Name: 单分子荧光原位杂交 (SM-FISH) 在小鼠卵母细胞中 Mrna 的定量和定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习单分子荧光原位杂交技术在小鼠卵母细胞中对mRNA进行精确定量和定位的方法。该技术相比PCR等传统方法具有更低的变异性和更高的可重复性，为发育生物学研究提供了可靠的基因表达分析工具。

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我们感谢 Daniel R. Larson 博士在斑点识别与追踪程序&#160;13&#160;的安装与使用方面提供的大力支持，以及内布拉斯加大学林肯分校显微技术中心在共聚焦显微成像方面提供的技术协助。本研究是内布拉斯加大学林肯分校农业研究部的贡献之一，由联合国林肯分校哈奇基金（UNL Hatch Funds）资助（项目编号 NEB-26-206/登录号 232435 和 NEB-26-231/登录号 1013511）。

动物实验经内布拉斯加大学林肯分校机构动物护理和使用委员会审查并批准，所有方法均按照相关指南和法规进行。本研究中，CD-1远交系小鼠可自由摄取正常啮齿类动物饲料和水，并维持在12小时光照:12小时黑暗的循环环境中。
1. 所需培养基的制备
<ol>
	<li>对于基础培养基（OMM），在100 mL无菌水中加入100 mM NaCl、5 mM KCl、0.5 mM KH2PO4和1.7 mM CaCl2-2H2O。 
	注意：OMM培养基可保存长达1个月。</li>
	<li>对于完全培养基（OMOPS），在100 mL总体积的无菌水中，将OMM以1:10比例稀释后，加入20 mM 3-吗啉丙磺酸（MOPS）、1.2 mM MgSO4-7H2O、0.5 mM葡萄糖、6 mM L-乳酸、1 mM丙氨酰-谷氨酰胺（ala-gln）、0.1 mM牛磺酸、1x非必需氨基酸（NEAA）、0.01 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、10 µM α-硫辛酸、10 µg/mL未稀释的庆大霉素、21 mM 1 M NaOH、5 mM NaHCO3、0.2 mM丙酮酸、0.5 mM柠檬酸以及4 mg/mL FAF BSA。使用0.22 µM滤器对培养基进行灭菌。 
	注意：OMOPS可保存长达1周。</li>
	<li>对于维持培养基（HM），向OMOPS中加入5%胎牛血清。每只小鼠制备2 mL HM。</li>
	<li>对于透明质酸酶溶液，将来源于牛睾丸的透明质酸酶以0.1 mg/mL终浓度加入1 mL HM中。</li>
	<li>对于固定缓冲液，将4%多聚甲醛与10 mL 1x PBS混合，并加入0.1%胚胎级聚乙烯吡咯烷酮（PVP）14。</li>
	<li>配制50 mL洗涤缓冲液（WB）时，向1x PBS中加入0.1%非离子型表面活性剂和0.1% PVP14。</li>
	<li>配制10 mL通透缓冲液时，向1x PBS中加入1%非离子型表面活性剂14。 
	注意：上述洗涤缓冲液和通透缓冲液可替代市售试剂盒中的专有缓冲液。</li>
</ol>
2. 从小鼠雌性个体收集排卵后的卵母细胞
<ol>
	<li>准备：
	<ol>
		<li>对5-8周龄的雌性小鼠进行腹腔（IP）注射5 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG）以诱导超排，44-48小时后再次注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）15,16。</li>
		<li>将含有2 mL HM培养基的35 mm培养皿置于37 °C预热板上。在60 mm培养皿中，用移液器加入一滴100 µL含稀释透明质酸酶的HM培养基，随后加入三滴50 µL不含透明质酸酶的HM培养基。使用前将含有液滴的培养皿放置于37 °C预热板上。 
