Name: 啮齿类动物胎盘的体外灌注 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解啮齿类动物胎盘体外灌注技术，用于评估母体-胎儿血管灌注及药物转运机制。该方法支持高通量药理学研究，可分析胎盘屏障功能与毒理学特性。

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本工作由环境卫生科学国家研究所（R00-ES024783）、罗格斯环境暴露与疾病研究中心（P30-ES005022）以及罗格斯毒理学联合研究生项目（T32-ES007148）资助。我们还要感谢Michael Goedken博士、Marianne Polunas博士和Pedro Louro博士提供的技术指导，以及Adam Goodwill博士在设计灌注示意图（图5）过程中给予的帮助。

所有实验程序均经罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 实验前准备
注意：这些步骤可在实验开始前数天至数周内进行。
<ol>
	<li>改造血管腔室。 
	注意：图1A、B展示了改造后的单个血管腔室。
	<ol>
		<li>将热敏电阻传感器从夹具下方移出并弯曲，使其自由悬挂在灌流浴槽中（图1B）。</li>
		<li>安装两根4英寸钝头不锈钢针，配备标准鲁尔接头连接座，分别为25 G和23 G，固定在热敏电阻夹具下方，并添加一个三通旋塞阀，以便进行脐血管插管（图1B）。 
		注意：不同规格的鲁尔接头具有颜色编码，便于在实验过程中及实验后快速识别血管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装两根70−100 µm的玻璃微移液管。有关这些操作的更多细节，请参阅以下参考文献10,11。 
	注意：此类实验中常用的尖端直径范围为70−100 µm。大于该范围的尖端直径可能增加插管难度，而小于60 µm的尖端直径则可能在插管过程中刺穿血管壁。</li>
	<li>准备结扎线：使用无菌尼龙缝合线制作子宫动脉近端和远端的结扎线，使用黑色编织丝线（非无菌）制作脐血管的结扎线。按照先前描述的方法11，将缝线打成单结，方式类似于打方结或系鞋带。 
	注意：通常将单结制作好后置于培养皿中，皿底铺有一层薄薄的硅橡胶，以提供防滑的操作背景。</li>
	<li>配制2 L生理盐溶液（PSS），其成分（单位：mmol/L）为：129.8 NaCl、5.4 KCl、0.5 NaH2PO4、0.83 MgSO4、19 NaHCO3、1.8 CaCl2 和 5.5 葡萄糖。通过缓慢滴加数滴酸（1 M 盐酸）或碱（1 N 氢氧化钠）调节pH至7.40 ± 0.02，每次调节后至少等待20秒再读取pH值。将PSS储存于冰箱中直至使用，以减少污染，但储存时间不得超过2周。</li>
	<li>标记微型离心管，用于在每个时间点收集“母体”和“胎儿”流出液，例如“MBaseline、M10、M20、…”直至180分钟时间点。同样为胎儿流出液准备相应的标记（FBaseline、F10、F20、…）。</li>
	<li>校准系统中使用的所有设备，包括循环浴槽温度计以及用于维持子宫灌注压（80 mmHg）和脐血管灌注压（50 mmHg）的血压监测装置。</li>
	<li>准备一个解剖腔室（直径4英寸 × 深1英寸）或循环加热皿，在其底部铺设一层硅橡胶（&#60; 0.25英寸）。此步骤需提前完成，因为橡胶需要12−24小时才能完全干燥。 
	注意：建议初学者使用循环加热/冷却皿，因其位置固定，且能保持组织温度恒定。</li>
</ol>
2. 手术台的准备和设备的平衡
<ol>
	<li>开启所有支持灌流系统的设备，检查其功能是否正常。将PSS从冰箱中取出，并恢复至室温。PSS将同时用作灌流液和灌注液。</li>
	<li>将一个小型鼓泡石放入灌注液储液瓶中，用于向灌注液输送混合气体。常用的气体混合比例包括21% O2、8% O2、3% O2和0% O2。打开气体供应，使灌注液中产生细小气泡。调节气体流速，避免液体飞溅。</li>
