全山荧光在小鼠胚胎发生过程中心脏室发育的分析
April 17th, 2019
我们提出的方案, 以检查小鼠心脏的发展使用整个安装视网膜显微镜从心室特异性 Mlc-2v-t分解番茄记者敲入小鼠解剖小鼠胚胎。这种方法使我们能够直接想象小鼠心脏发育过程中心室形成的每个阶段, 而无需劳动密集型组织化学方法。
使用这种方法，我们可以直接检查心管的形成，循环，和全室形成，而无需进一步的实验操作小鼠胚胎。虽然，我们使用MLC-2v-tdTomato小鼠为例，这个简单的方法可以广泛用于其他荧光记者鼠标线。该协议的主要优点是非常简单，不需要任何复杂的技术或设备。
它可以在常规实验室设置下执行。雌性小鼠与雄性小鼠交配后，MLC-2v-tdTomato 8至10周大，每天早上检查大坝有阴道塞。放置怀孕的水坝，安乐死在不同的日子后，在上部的位置，并喷洒腹部与70%乙醇。
使用锋利的手术剪刀和钳子通过皮肤和腹壁的切口打开腹腔。在腹腔的后侧找到双边子宫角后，使用锋利的手术剪刀和钳子将整个子宫分开，小心地切开两侧的卵巢上方。将整个解剖子宫放在一个10厘米的培养皿中，并加有冰冷的PBS。
使用锋利的手术剪刀和钳子，小心地沿着子宫角分离每个羊膜囊。使用钳子将每个胚胎移植到充满冰冷 PBS 的 35 毫米培养板中。使用锋利的手术剪刀和钳子，打开羊膜囊，通过切断脐带暴露每个胚胎，然后尽可能修剪出额外的胚胎组织，而不会损坏胚胎。
在用光纤显微镜照明器解剖显微镜下，切断胚胎的头部，将其转移到1.5毫升的管中，并配以100微升的缓冲器 A，供以后进行基因分型，与荧光成像结果相关。使用精细钳子，打开胚胎的胸部。用锋利的手术剪刀和钳子，将心脏从肺和血管中去除。
使用钳子将解剖的胚胎心脏转移到带PBS的35毫米培养板中。将带小鼠胚胎心的板放在荧光解剖显微镜下。使用精细钳子定位胚胎心脏，使发育中的心室面对检查员。
在亮场模式下使用 0.63 倍目标调整焦点。拍摄亮场曝光并捕获多个图像。要可视化 tdTomato 表达式，请关闭光纤显微镜照明器并设置红色荧光滤镜。
必要时重新调整图像对焦，调整亮度和对比度，拍摄红荧光曝光，并捕获多个图像。对于胚胎基因分型，在100摄氏度的缓冲器中将先前分离的头部样本煮沸30分钟。在 11，360 倍 G.将 20 微升中分的超量液转移到新的 1.5 毫升管中，并混合 20 微升，在 11，360 倍时离心两分钟。
使用 4.5 微升的混合上流液作为 DNA 模板，并将其与 10 个微摩尔特异性前向和反向底塑剂的 0.5 微升、10 微升的 2x 预混合聚合酶和反应缓冲液，然后将水添加到 20 微升的总体积中。运行手稿中描述的 PCR。将完成的反应加载到 1%agarose 凝胶上的 100 基对 DNA 梯子上，并在 1x TAE 缓冲液中以 140 伏运行 25 分钟。
将完成的凝胶放在紫外线透光器上，然后打开紫外光以识别DNA波段。MLC-2v被认为是心脏发育过程中心室规格最早的标记。在MLC-2v-tdTomato记者敲击小鼠中，E8.0的线性心管中tDTomato的表达相对较弱，在E8.5时变得更强，如使用胚胎全安装脱光成像所示。
使用解剖心脏的全安装表皮成像，在小鼠心脏发育过程中可以轻松确定心室的形成。在E10.5的整个小鼠胚胎解剖的心脏中，MLC-2v-tdTomato记者的表情显示在心脏的心室部分，而不是流入道、流出区或未来的腹水。在E12.5到E13.5，tdTomato记者只在四室心脏的心室中表达。
E16.5的解剖小鼠胚胎显示了类似的心室特异性表达模式。经过整个成像后，使用两组PCR基因分型基质确定胚胎的基因型，确认携带tdTomato敲击等位基因、异质和野生型胚胎的同源性胚胎。此方法非常简单且易于执行。
关键的一步是解剖胚胎心脏。在心脏发育过程中了解心脏解剖学是成功将心脏从整个胚胎中分离出所必需的。
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概述
本文介绍了使用MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠进行全胚胎荧光显微镜检查的小鼠心脏发育的协议。该方法能够直接观察心室形成阶段，而无需复杂的组织化学技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 心血管研究
背景
- 心脏发育是发育生物学中的一个关键研究领域。
- 传统的心脏形态研究方法可能耗时费力。
- 荧光报告基因小鼠提供了一种新的方法来可视化心脏结构。
- MLC-2v-tdTomato小鼠是这些研究的有用模型。
研究目的
- 提供一种简单的方法来可视化心脏发育阶段。
- 展示荧光报告基因小鼠在发育研究中的应用。
- 促进不需要复杂技术的研究。
使用的方法
- 全胚胎荧光显微镜。
- 使用MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠。
- 解剖不同发育阶段的胚胎。
- 适合常规实验室环境的简单实验设置。
主要结果
- 成功可视化了心脏管形成和环状。
- 清晰地观察到完整的心腔形成。
- 该方法适用于其他荧光报告基因小鼠系。
- 协议在标准实验室环境中展示了易用性。
结论
- 所介绍的方法简化了心脏发育的研究。
- 它允许研究人员在无需复杂程序的情况下可视化关键阶段。
- 这种方法可以增进对心脏形态发生的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