		注意：透明质酸酶液滴应在每次分离一对输卵管前立即配制，以防止HM培养基（无论是否含透明质酸酶）因蒸发而导致成分浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腹腔注射hCG后16小时，采用过量异氟烷麻醉并辅以颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇清洁小鼠体表，暴露腹腔并观察雌性生殖道。用镊子夹住卵巢，去除子宫韧带及卵巢周围的多余脂肪组织。将输卵管从子宫处剪下，并将卵巢-输卵管配对组织放入35 mm培养皿的温热HM培养基中。</li>
	<li>去除卵巢及其周围任何残留的脂肪组织。使用½英寸27号针头刺破膨大的输卵管壶腹部。在撕裂处轻推输卵管，即可挤出包裹卵母细胞的卵丘细胞复合体（COCs）。用口吸移液管将排出的已排卵卵母细胞（推测处于减数分裂中期II，MII期）转移至含透明质酸酶的100 μL HM培养基液滴中（图2）。</li>
</ol>
<img alt="移液装置、用于实验室实验和液体处理的流体转移系统示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于转移卵母细胞的口吸移液器的组成部分。（A）口吸端 （B）0.22 μm、4 mm 滤膜 （C）抽吸管路 （D）1000 μL 移液枪头 （E）9 英寸巴斯德移液管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>用口吸管将MII期卵母细胞-卵丘细胞复合体在含有透明质酸酶的HM中反复吹打，以去除卵丘细胞。一旦卵母细胞完全去除卵丘细胞，即用口吸管将其转移至仅含HM的洗涤液滴中。对每个洗涤液滴重复此操作。请勿转移已碎裂或透明的卵母细胞15。 
	注意：将卵母细胞从35 mm培养皿中的每个液滴转移时，应尽量减少携带的HM液体量。本实验方案中所有转移步骤均需遵循此原则。MII期卵母细胞在含透明质酸酶的HM培养基中停留时间不得超过一分钟。</li>
</ol>
3. 卵母细胞的SM-FISH染色
<ol>
	<li>在6孔板的单个孔中加入500 µL固定缓冲液，将卵母细胞固定于其中。每个孔中放入20个或更少的卵母细胞，于室温孵育20分钟。 
	注意：每个单分子荧光原位杂交（SM-FISH）染色步骤均在6孔锥形板的单个孔内进行。确保卵母细胞完全浸没在缓冲液中，不要漂浮在液面上。每个步骤中，每孔应含有20个或更少的卵母细胞。</li>
	<li>将固定的卵母细胞转移至500 μL洗涤缓冲液（WB，见步骤1.6）中，每次孵育10分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>将卵母细胞在通透缓冲液中于室温孵育30分钟。 
	注意：步骤1.7中所述的通透缓冲液用于替代专有通透缓冲液。
	<ol>
		<li>收集探针组，并在微量离心机中快速离心。将每组探针在40 °C水浴或培养箱中预热10分钟，随后冷却至室温。 
		注意：此步骤应在通透孵育期间完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用500 µL WB在室温下洗涤卵母细胞10分钟。</li>
	<li>将卵母细胞转移至80 μL Protease III缓冲液（来自试剂盒）中，该缓冲液以1:8比例稀释于1× PBS中，在室温下孵育30分钟。 
	注意：80 µL的体积足以充分覆盖6孔板单个孔的底部。</li>
	<li>用500 µL WB在室温下洗涤卵母细胞10分钟。</li>
	<li>将预热后的Nanog、Pou5f1和DapB（阴性对照基因）探针组用探针稀释液按1:50比例稀释。将卵母细胞在80 μL特异性转录本探针溶液中于40 °C孵育2小时。 
	注意：每种专有探针组可提供三种荧光通道之一（C1、C2和C3）。Nanog和Pou5f1探针分别标记C2和C3通道。</li>
	<li>将专有的放大剂1（AMP 1）、放大剂2（AMP2）、放大剂3（AMP3）和荧光标记的放大剂4（AMP 4-FL）于室温下回温。 
	注意：此步骤应在2小时的特异性探针孵育期间完成。</li>
	<li>将卵母细胞转移至500 μL WB中，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将卵母细胞依次在放大缓冲液中孵育。
	<ol>
		<li>在80 µL AMP1中于40 °C孵育30分钟，随后将卵母细胞转移至500 µL WB中，于室温下孵育10分钟。</li>
