Name: 全山荧光在小鼠胚胎发生过程中心脏室发育的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学习使用全山荧光显微镜观察MLC-2v-tdTomato报告基因小鼠胚胎心脏发育过程。该方法无需复杂技术即可直接可视化心管形成、环化和心室腔发育，适用于常规实验室环境，为心脏形态发生研究提供简便工具。

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本研究由美国国立卫生研究院R03 HL140264（Y.-J. N）和吉利德科学研究学者项目（Y.-J. N）资助。

所有动物实验程序均经范德比尔特大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠胚胎的收集与解剖
<ol>
	<li>将8-10周龄的雌性MLC-2v-tdTomato+/-小鼠与8-10周龄的雄性MLC-2v-tdTomato+/-小鼠交配，以获得MLC-2v-tdTomato+/+、MLC-2v-tdTomato+/-和MLC-2v-tdTomato-/-胚胎。</li>
	<li>每天早晨检查雌鼠阴道栓情况。发现阴道栓当日的中午定为E0.5。 
	注意：应在早晨（交配后8-24小时内）进行阴道检查以确认阴道栓，因为阴道栓可能在当天晚些时候脱落。</li>
	<li>采用CO2吸入法安乐死不同妊娠天数（如E8.5、E10.5和E12.5）的孕鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，并在其腹部喷洒70%乙醇，以防止解剖过程中鼠毛污染。</li>
	<li>使用锋利的手术剪和镊子切开皮肤和腹壁，打开腹腔。</li>
	<li>在腹腔背侧定位两侧子宫角。</li>
	<li>使用锋利的手术剪和镊子，在两侧输卵管上方小心剪断，分离整个子宫。</li>
	<li>将完整解剖出的子宫置于含冰上冷PBS的10 cm培养皿中，使用锋利的手术剪和镊子沿子宫角逐个分离羊膜囊。</li>
	<li>用移液器将每个胚胎转移至盛有冰上冷PBS的6孔板的各个孔中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，于含冰上冷PBS的6孔板单个孔中，使用锋利的手术剪和镊子剪断脐带，打开羊膜囊并暴露胚胎。</li>
	<li>使用锋利的手术剪和镊子尽可能去除胚外组织，同时避免损伤胚胎。 
	注意：通常在解剖发育中的心脏之前，先对完整小鼠胚胎进行整体荧光成像，如下所述。</li>
	<li>使用锋利的手术剪和镊子剪下胚胎头部，转移至含有100 µL缓冲液A（25 mM NaOH和0.2 mM EDTA）的1.5 mL离心管中，用于基因型鉴定，以便与荧光成像结果进行关联分析。</li>
	<li>用精细镊子打开胚胎胸腔，使用锋利的手术剪和镊子将心脏从肺和血管组织中分离出来，再用移液器将解剖出的胚胎心脏转移至含PBS的12孔板的孔中。所有解剖操作均在配有光纤显微照明装置的解剖显微镜下完成。 
	注意：由于E8.0或E8.5时期小鼠胚胎心脏体积极小且结构脆弱，解剖技术上较为困难。早期胚胎心脏（即E8.0和E8.5）可在完整胚胎中直接观察，无需解剖分离。</li>
</ol>
2. 全组织表层荧光成像
<ol>
	<li>将含有小鼠胚胎心脏的12孔板置于落射荧光解剖显微镜下。</li>
	<li>在落射荧光解剖显微镜下，使用精细镊子调整胚胎心脏的位置，使正在发育的心室靠近观察者。</li>
	<li>使用0.63倍物镜（变倍范围为3.15倍至18.9倍），在明场模式下调节图像焦距。</li>
	<li>拍摄明场曝光图像，并采集多张图片。通常采用1秒曝光时间获取图像，但曝光时间可能因照明条件和相机规格而异，需针对每个实验系统进行优化。</li>
	<li>关闭光纤显微镜照明器，切换至红色荧光滤光片（激发波长545 nm/发射波长605 nm），以观察tdTomato的表达情况。</li>
	<li>如有必要，重新调节图像焦距。</li>
	<li>调节亮度和对比度，进行红色荧光曝光并采集多张图像。 
	注意：通常采用以下成像参数：曝光时间1秒，增益2倍，饱和度1.0，伽马校正1.0。最佳参数需根据具体实验条件优化确定；一旦确定最佳设置，整个实验过程中应保持一致。</li>
</ol>
3. 基因分型
<ol>
	<li>将步骤 1.12 的样品在 100 °C 下煮沸 1 小时。</li>
	<li>在 11,360 × g 条件下离心 2 分钟，取 20 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 20 µL 缓冲液 B（40 mM Tris HCl，pH 5.5），并混匀。</li>
	<li>取步骤 3.2 中混合后的上清液 4.5 µL 作为 DNA 模板，加入各 0.5 µL 的特异性正向引物和反向引物（10 µM），10 µL 预混的聚合酶与反应缓冲液（2×）（见材料表），然后加水至总体积为 20 µL。引物序列如下： 
	F1: 5’-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3’ 
	R1: 5’-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3’ 
	F2: 5’-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3’ 
	R2: 5’-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3’</li>
	<li>按照以下 PCR 程序（表 1 和 表 2）进行聚合酶链式反应（PCR）。</li>
	<li>将 PCR 产物和 DNA Marker 在 1× TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA）中，于 1% 琼脂糖凝胶上以 140 V 电泳 25 分钟。使用 100 bp DNA Marker 估算 PCR 条带的大小。</li>
	<li>将 DNA 凝胶置于紫外透射仪上，打开紫外灯以观察 DNA 条带。</li>
</ol>

