利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

利用该方法，我们可直接观察心管形成、心管弯曲及完整心腔形成过程，而无需对小鼠胚胎进行其他实验性操作。尽管本实验以MLC-2v-tdTomato小鼠为例，但该简单方法亦可广泛应用于其他荧光报告基因小鼠品系。本方案的主要优势在于操作极为简便，无需任何复杂技术或设备。

该实验可在常规实验室条件下进行。将8至10周龄的MLC-2v-tdTomato雌鼠与雄鼠合笼交配后，每天早晨检查雌鼠阴道栓情况。将不同妊娠天数处死的怀孕雌鼠仰卧固定，并用70%乙醇喷洒腹部。

使用锋利的手术剪和镊子，切开皮肤和腹壁以打开腹腔。在腹腔背侧找到双侧子宫角后，用锋利的手术剪和镊子小心地在两侧输卵管上方剪切，分离整个子宫。将分离出的子宫置于含有冰冻 PBS 的 10 厘米培养皿中。

使用锋利的手术剪和镊子，沿子宫角小心分离每个羊膜囊。用镊子将每个胚胎转移至含有冰冷 PBS 的 35 毫米培养皿中。使用锋利的手术剪和镊子打开羊膜囊，通过剪断脐带暴露每个胚胎，然后在不损伤胚胎的前提下尽可能去除多余的胚外组织。

在配备光纤显微照明灯的解剖显微镜下，切下胚胎的头部，并将其转移至含有100微升缓冲液A的1.5毫升离心管中，用于后续基因分型，以与落射荧光成像结果进行关联分析。使用精细镊子打开胚胎的胸腔。利用锋利的手术剪和镊子，将心脏从肺组织及血管系统中分离并移除。

使用镊子将解剖得到的胚胎心脏转移至含有 PBS 的 35 毫米培养皿中。将装有小鼠胚胎心脏的培养皿置于落射荧光体视显微镜下。用精细镊子调整胚胎心脏的位置，使正在发育的心室朝向观察者。

使用0.63倍物镜在明场模式下调节焦距。进行明场曝光并采集多张图像。为观察tdTomato表达，关闭光纤显微镜照明光源，并将滤光片设置为红色荧光。

如有必要，重新调整图像焦距，调节亮度和对比度，拍摄红色荧光曝光图像，并采集多张图片。对于胚胎基因分型，将先前分离的头部样本在缓冲液A中于100摄氏度下煮沸30分钟。在11,360 ×g下离心2分钟。取20微升上清液转移至新的1.5毫升离心管中，加入20微升缓冲液B并混匀。

取4.5微升混合上清液作为DNA模板，加入0.5微升10微摩尔的特异性正向引物和0.5微升10微摩尔的特异性反向引物，再加入10微升2×预混聚合酶及反应缓冲液，最后加水至总体积为20微升。按照文稿中所述条件进行PCR扩增。将完成的PCR产物与100碱基对DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲液中以140伏电压电泳25分钟。

将制备好的凝胶置于紫外透射仪上，打开紫外灯以观察DNA条带。MLC-2v被认为是心脏发育过程中心室腔室特化的最早标志物。在MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中，通过胚胎整体荧光成像显示，tdTomato在E8.0时期线性心脏管中的表达相对较弱，到E8.5时期表达明显增强。

通过整体心脏标本的落射荧光成像，可轻松观察小鼠心脏发育过程中心室腔的形成。在 E10.5 期完整小鼠胚胎的心脏标本中，MLC-2v-tdTomato 报告基因的表达仅出现在心脏的心室部分，而不出现在静脉窦、动脉干或未来的心房区域。在 E12.5 至 E13.5 期，tdTomato 报告基因仅在具有四个腔室的心脏的心室中特异性表达。

在 E16.5 期解剖的小鼠胚胎中也显示出类似的室壁特异性表达模式。全组织成像后，使用两对引物进行 PCR 基因型鉴定，以确定胚胎的基因型，确认携带 tdTomato 基因敲入等位基因的纯合子胚胎、杂合子胚胎以及野生型胚胎。该方法操作简便，十分直接。

关键步骤是解剖胚胎心脏。了解心脏发育过程中的心脏解剖结构，对于成功从整个胚胎中分离心脏至关重要。