	<li>准备动物解剖工作站，检查麻醉剂、摆放手术器械并准备好结扎线。准备解剖腔室：收集解剖针，打开制冷装置（或取冰），并在衬有橡胶硅胶的解剖腔室中加入冷PSS。</li>
	<li>用预热的PSS轻轻充满所有腔室、针头、玻璃微电极、管路和储液器，同时仔细观察，并使用细尖移液器吸除其中的气泡。将所有三通阀的“关闭”端朝向移液器方向旋转，以确保液体保留在移液器内。</li>
	<li>在用于子宫插管的两根玻璃微电极以及用于脐带插管的两根钝头针上各系一根结扎线。将结扎线牢固地固定在微电极和钝头针上，以防止在移动腔室过程中丢失（图1C）。</li>
</ol>
3. 胎盘采集
<ol>
	<li>在妊娠第20天，使用5%异氟烷对怀孕雌性大鼠进行麻醉，持续约4分钟，或直至动物出现呼吸困难。将动物转移至鼻罩，并给予2.5%−3%异氟烷以维持麻醉状态。通过脚趾夹捏反射消失确认动物已失去意识。 
	注意：本方案采用妊娠第20天的大鼠。然而，若实验条件需要在妊娠更早阶段进行胎盘评估，本方案步骤保持不变。</li>
	<li>通过将子宫角（右侧或左侧）从大鼠尸体中提起并沿长轴展开，识别并分离所需子宫角。使用编织丝线缝合线，在子宫角的卵巢端和阴道端结扎子宫动脉。将卵巢与子宫角一同包裹在线结内。</li>
	<li>使用&#160;手术剪，在卵巢端结扎线的近侧和阴道端结扎线的远侧进行剪切，将子宫角切除，使子宫角两端均保留结扎线。将切除的子宫角转移至内衬硅胶橡胶并盛有冷（4°C）PSS的解剖皿中。无论选择右侧或左侧子宫角，为保持一致性，每次实验均应选择相同侧别。 
	注意：&#160;为实现胎儿麻醉，仔鼠应置于冰冻PSS中。因此，解剖腔内的PSS温度应通过冷循环浴维持，或确保解剖腔置于冰上。 
	注意：&#160;此时，可根据实验室IACUC批准的方案对已麻醉的母鼠实施安乐死。本实验中，安乐死方法为气胸法（通过切开膈肌）并摘除母体心脏。</li>
	<li>用解剖针轻轻穿过子宫角并插入硅胶橡胶中，使卵巢端位于左侧，阴道端位于右侧，以便观察子宫血管系统。此举可稳定子宫，防止在分离胎儿部分时组织移动。选择位于子宫角中央的一个母体-胎盘-胎儿单位，用手术剪结扎其子宫动脉和静脉。在所选胎盘和胎儿的近端和远端剪断子宫肌层。可通过向侧方牵拉使子宫肌层回缩；注意应保持其完整，但将其拉开以暴露胎儿仔鼠。 
	注意：母体-胎盘-胎儿单位的选择应基于弓状动脉两侧子宫动脉段的长度。较长的血管段有助于提高插管成功率。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀，小心剥离胎盘胎儿面的羊膜，注意避免损伤脐带。</li>
	<li>松解并结扎脐带，以分离胎儿仔鼠。</li>
	<li>识别脐动脉（较粗的血管）和脐静脉（较细的血管）。通过将脐静脉剪得略短于脐动脉，以标记脐静脉便于识别。</li>
	<li>轻柔地将脐动脉与脐静脉彼此分离。</li>
	<li>可将包括子宫血管、子宫肌层、胎盘和脐带在内的整个胎盘单位剪下并移除。&#160;</li>
</ol>
4. 胎盘灌注
<ol>
	<li>保持解剖学血流方向，确保子宫动脉远端至近端的正确走向，将胎盘单位（包括子宫血管、子宫肌层、胎盘及脐带）置于盛有温热且充氧PSS的改良隔离血管腔室中。</li>
	<li>双手各持一把精细镊子，将子宫动脉的近端和远端分别套入玻璃微管上进行插管。</li>
	<li>使用预先固定在微管上的无菌尼龙缝合线紧密固定子宫动脉。 
	注意：可能需要打两个结；但单个结环更便于后续调整。</li>
	<li>将脐动脉（胎儿至母体血流方向）套入23 G（较粗）针头上，并用黑色编织丝线缝合固定。</li>
	<li>将脐静脉（母体至胎儿血流方向）套入25 G（较细）钝针头上，并用黑色编织丝线缝合固定。</li>
	<li>转移至胎盘灌注工作站，反向填充所有旋塞阀和管路以防止气泡产生。按照 图2 所示连接所有管路。</li>
	<li>在母体子宫动脉远端插管处及胎儿脐静脉针头插管处下方放置小型称量皿，用于收集操作过程中流出的灌流液。</li>
	<li>开启蠕动泵、压力控制器和压力监测仪，打开旋塞阀使液体经管路流向压力传感器，但暂不流入胎盘。缓慢将压力升至80 mm Hg。</li>
	<li>缓慢旋转旋塞阀使液体流入胎盘，观察腔室内及结扎部位是否有渗漏。 