<ol><li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li>
<li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li>
<li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li>
<li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HF-1a%2FHF-1b%2FMEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li>
<li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li>
<li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li>
<li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li>
<li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li>
<li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li>
<li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法在无需开展耗时费力的实验以标记心室或心脏特异性结构基因或蛋白的情况下，相对简便地检测心室腔室的发育情况。因此，该方法最大限度减少了在免疫染色心脏切片中常出现的技术变异。
成功实施本方法有两个关键步骤：准确估计小鼠胚胎的发育年龄以及完整分离胚胎心脏。我们通常通过检测雌性小鼠阴道栓的存在来实际估算其胚胎发育年龄。然而，阴道栓的出现并不一定意味着已成功受孕，仅表明在大约8至24小时内发生过交配行为。即使观察到阴道栓，通常也难以在交配后10至11天之前确定雌鼠是否真正怀孕，需通过检查雌鼠腹部情况来进一步确认。为确保获得预期发育阶段的小鼠胚胎，建议采用多对雌雄小鼠同时配种的稳妥繁殖策略。在小鼠胚胎发生过程中，若要准确观察心脏心室的发育情况，关键在于分离出结构完整、无明显损伤的发育中鼠心，如图1所示。为成功完成本实验方案，必须在解剖显微镜下进行细致的解剖操作，并在解剖前充分了解各胚胎发育阶段的心脏解剖结构。
由于MLC-2v-tdTomato报告基因的表达最早出现在E...

心脏发育过程中的心腔形成是一个复杂的生物学过程，需经历多个形态学上不同的胚胎发育阶段1,2。心脏前体细胞群首先形成新月形结构，随后发育为线性心管，再通过延伸和扭转形成螺旋状的早期心脏结构。在完成分隔过程后，早期心脏最终转变为具有四个心腔的成熟心脏。上述任一过程的中断均可能导致先天性心脏发育缺陷。因此，阐明心脏发育中心腔形成背后的分子机制至关重要。尽管此前已有大量关于心脏发育的研究，但目前对这一复杂过程的理解仍然有限。
原位杂交、免疫组织化学以及利用LacZ报告基因小鼠进行的β-半乳糖苷酶染色已被广泛用于通过标记心脏特异性或心腔特异性结构基因或蛋白（如Nppa、Coup-TFII、Irx4、MLC-2a和MLC-2v）3,4,5,6,7,8,9,10来研究小鼠心脏发育过程中的心腔形成。然而，这些使用小鼠胚胎的实验需要耗费大量时间并具备专业技术，因为必须依次完成多个不同的实验步骤11。本文中，我们描述了一种简单的整体标本落射荧光显微镜方法，用于观察从MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎发育中的心室12。与以往方法相比，该方法的优势在于避免了复杂的实验步骤，从而减少实验变异。本方案的主要目的是介绍如何解剖小鼠胚胎及发育中的心脏，并在无需繁琐的组织化学实验的情况下，观察小鼠心脏各阶段心腔发育过程。该方法可轻松应用于评估多种其他转基因小鼠品系（如标记早期心脏标志物的Mesp1Cre: Rosa26EYFP13、Isl1Cre: Rosa26EYFP13、Hcn4H2BGFP14、Hcn4Cre: Rosa mT/mG14、Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14、Hcn4-eGFP15、Isl1Cre: Rosa mT/mG14、Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15以及TgMef2c-AHF-GFP16小鼠）中心脏的发育情况。

<table><tbody><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ125</td><td></td></tr><tr><td>DNA分子量标准（100 bp）</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green预混试剂</td><td>Promega</td><td>M712</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪（Master Cycler）</td><td>Eppendorf</td><td>6336000023</td><td></td></tr></tbody></table>

