜适用于多数实验；但在处理较小的纳米颗粒（< 50 nm）时，高对比度棱镜可能更有利，因为随着颗粒尺寸减小，其成像对比度会降低11。调节DIC对比度的方法取决于显微镜的品牌或型号，可通过旋转偏振器或移动其中一个DIC棱镜来实现6。
在设置科勒照明和偏振器参数后，收集光谱数据时切勿重新调整这些设置。此外，在整个数据采集过程中，即使在切换滤光片和角度设置时，也必须始终保持恒定的平均背景信号。实际理想的背景值取决于科学相机的动态范围，但通常情况下，背景信号应维持在相机最大检测水平的15%–40%之间。这既能降低相机传感器饱和的可能性，又能实现最佳的颗粒对比度。在采集光谱数据时，必须使用能够采集黑白图像的科学相机，而非彩色相机。
样品制备是成像等离激元纳米颗粒的另一个关键方面。微分干涉差显微镜（DIC）的操作人员必须了解样品的光学特性及其基底的性质。“预清洁”的显微镜玻片并不足以满足纳米颗粒成像的要求，在样品沉积前必须进行彻底的重新清洗，以确保对样品的无遮挡观察。虽然此前已有多种显微镜载玻片的清洗方案被记录在案12，但该步骤在实验研究中通常未被报道。
最后，数据分析方法是单颗粒光谱学的最终组成部分。必须测量每个纳米颗粒的最大和最小强度，以及局部背景平均值。感兴趣颗粒应位于无背景杂质、基底缺陷或照明不均匀的区域。确定纳米颗粒光谱特征的一种方法是通过以下公式计算每个波长处的颗粒对比度11,13,14,15：
<img alt="颗粒对比度公式：(颗粒最大值 - 颗粒最小值) / 背景均值，方程。" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程">
或者，可将单个粒子的光谱分解为其独立的最大和最小信号分量，这两个分量分别代表微分干涉相差（DIC）的两个偏振场，从而通过以下两个方程同时显示采集到的两个方向依赖性光谱。
<img alt="颗粒测量校正公式；显示校正后的最大值和背景均值的公式。" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式">
<img alt="静态平衡公式，使用测量值和背景均值调整粒子最小值，方程。" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程">

<table><tbody><tr><td>Contrad 70</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>1002</td><td>用于清洁显微镜玻片，可通过多家化学试剂供应商获取</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962-4</td><td>用于清洁和保存显微镜玻片</td></tr><tr><td>玻璃显微镜盖玻片</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>金纳米棒</td><td>Nanopartz</td><td>DIAM-SPR-25-650</td><td></td></tr><tr><td>金纳米球（80 nm）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>742023-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>NIH提供的免费数据分析软件</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E 显微镜</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2+ 数字 sCMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td></td></tr><tr><td>标记笔</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td>网上有多种低于10美元的选择，无需购买昂贵型号。</td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>18 兆欧</td></tr></tbody></table>

利用透射式诺马尔斯基型差分干涉对比显微镜对等离激元纳米粒子进行光谱学研究

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

微分干涉差（DIC）显微镜是一种强大的成像工具，最常用于利用可见光范围对微米级物体进行成像。本实验方案的目的是详细介绍一种经过验证的等离子体纳米颗粒样品制备方法，并结合DIC显微镜对其进行单颗粒光谱分析。为了实现可重复的光谱实验，必须严格遵循若干关键步骤。首先，可在样品基底上刻蚀标记点，以帮助定位样品表面，并在实验过程中追踪目标区域。其次，必须彻底清洁基底上的碎屑和污染物，否则这些杂质可能干扰或遮蔽样品的观察。样品正确制备后，需使用科勒照明（Kohler Illumination）对显微镜的光路进行校准。在使用标准诺马尔斯基（Nomarski）型DIC显微镜时，可能需要旋转样品，特别是当等离子体纳米颗粒表现出取向依赖性光学特性时。由于DIC显微镜具有两个固有的正交偏振场，其波长依赖性的DIC对比图样能够揭示棒状等离子体纳米颗粒的取向。最后，数据采集与数据分析必须谨慎进行。通常可将基于DIC的光谱数据表示为对比度值，但也可将其表示为强度数据。在本单颗粒光谱分析的DIC应用示例中，重点研究球形和棒状金纳米颗粒。

当处理大到肉眼可见的样品时，通常无需在玻璃基底上标记定位标志。然而，在处理纳米材料或需要确定样品取向的情况下，定位标志可提供一种简便的方法，用于定位、区分和追踪样品的方向。尽管可采用更复杂的技术在玻璃基底上留下标志17，但使用刻划笔在玻璃表面划痕是一种经济且简单的方法，适用于多种情况。需要注意的是，应避免检测紧邻这些标志的样品区域，因为划痕会产生复杂的背景，可能影响数据结果（图3）。然而，在划痕的末端，常会向外延伸出被称为“蜘蛛网”的细线结构。这些线条作为定位标志非常有价值，但同样地，若纳米颗粒与这些缺陷重叠，则应避免选择这些区域。
为了在微分干涉差显微镜（DIC）成像中获得最佳效果，确定合适的焦平面至关重要。略微失焦的物体会显得模糊、边缘不清，并且对比度降低。图4展示了不同程度失焦的金...