	注意：若蠕动泵转速过高，需重新检查子宫动脉近端插管及结扎处是否存在液体渗漏。如发现渗漏，必须及时处理。此外，尽管子宫动脉平均压力保持恒定（设定为80 mmHg），但由于血管和胎盘的生理反应差异，液体流速可能有所变化。液体流速的变化可作为外源性物质暴露后的一种实验观测指标。</li>
	<li>旋转旋塞阀使液体流入脐动脉。将压力设定为约50 mmHg，可通过蠕动泵（图3）或静水柱实现该压力。</li>
	<li>补充所有储液器（子宫侧、脐侧及灌流液）中的液体，以维持整个实验过程中的液体体积。 
	注意：一旦开始灌注并进入实验阶段，可通过对解剖皿中仍处于麻醉状态的仔鼠用镊子轻触以评估其存活状态。&#160;仔鼠的放血处死通过切除子宫角完成；进一步的安乐死操作应依据批准的IACUC方案进行。本实验中，可在冷PSS中打开羊膜囊，并通过剪开肋骨造成气胸完成安乐死。</li>
</ol>
5. 对照实验
<ol>
	<li>插管并开始PSS灌注后，让组织平衡30分钟，以使血管系统适应新的液体流动。用移液器吸出灌流液，并保存在相应标记的微量离心管中。</li>
	<li>平衡结束后，通过从两个称重皿中收集10分钟的灌流液至微量离心管，并测量经子宫动脉和脐静脉流出的液体体积，建立基础灌注水平。</li>
	<li>以10分钟为间隔开始采样，收集远端子宫动脉和脐静脉的灌流液。例如，向灌注子宫动脉的管路中注入900 µL含20 nm罗丹明标记的聚苯乙烯纳米颗粒（8 × 1014 颗粒/mL）的团注剂量，该纳米颗粒悬浮于0.01%表面活性剂中，用于确定外源性纳米颗粒穿越胎盘屏障的时间过程。 
	注意：这些灌流液样本可用于检测液体中的污染物（包括外源性物质、药理学物质或代谢产物），并提供液体经子宫动脉或通过胎盘进入胎儿腔室的流动速率（图4）。</li>
	<li>团注给药后，每隔10分钟从远端子宫动脉和胎儿脐静脉灌流液中采集样本，持续共180分钟。</li>
</ol>
6. 清洁设备
<ol>
	<li>每次实验后，从移液管上取下胎盘单元。所有缝合线均可保存，以供后续实验重复使用。胎盘组织可保存用于进一步的组织学或机制研究。</li>
	<li>使用70%乙醇清洗灌流系统的全部管路和套管，随后用蒸馏水冲洗，并抽真空干燥。 
	注意：若管路或移液管开始出现变色或损坏迹象，应在下一次实验前予以更换。此外，在完成一组实验队列后（例如，与单一污染物相关的所有研究），应更换腔室内的所有管路，以防止交叉污染。</li>
</ol>

<ol><li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li>
<li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li>
<li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+studies+with+radioactive+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li>
<li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li>
<li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li>
<li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li>
<li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li>
<li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta%3A+methodology+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, Suppl A, S69-75 (2006).</li>
<li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li>