利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

本实验方案旨在介绍一种利用心室特异性荧光报告基因敲入小鼠（MLC-2v-tdTomato 小鼠）进行小鼠胚胎解剖及心脏发育过程中心室腔室可视化的方法。心脏发育包括线性心管的形成、心管弯曲以及四腔分隔等过程，这些复杂的发育事件在所有脊椎动物中高度保守。小鼠胚胎心脏已被广泛用于心脏发育研究。然而，由于其体积极小，小鼠胚胎心脏的解剖在技术上具有挑战性。此外，心脏腔室形成的观察通常需要借助原位杂交、利用LacZ报告基因小鼠进行β-半乳糖苷酶染色，或对胚胎心脏切片进行免疫染色。本文中，我们描述了如何解剖小鼠胚胎心脏，并通过整体封片落射荧光显微镜技术直接观察MLC-2v-tdTomato小鼠的心室腔室形成。利用该方法，无需对小鼠胚胎进行进一步实验处理，即可直接观察心管的形成与弯曲过程以及四腔结构的发育。尽管本方案以MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠品系为例进行说明，但该方法同样适用于其他心脏特异性的荧光报告基因转基因小鼠品系。

在心脏发育过程中，MLC-2v 被认为是心室腔室特化的最早标志物17。如图1所示，我们从 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠中分离出整个胚胎及胚胎心脏，并检测了 MLC-2v-tdTomato 报告基因在心脏发育过程中的表达情况。在 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠中，通过落射荧光整体成像可在发育早期（E8.0 时）即观察到正在发育的心脏中持续表达 tdTomato12（图2）。在 E8.0 时，线性心脏管中 tdTomato 的表达相对较弱，至 E8.5 时表达增强。在 E10.5 时，从小鼠整个胚胎中分离出的环形心脏显示，MLC-2v-tdTomato 报告基因在心室部分表达，而在静脉流入道、动脉流出道或未来心房区域未见表达。在 E12.5–E13.5 时，对 MLC-2v-tdTomato 报告基因敲入小鼠胚胎分离心脏进行整...

我们介绍了利用从心室特异性MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎，通过整体封片表层荧光显微镜观察小鼠心脏发育的实验方案。该方法使我们能够直接可视化小鼠心脏发育过程中心室形成的各个阶段，而无需繁琐的组织化学方法。

本实验方案的目的是描述一种用于解剖小鼠胚胎并观察胚胎小鼠心室腔的方法，适用于……

利用该方法，我们可直接观察心管形成、心管弯曲及完整心腔形成过程，而无需对小鼠胚胎进行其他实验性操作。尽管本实验以MLC-2v-tdTomato小鼠为例，但该简单方法亦可广泛应用于其他荧光报告基因小鼠品系。本方案的主要优势在于操作极为简便，无需任何复杂技术或设备。该实验可在常规实验室条件下进行。将8至10周龄的MLC-2v-tdTomato雌鼠与雄鼠合笼交配后，每天早晨检查雌鼠阴道栓情况。将不同妊娠天数处死的怀孕雌鼠仰卧固定，并用70%乙醇喷洒腹部。使用锋利的手术剪和镊子，切开皮肤和腹壁以打开腹腔。在腹腔背侧找到双侧子宫角后，用锋利的手术剪和镊子小心地在两侧输卵管上方剪切，分离整个子宫。将分离出的子宫置于含有冰冻 PBS 的 10 厘米培养皿中。使用锋利的手术剪和镊子，沿子宫角小心分离每个羊膜囊。用镊子将每个胚胎转移至含有冰冷 PBS 的 35 毫米培养皿中。使用锋利的手术剪和镊子打开羊膜囊，通过剪断脐带暴露每个胚胎，然后在不损伤胚胎的前提下尽可能去除多余的胚外组织。在配备光纤显微照明灯的解剖显微镜下，切下胚胎的头部，并将其转移至含有100微升缓冲液A的1.5毫升离心管中，用于后续基因分型，以与落射荧光成像结果进行关联分析。使用精细镊子打开胚胎的胸腔。利用锋利的手术剪和镊子，将心脏从肺组织及血管系统中分离并移除。使用镊子将解剖得到的胚胎心脏转移至含有 PBS 的 35 毫米培养皿中。将装有小鼠胚胎心脏的培养皿置于落射荧光体视显微镜下。用精细镊子调整胚胎心脏的位置，使正在发育的心室朝向观察者。使用0.63倍物镜在明场模式下调节焦距。进行明场曝光并采集多张图像。为观察tdTomato表达，关闭光纤显微镜照明光源，并将滤光片设置为红色荧光。如有必要，重新调整图像焦距，调节亮度和对比度，拍摄红色荧光曝光图像，并采集多张图片。对于胚胎基因分型，将先前分离的头部样本在缓冲液A中于100摄氏度下煮沸30分钟。在11,360 ×g下离心2分钟。取20微升上清液转移至新的1.5毫升离心管中，加入20微升缓冲液B并混匀。取4.5微升混合上清液作为DNA模板，加入0.5微升10微摩尔的特异性正向引物和0.5微升10微摩尔的特异性反向引物，再加入10微升2×预混聚合酶及反应缓冲液，最后加水至总体积为20微升。按照文稿中所述条件进行PCR扩增。将完成的PCR产物与100碱基对DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲液中以140伏电压电泳25分钟。 将制备好的凝胶置于紫外透射仪上，打开紫外灯以观察DNA条带。MLC-2v被认为是心脏发育过程中心室腔室特化的最早标志物。在MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中，通过胚胎整体荧光成像显示，tdTomato在E8.0时期线性心脏管中的表达相对较弱，到E8.5时期表达明显增强。通过整体心脏标本的落射荧光成像，可轻松观察小鼠心脏发育过程中心室腔的形成。在 E10.5 期完整小鼠胚胎的心脏标本中，MLC-2v-tdTomato 报告基因的表达仅出现在心脏的心室部分，而不出现在静脉窦、动脉干或未来的心房区域。在 E12.5 至 E13.5 期，tdTomato 报告基因仅在具有四个腔室的心脏的心室中特异性表达。在 E16.5 期解剖的小鼠胚胎中也显示出类似的室壁特异性表达模式。全组织成像后，使用两对引物进行 PCR 基因型鉴定，以确定胚胎的基因型，确认携带 tdTomato 基因敲入等位基因的纯合子胚胎、杂合子胚胎以及野生型胚胎。该方法操作简便，十分直接。关键步骤是解剖胚胎心脏。了解心脏发育过程中的心脏解剖结构，对于成功从整个胚胎中分离心脏至关重要。