		<li>在80 µL AMP2中于40 °C孵育15分钟，随后将卵母细胞转移至500 µL WB中，于室温下孵育10分钟。</li>
		<li>在80 µL AMP3中于40 °C孵育30分钟，随后将卵母细胞转移至500 µL WB中，于室温下孵育10分钟。 
		注意：后续步骤需在避光条件下进行，因为AMP-FL含有荧光染料。在体视显微镜下操作时，应尽可能降低光照强度。</li>
		<li>将卵母细胞加入80 μL AMP4-FL中，于40 °C孵育15分钟。 
		注意：AMP4-FL以替代缓冲液A（Alt-A）、Alt-B或Alt-C形式提供。根据所需发射波长选择相应的AMP4-FL缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用500 µL WB在室温下洗涤卵母细胞10分钟。将卵母细胞在80 µL DAPI中于室温下孵育20分钟，随后用500 µL WB在室温下洗涤5分钟。</li>
	<li>用移液器吸取12 µL抗荧光淬灭封片介质，滴加至载玻片中央，避免产生气泡。将卵母细胞尽可能少地带入封片介质中，并加盖盖玻片。
	<ol>
		<li>将盖玻片倾斜一定角度，缓慢轻柔地覆盖在载玻片的液滴上。避免用力按压盖玻片，以防卵母细胞变形或引入气泡。</li>
		<li>将载玻片置于暗盒中，于室温下过夜干燥。用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用普通显微镜在载玻片上定位卵母细胞，并用永久性记号笔圈出其位置。 
	注意：此步骤非必需，但有助于后续在载玻片上快速定位卵母细胞。为获得最佳成像效果，建议在封片后1至5天内完成图像采集，因荧光信号会随时间逐渐减弱。</li>
</ol>
4. 图像处理
<ol>
	<li>使用z步进共聚焦显微镜对三维卵母细胞进行成像。 
	注意：为了准确分析图像，每个 z 轴步进应为 1.0 µm/slice.</li>
	<li>将共聚焦图像保存为每个卵母细胞的压缩 nd2 文件或单独的 .TIFF 文件。这两种图像格式均兼容开源图像处理程序 Fiji。</li>
	<li>下载并安装开源的 Fiji 软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）。 
	<ol>
		<li>将 nd2 文件拖入 Fiji 并选择 超堆栈如果共聚焦图像已保存为 .TIFF 文件，请跳至步骤 4.4。 
		注意：将 nd2 文件拖入 Fiji 时，应自动显示超堆栈下拉菜单。</li>
		<li>点击 图像 标签, 选择 颜色，然后单击 拆分通道 用于分离 nd2 文件的荧光通道。</li>
		<li>为卵母细胞在各荧光通道中的每个z切片生成单独的.TIFF文件。单击 图像 标签，选择 堆叠，然后单击 堆栈转图像. 单击 图像 标签，选择 类型，然后单击 RGB 颜色 将每个z轴切片转换为独立的RGB彩色图像。 
		注：RGB 颜色为人工设定，可根据需要为每个发射波长选择相应的颜色。</li>
		<li>将每个转换后的图像保存为.TIFF文件。为避免在拼接时（步骤4.3）产生混淆，将来自同一个卵母细胞的各荧光通道图像放入一个新文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个 .TIFF 图像进行归一化处理 Pou5f1 和 Nanog 使用阴性对照图像（DapB). 
	注意：使用图像编辑程序进行归一化处理。确保从每个对照图像中去除相同水平的背景荧光。</li>
	<li>在 Fiji 中打开每个标准化的 .TIFF 文件，将每个波长下每个卵母细胞的所有 z 层图像拼接在一起。
	<ol>
		<li>点击 插件 标签，选择 拼接，然后点击 网格/集合 (图3A）。选择 连续图像 从下拉菜单中 点击“确定” (图3B).</li>
		<li>浏览目录，选择包含某个卵母细胞在单一波长下所有z层图像的文件夹（参见步骤4.3.4）。点击 好的.</li>
		<li>移动拼接图像底部的滑块至对应所用波长的颜色通道，然后单击以创建最终的RGB拼接图像 图像，选择 类型，然后单击 RGB 颜色. 