<li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. Isolated, Perfused Microvessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+MJ+%22Clinically+Applied+Microcirculation+Research%22">Clinically Applied Microcirculation Research</a>. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. , 1 ed, CRC Press. Boca Raton. 435-456 (1995).</li>
<li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种灌注方法可快速评估胎盘屏障以及子宫血管和滋养层的生理功能。对母体子宫动脉从近端至远端进行插管和灌注，可模拟母体血液流经这一主要血管的生理过程，该血管负责向发育中的胎儿输送血液。该方法能够对分离出的母体、胎盘及脐带血管系统进行生理学评估，因此可识别生理变化所提示的血管病理改变；而在离体操作过程中，免疫和神经支配已被去除。为确保准确评估，必须小心插管，避免血管壁出现撕裂或穿孔，并彻底清除气泡。气体栓塞可能损伤血管内皮层或阻塞血管。在解剖过程中保持子宫、胎盘与胎儿之间的血管连接，可观察液体流动及向胎儿的转运情况。通过给予一种外源性物质（本实验中为20 nm聚苯乙烯），可在180分钟的时间过程中，通过分析流出液来评估该物质从子宫动脉远端经胎盘向胎儿腔室的转运动力学。
尽管本文描述了一种双循环模型，并监测了物质和液体从母体腔室向胎儿腔室的转运，但也可反向评估从胎儿腔室向母体腔室的转运。本方法的一个局限性在于未对远端子宫静脉进行插管或取样。在今后的研究中，特别是关注胎儿向母体转运的研究，对远端子宫血管进行插管和取样将非常重要。本模拟实验所采集的流出液用于评估外源性物质的转运；然而，还可开展多种与内分泌功能、分子胎盘功能或胎儿营养相关的评估。 
该方案的优势远超过其微小的局限性。该方法能够保持整个器官的生理结构和完整性，从而用于评估实验条件。离体胎盘灌注技术是从基于细胞的体外实验到整体动物暴露实验的科学进步，可更准确地确定生殖风险。该技术可被视为评估胎盘药物代谢动力学、药代动力学、毒理学、生理学以及母胎医学研究的宝贵手段。

通过保持形态结构和生理反应性，器官灌注已成为一种公认的基于系统或组织的代谢功能分析方法。这些灌注技术使得在离体条件下，能够检测完整组织对多种药理和机械刺激的反应。人类胎盘灌注最初于1958年被描述，旨在确定激素对三羧酸循环代谢活性的影响；此前已在组织匀浆中发现相关现象，Troen 和 Gordon 认识到有必要采用一种新颖的生理学方法来阐明内分泌活性1。在同一时期，研究人员在大型2,3和小型4动物模型中描述了单向灌注（母体至胎儿或胎儿至母体）策略，以研究胎盘对糖类、盐类和安替比林类药物的转运。随后，体内和离体双灌注（协调的母体与胎儿灌注）技术被建立，以进一步利用体内5和离体6,7,8方法表征胎盘转运过程。透射电镜和扫描电镜的技术进步使研究人员能够在灌注后验证人类胎盘组织的结构和功能完整性9。
尽管人类胎盘组织和单个胎叶的灌流最为相关，但药理学试剂和环境污染物的快速发展 necessitates 使用动物灌流模型，以对异源物质通过胎盘屏障的转移进行早期筛选。该胎盘灌流方法可利用更易获取且生理学上相关的鼠类胎盘，评估物质通过胎盘屏障的转运。此外，通过测量从脐动脉流出的灌流液体积，可评估暴露后一段时间内液体通过胎盘屏障的流动情况。由于该方法允许从母体和胎儿循环双侧进行胎盘灌流，因此相较于现有的体外和体内方法，这种双循环完整器官方法具有优势。该方法可实现通过母体侧给予异源物质，并从经胎盘通过脐静脉流出的灌流液中进行检测，反之亦可。本文所述方案将描述20 nm聚苯乙烯（一种常用于食品和医疗产品的常见纳米塑料）从母体子宫动脉向胎儿腔室的转移，以及伴随的胎盘液体流动减少情况，以展示该方法在多种生理学、药理学和毒理学场景中的应用，用于评估胎盘转运、代谢及影响母体和/或胎儿血流的生理变化。