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发育生物学

全山荧光在小鼠胚胎发生过程中心脏室发育的分析

在研究影响心脏发育的遗传改变时，胎儿及围产期死亡是常见的现象。高频超声成像提高了二维分辨率，能够提供早期心脏发育的优良信息，是检测死亡发生前心脏结构与功能受影响情况的理想方法。...

小鼠胎儿超声心动图

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

我们介绍一种用于对完整胚胎期和出生后心脏内部标记有荧光蛋白的细胞进行三维成像的实验方案。通过结合组织透明化方法与整体染色技术，可清晰、准确地成像胚胎期或出生后心脏内部的单个荧光蛋白标记细胞。...

单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

我们介绍一种利用标准免疫染色方法结合光学透明化和共聚焦显微镜技术，对发育至E15.5阶段的完整胚胎小鼠心脏中冠状血管进行分析的实验方案。该技术可实现对整个心脏内血管系统的可视化观察，无需耗时的连续切片分析。...

透明化胚胎心脏中冠状血管的分析

超声心动图检查在小鼠中经常使用。为此已开发出昂贵的高分辨率超声设备。本方案描述了一种经济实惠的超声心动图操作流程，并结合组织学形态计量分析，以确定心脏形态。...

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小鼠胚胎心脏前体细胞群体的定量整体免疫荧光分析

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。...

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

在本实验方案中，我们描述了对与先天性心脏缺陷相关的小鼠发育表型进行定性和定量分析的步骤。...

利用定性和定量组织学方法分析小鼠胚胎中的先天性心脏缺陷

传统上，小鼠胚胎瓣膜原基的内皮细胞层通常通过横断面、冠状面或矢状面切片进行分析。我们提出了一种新的方法，可在瓣膜形成区域对内皮细胞层进行en...

En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

我们提供了一种小鼠胚胎培养与成像的详细方案，可实现心脏前体细胞的三维加时间（3D +...

小鼠胚胎早期心脏前体细胞的活体成像

本文详细介绍了利用胎儿超声心动图、尸检以及基于共聚焦表层显微镜（ECM）的表层荧光成像（EFIC）结合三维（3D）重建技术，对小鼠先天性心脏病（CHD）进行诊断的方法。...

一种用于表征胎鼠心脏结构缺陷的分析流程

学习使用全山荧光显微镜观察MLC-2v-tdTomato报告基因小鼠胚胎心脏发育过程。该方法无需复杂技术即可直接可视化心管形成、环化和心室腔发育，适用于常规实验室环境，为心脏形态发生研究提供简便工具。

利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

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