		注意：此图像将用于下文第4.6步中所述的荧光定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将拼接图像转换为32位最大投影图像。点击 图像，选择 类型，然后单击 32位 (图 3C）。将此图像另存为新的 .TIFF 文件。</li>
</ol>
<img alt="用于显微镜图像分析的 ImageJ 软件界面示意图，显示网格集合拼接设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：卵母细胞共聚焦 z 序列图像的拼接。（A）Fiji 中用于生成卵母细胞复合图像的插件“网格/集合”（Grid/Collection）工具的截图。（B）“顺序图像”（Sequential Images）利用连续 .TIFF 文件之间的荧光重叠生成复合图像。（C）复合图像以 32 位 .TIFF 文件格式保存。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="7">
	<li>从美国国立卫生研究院国家癌症研究所研究员 D.R. Larson 的网站（https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson）下载并安装斑点识别与追踪程序13。同时下载并安装交互式数据语言（IDL）操作系统的开源虚拟机，该虚拟机是运行斑点识别与追踪程序所必需的（http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf）。</li>
	<li>在斑点识别与追踪程序中打开第 4.6 步生成的 32 位拼接图像（图 4A）。选择 Localize 下拉菜单，然后点击 Localize（图 4B），程序将计算图像中检测到的斑点数量。 
	注意：每个被计数的斑点代表一条单独的 mRNA。带通和光子阈值设置如截图所示（图 4B）。本实验方案中采用各项阈值的默认设置。代表性阳性斑点和背景斑点如图所示（图 4C）。</li>
</ol>
<img alt="定位显微镜分析；图像处理步骤；软件界面；点计数 761；荧光数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 Spot Finder 和 Tracking 对 mRNA 进行定量分析。（A） 按照图 3所述方法将单个 z 系列图像拼接，并保存为 32 位最大投影的 .TIFF 文件。（B） 在 Spot Finder 和 Tracking 中打开复合图像，使用“Localize”功能计数荧光点（红框所示）。带通滤波和光子阈值由蓝框标示。（C） 蓝色箭头指向高于阈值的阳性信号，白色箭头显示低于阈值的荧光点，因此未被计数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突

实验方案中的若干细微步骤将确保 mRNA 荧光标记成功并实现准确计数。首先，必须在卵母细胞收集和固定后立即开始实验操作。请注意，在 4% 多聚甲醛固定液中添加了聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以防止卵母细胞相互粘连。我们发现，必须在卵母细胞收集和固定后立即开展实验，任何延迟都会导致荧光信号显著减弱，从而造成转录本计数偏低，部分原因是 RNA 发生了降解。每次向 6 孔板的一个孔中转移的卵母细胞不应超过 20 个，且每个孔仅可使用一次。各孵育步骤的时间必须严格遵守，不得缩短或延长，洗涤缓冲液步骤除外；卵母细胞可在洗涤缓冲液中停留较长时间，不会影响实验结果。单分子荧光原位杂交（SM-FISH）探针提供三种荧光通道：C1、C2 和 C3。进行多重检测时，不得混合使用相同通道标记的探针，否则两种探针将在同一发射波长下发出荧光，导致无法区分探针组，使分析无法进行。针对看家基因设计的阳性对照探针在三个通道中均有提供。阴性对照探针（例如 DapB）也以预混形式提供，包含三种通道的标记。实验应在弱光条件下进行，因为卵母细胞自输卵管取出后对光敏感17,<sup class=...