<table><tbody><tr><td>黑色编织丝线不可吸收性非无菌外科缝合线</td><td>外科专用配件品牌 Look</td><td>AACO805</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>FST by Dumont 瑞士品牌</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST by Dumont 瑞士品牌</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃套管套装</td><td>生命系统仪器公司（LSI）</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 聚丙烯带刻度离心管，带锁紧盖，混合型</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-299</td><td></td></tr><tr><td>无齿精细弯型微型止血钳</td><td>InterFocus</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>ISMATEC</td><td>ISM795C</td><td></td></tr><tr><td>压力监测仪</td><td>生命系统仪器公司（LSI）</td><td>型号 PM-4</td><td></td></tr><tr><td>自加热单血管腔室</td><td>生命系统仪器公司（LSI）</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>伺服泵</td><td>生命系统仪器公司（LSI）</td><td>型号 PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>23 号不锈钢钝头针</td><td>Component Supply Co.</td><td>04651-01</td><td></td></tr><tr><td>25 号不锈钢钝头针</td><td>Component Supply Co.</td><td>07116-01</td><td></td></tr><tr><td>无菌尼龙缝合线</td><td>ARO 外科器械公司</td><td>T04A00N07-13</td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td>Sedation Resource</td><td>6-205-04</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>生命系统仪器公司（LSI）</td><td>型号 TC-09S</td><td></td></tr></tbody></table>

啮齿类动物胎盘的离体灌注

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

胎盘是妊娠期间的关键器官，可作为胎儿接触外源性物质的屏障，并介导营养物质与废物的交换。本文描述了一种灌流离体大鼠胎盘的方法，用于在体外评估外源性物质从母体向胎儿的转运情况。此外，利用该方法还可评估液体向胎儿的流动以及胎盘代谢等生理过程。该技术适用于评价药物候选物或环境污染物从母体向胎儿的转运动力学。与现有的其他替代方法相比，该方法能够独立研究母体-胎儿血管系统，排除全身神经或免疫因素的干扰，从而使得观察到的生理功能变化可归因于离体组织内部的局部因素。

图5展示了使用伊文思蓝染料的原理验证实验，使我们能够测试该系统并可视化观察液体流动情况以及胎盘屏障功能，同时防止物质向胎儿腔室转移。在此系统中，伊文思蓝染料到达并灌注了胎盘组织（图5A）。进一步研究表明，伊文思蓝染料未进入胎儿脐静脉（图5B），这符合预期，因为伊文思蓝染料与白蛋白结合。