本实验方案的目的是详细介绍一种经过验证的方法，用于制备等离激元纳米颗粒样品，并利用微分干涉差显微镜（DIC）对其进行单颗粒光谱分析。

微分干涉差（DIC）显微镜是一种强大的成像工具，最常用于利用……对微米尺度物体进行成像

微分干涉相差显微镜在复杂环境中成像等离子体纳米颗粒方面优于暗场显微镜。然而，DIC 显微镜也需要更高的专业知识和技能才能获得可重复的结果。DIC 显微镜可提供高横向分辨率和浅景深。在细胞内或复杂环境中监测纳米颗粒时，这两个特性都极为重要。首先，使用刻痕笔在每块玻璃盖玻片的中心位置轻轻划出一个浅而短的标记，然后按照随附的文字方案所述步骤清洁玻璃。接着，使用微量移液器从原始储存容器中取出 100 微升浓度为 0.5 毫克/毫升的金纳米颗粒溶液，并将其转移至一个 1.5 毫升离心管中。将样品在6,000 ×g 条件下离心10分钟。离心结束后，用微量移液器移除上清液，以去除纳米颗粒溶液中过量的表面活性剂。接着，向离心管中加入100 µL超纯水。轻轻涡旋样品以打散沉淀，随后立即超声处理20分钟，以充分重悬纳米颗粒聚集体。使用微量移液器将6 µL纳米颗粒溶液滴加到已清洁并划痕的玻璃盖玻片上。然后小心翻转盖玻片，将其放置在另一块较大的显微镜载玻片上方。液滴应迅速在两片玻璃之间均匀铺开。注意避免两片玻璃之间产生气泡。用细线状指甲油封住盖玻片边缘，防止液体蒸发。将样品放置在显微镜载物台上，并对准显微镜的物镜和聚光镜。调节焦距以找到包含样品的焦平面，并定位先前制作的划痕标记。对准该标记并微调焦距，直至纳米颗粒清晰可见。为了确定聚光镜的准确位置，首先使用20倍物镜，采用科勒照明法进行调节，然后切换至80倍或100倍等高倍物镜。接着，在样品中选择一个用于成像的感兴趣区域。将该区域置于相机视野中心，并根据需要调节焦距。如果显微镜采用的是 Senarmont 设计，首先将起偏器调整至接近最大背景消光的位置，然后逐渐旋转起偏器，使背景消光程度降低。此时背景强度将逐渐增加。当纳米颗粒相对于局部背景平均强度达到最大强度差时，即为最佳设置。对于等离激元纳米粒子，通常在最大背景消光处或其附近相对较暗的背景下可获得最佳对比度。关闭室内照明，以防止杂散光干扰成像过程。放置一个半高全宽为10纳米的带通滤光片，其中心波长与局域表面等离激元共振的主要波长一致，以便观察目标区域。接下来，调节光源强度或曝光时间，直至背景信号水平达到相机最大容量水平的5%至40%。在感兴趣区域内，任何物体的信号强度均不应超过相机最大强度水平的90%。使用一系列带通滤光片对样品成像，每个滤光片的半高全宽为10纳米，且整体覆盖整个目标波长范围。通过调整曝光时间而非光源功率，确保图像间的背景强度差异保持在5%以内。更换滤光片后，在采集图像前重新对样本进行聚焦。将图像保存为未压缩的TIFF文件和/或软件的原生文件格式，以保留所有相关信息。开始分析时，在 ImageJ 中打开图像。使用矩形工具在主要感兴趣区域周围绘制一个矩形。然后在工具栏中选择图像，进入缩放，选择“适合选区”。成像窗口将放大所选区域。接下来，选择图像，进入调整菜单，选择亮度/对比度。为改善样本区域的观察效果，请调节图像的最小值、最大值、亮度和对比度。这些调整不会改变科学数据，仅能更好地显示样品区域。现在再次使用矩形工具，在首个待测纳米颗粒周围绘制一个方框。该方框应仅略大于纳米颗粒的艾里斑。选定后，转到“分析”菜单，选择“测量”。此时会弹出一个新窗口，显示所选框内像素的最小值、最大值和平均强度。保持框的原始尺寸不变，将该框拖动至紧邻颗粒且背景对比度相对均匀、无颗粒或污染物存在的区域。再次使用测量工具确定背景区域的平均强度。对系列中所有图像中的每个颗粒重复此过程。然后将数据导出至电子表格，以计算每个颗粒在所有波长和角度下的对比度或强度。输入以下方程以计算每个粒子的对比度。最后，通过以波长为 X 轴、对比度或强度为 Y 轴绘制数据，得到给定纳米粒子位置处的光谱分布图。为了确定最佳成像条件，这些金纳米球在多种偏振器设置下进行了成像。在零度时，颗粒大多呈白色，中间有一条深色条纹。这表明纳米球样品发生了交叉偏振现象。当偏振器旋转至不同角度时，颗粒会在某一角落投下深色阴影。然而，颗粒的对比度值会发生显著变化。对于此样品，最佳成像条件是偏振器偏转10度。此处绘制了金纳米球的对比度随波长的变化关系。每个数据点代表每种粒径的 20 个纳米球的平均值。每种颗粒的峰值对比度会因其尺寸不同而略有偏移。对于金纳米棒等各向异性形状，强度和旋转的影响更为显著。此处绘制了两种不同偏振器设置下波长与强度的关系。在每种情况下，亮侧的强度均明显强于暗侧。当样品台旋转180度时，单个金纳米棒在其局域表面等离子体共振波长处的强度分布显示出亮侧与暗侧之间显著的强度差异。样本成像极为重要，需要显微镜操作者具备细心与耐心。如果你正在进行一项需要在多日内重复对样本成像的实验，那么划痕标记等参照物对于重新定位目标区域至关重要。DIC显微镜正受到研究纳米颗粒的科研人员日益增长的关注，尤其是在动态和细胞环境中的研究。因为DIC在复杂的采样环境中能够提供最佳的空间分辨率。

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等离子体纳米粒子的光镊捕获 原位 表面增强拉曼光谱表征

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利用等离激元纳米镊子监测单个未修饰蛋白质的构象动力学

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