图6展示了本实验方案中所述模拟实验的数据。在向母体子宫动脉注射团注剂量后，每隔10分钟采集子宫动脉远端和胎儿脐静脉的流出液样本，以评估随时间推移的液体流动情况（图6）。结果显示，在聚苯乙烯灌注后10分钟内，向胎儿腔室的液体转移减少。为了定量测定聚苯乙烯在转移发生期间向胎儿腔室的转运情况，将每个时间点灌注液中的25 µL样品以复孔形式加入96孔板，用于检测样品的荧光强度。使用荧光酶标仪在546/575 nm（激发/发射）波长下进行光谱读数测定荧光。聚苯乙烯向胎儿腔室的转移在10分钟内开始，20分钟时达到峰值，并持续至90分钟（图6B）。
部分灌注过的胎盘组织被保留用于组织病理学和形态学评估。这些组织经福尔马林固定，苏木精-伊红染色后，由经认证的兽医病理学家进行评估。专家在仅使用PSS或添加罗丹明标记聚苯乙烯静脉推注剂量的PSS灌注的胎盘中，均未发现结构异常。
<img alt="显微注射装置；示意图；蛋白质递送过程；设备包括注射器、玻璃针头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：改良的单容器灌注室。（A）改良灌注室的整体结构示意图。（B）固定在容器室内的钝端针头的特写图像。红色箭头指示经过改造的热敏电阻夹，用于在脐血管插管过程中固定针头。（C）用于组织插管的四根导管的代表性图像。红色箭头分别指向四根导管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="透析装置示意图；显示流体路径和用于分子分离过程的阀门。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：胎盘灌注腔的放大视图。（A）表示连接至压力传感器并插管近端母体子宫动脉的导管，即“流入端”。根据文献定义，压力设定为恒定的80 mmHg。（B）表示灌注过程中围绕胎盘组织的灌流液的腔室排液口。（C）表示灌流液进入腔室的入口，用于在灌注期间以预热的PSS溶液灌注胎盘。（D）表示远端母体子宫端口，用于收集子宫灌注的流出液。（E）表示温度监测端口，腔室可通过此端口连接温度计和加热装置，以在整个实验过程中维持恒定温度。（F）表示脐动脉插管。脐动脉加压至50 mmHg，以实现胎盘水平的逆向流动。（G）表示脐静脉流出液的收集位置。灌注期间流向胎儿腔室的液体将在此处被收集。（H）为灌注系统中心位置，胎盘在此处进行插管并在整个灌注过程中维持。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱系统设置；显微镜、泵；蛋白质纯化；实验室设备布局。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：胎盘灌注系统的示意图。（A 和 B）用于监测和维持子宫动脉灌注液压力在80 mmHg的压力控制系统。（C）表示灌注室的温度调节装置。（D）显微镜。（E）灌注室。（F）重力驱动的脐动脉灌注系统，设定为50 mmHg。（G）用于填充和排出胎盘灌流液PSS的蠕动泵。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示子宫动脉血流和压力的胎盘灌注示意图，用于分析采集系统的设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：胎盘灌注系统的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物学解剖实验；手术装置、组织样本和液体递送系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：使用伊文思蓝染料进行原理验证实验的代表性图像。 （A 和 B）伊文思蓝可灌注子宫血管、子宫肌层和胎盘，但由于与白蛋白结合，无法穿过胎盘屏障的原理验证结果。绿色箭头指示来自胎盘并回流至母体循环的蓝色静脉回流。红色箭头指示朝向胎儿腔室的脐静脉流出液。注意未见蓝色染料。 （C）从脐静脉收集流出液的代表性图像。红色箭头指示收集前液滴的形成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="母体与胎儿荧光比较图表，随时间变化的荧光强度分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：模拟实验所得数据。 经基线荧光归一化后的罗丹明标记聚苯乙烯纳米材料的荧光检测结果，检测样本来源于（A）子宫动脉和（B）胎儿脐静脉流出液。数据以均值 ± 标准误差（SE）表示。*：p &lt; 0.05，T：p &lt; 0.1，经方差分析（ANOVA）判定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种离体母胎血管灌注方案，可用于将待测物质注入母体血管系统，以评估外源性颗粒或药理学物质通过胎盘的转运情况，同时研究胎盘生理功能的变化。

胎盘是妊娠期间的关键器官，可作为胎儿暴露于外源性物质的屏障，并介导营养物质与代谢废物的交换。

成功应用这些技术将能够对药物试验的药代动力学进行评估，或研究外源性污染物通过形态完整胎盘的过程。啮齿类动物胎盘灌流技术可提高药理学或毒理学研究的通量，因为可利用单只孕鼠的组织同时评估多种化合物。本技术将由我实验室的高年级研究生 Jeanine D'Errico 演示。开始操作前，用预热的生理盐溶液（PSS）轻轻填充所有腔室、针头、玻璃微量移液管、管路和储液器，并在必要时用细尖移液器小心去除任何气泡。将所有三通旋塞旋至关闭位置，以确保移液管内的液体密封。在用于子宫插管的两根玻璃微量移液管以及指定用于脐带插管的两根钝头针上，各系一根结扎线。然后系紧结扎线，以防止在操作过程中发生脱落。在确认麻醉后的妊娠第20天雌性大鼠对足趾夹捏无反应后，从腹腔中取出一侧子宫角，并将其纵向展开于动物体外。使用编织丝线缝合线，在子宫角的阴道端和卵巢端结扎子宫动脉，结扎时将卵巢与子宫角一同包裹在缝线内。使用手术剪，在卵巢结扎端的近端和阴道结扎端的远端进行切口。将子宫角转移至内衬硅胶橡胶并盛有冷PSS的解剖皿中。将卵巢端朝左、阴道端朝右，轻轻将解剖针穿过子宫角并插入硅胶橡胶中，以固定子宫。选择位于角部中央的一个母体胎盘-胎儿单位。使用精细镊子和剪刀，小心去除胎盘胎儿面上的羊膜，注意避免损伤脐带。分离并结扎脐带，以将胎儿仔鼠与胎盘分开。确定脐动脉和脐静脉后，轻柔分离并结扎脐部血管。然后将脐静脉剪得比脐动脉稍短，以便于识别。再用手术剪结扎子宫动脉和静脉。在保持子宫动脉解剖血流方向正确的前提下，将胎盘单元置于盛有温热含氧PSS的改良分离血管腔室中，并在解剖显微镜下操作。双手各持一对精细镊子，将子宫动脉的近端和远端分别套入玻璃微移液管上。用预先放置的无菌尼龙缝线将动脉牢固固定。将脐动脉插管并固定在23号钝针上。然后将脐静脉插管并固定在25号钝针上，并回填所有三通阀和管路，以防止产生气泡。请务必检查所有三通阀、插管和管路中是否存在气泡，因为系统中的气栓会导致细胞功能障碍，并破坏胎盘内的逆流交换机制。按照图示连接所有管路。在母体子宫动脉远端插管和胎儿脐静脉针头插管下方各放置一个小称量舟，以收集操作过程中流出的灌流液。准备好收集板以收集灌流液，用于后续分析。打开旋塞，使液体经导管流向胎盘，启动蠕动泵、压力控制器和压力监测仪。缓慢升高压力，直至压力监测仪读数达到80毫米汞柱。缓慢打开旋塞，使液体流向子宫动脉。在整个实验过程中，补充所有储液器以维持液体体积。组织平衡30分钟，使血管系统适应新的液体流动后，通过从两个称量皿中收集10分钟的流出液来建立基础灌注值。测量经子宫动脉和脐静脉流出的液体体积。在基线采集期结束时，将实验处理物质注入子宫动脉。随后，在灌注后每10分钟从远端子宫动脉和胎儿脐静脉流出液中采集样本，持续共180分钟。测定液体样本中的污染物含量。通过伊文思蓝染料灌注以检测系统功能，并可视化评估适当的液体流动及胎盘屏障功能是否可防止污染物向胎儿腔室转移，结果显示染料已到达并灌注了该系统中的胎盘组织。进一步观察发现，伊文思蓝染料并未进入胎儿脐静脉，此结果符合预期，因为伊文思蓝染料会与白蛋白结合。在此项代表性实验中，发现聚苯乙烯灌注后10分钟内向胎儿腔室的液体转运减少。聚苯乙烯向胎儿腔室的转移在20分钟时达到峰值，并持续90分钟。插管过程中最重要的是要缓慢操作。移液管和组织都非常脆弱，容易折断或撕裂。通过称量流出液的重量，该方法可用于研究胎盘生理学以及物质的转运过程。

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