逆转录聚合酶链式反应（PCR）一直是mRNA定量的金标准。目前常用的两种检测方法为数字PCR（dPCR）1和定量实时PCR（qPCR）2。在这两种PCR技术中，dPCR比qPCR具有更高的灵敏度，提示其可能适用于单细胞中mRNA丰度的测定。然而，在我们的实验中，对每个样本包含5至10个卵母细胞的低丰度mRNA进行dPCR分析时，所得数据重复性差且变异程度高3。这可能是由于RNA提取和逆转录效率相关的实验误差所致。此外，已有研究对单个小鼠和人类卵母细胞进行了RNA测序4,5。该技术需要进行cDNA扩增步骤以构建文库，这可能会增加实验组内的变异性。此外，低丰度的转录本可能无法被检测到。尽管近年来测序成本有所下降，但由于生物信息学分析费用较高，整体成本仍可能难以承受。最后，mRNA的定位是一个动态过程，其空间分布的变化有助于蛋白质功能的实现6。因此，我们着手采用一种能够准确、可重复地定量并定位单个卵母细胞中单个mRNA的技术。
分支DNA与荧光原位杂交技术结合，通过放大荧光信号而非RNA/cDNA本身，实现对单个细胞中单个mRNA分子的检测7,8,9。该检测通过一系列杂交、扩增（利用分支DNA）和荧光标记步骤完成，以实现荧光信号的放大7。该技术首先使用18至25个碱基的寡核苷酸探针对，与特定mRNA序列互补结合3,8,10。针对每种转录本设计15至20对探针，以确保对目标转录本的特异性。在mRNA特异性杂交之后，引入预扩增子和扩增子探针，形成分支结构。每个扩增子可结合约400个荧光标记物，使荧光信号增强约8000倍，从而实现对单个mRNA分子的检测（图1）11。
<img alt="mRNA扩增示意图；靶标结合、预扩增子、扩增子、标记阶段；基因表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：SM-FISH实验流程示意图。 图示为针对目标mRNA的转录本特异性探针、分支DNA扩增子及荧光团的依次杂交过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
既往研究利用单分子荧光原位杂交技术（SM-FISH）对单个神经元中的β-actin mRNA12以及宫颈癌细胞系中的人乳头瘤病毒DNA7进行了定位。计算机软件Spot Finding and Tracking Program可识别单个点状荧光信号，并已成功用于量化每个细胞中的mRNA数量3,13。
根据在神经元中检测mRNA的结果12，我们推测单分子荧光原位杂交（SM-FISH）可作为定量小鼠卵母细胞和胚胎中转录本水平的有效工具，包括丰度较低的mRNA。然而，该技术通常针对贴壁固定的细胞以及甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行优化。卵母细胞即使在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上也无法贴附。此外，与体细胞和组织切片相比，卵母细胞更为脆弱，在接触商业试剂盒中某些专有缓冲液时容易发生细胞裂解3。为克服这些挑战，卵母细胞经固定后通过人工方式在不同缓冲液液滴之间转移。此外，试剂盒中的透化和洗涤缓冲液被替换，以减少细胞裂解的发生。预设计的探针可随FISH试剂盒一并购买，也可根据需要定制特定转录本的探针。每套专有探针均可提供三种荧光通道（C1、C2和C3）中的一种，以实现多重检测。在本实验中，小鼠卵母细胞使用C2通道的Nanog探针和C3通道的Pou5f1探针进行双重染色并定量。选择这些探针是基于Nanog和Pou5f1在卵母细胞和胚胎中已有报道的表达情况。完成杂交步骤后，将卵母细胞置于抗荧光淬灭封片介质的液滴中，随后转移至组织学载玻片上。采用共聚焦显微镜图像对代表单个mRNA的点状荧光信号数量进行定量。除了定量mRNA外，成像还可显示特定mRNA在细胞内的空间分布，这是其他RNA定量方法无法实现的。该技术在实验组内表现出较低的变异性，因此可在每个实验组中使用较少数量的卵母细胞即可识别出实验组间的显著差异3。

<table><tbody><tr><td>(&amp;plusmn;)-&amp;alpha;硫辛酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1395</td><td>α-硫辛酸</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，低脂肪酸</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>199899</td><td>FAF BSA</td></tr><tr><td>BD 10 mL 结核菌素注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>10 mL 注射器</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305109</td><td>27½ 号针头</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>CaCl2-2H2O</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td>柠檬酸盐</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td>葡萄糖</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td></td><td></td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>易持型培养皿</td><td>Falcon Corning</td><td>351008</td><td>35 mm 培养皿</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠</td><td>Avantor</td><td>8994-01</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>超细邦剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>直剪，锐/锐，无锯齿，13毫米刃口剪刀</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>亚特兰大生物制品</td><td>S10250</td><td>FBS</td></tr><tr><td>庆大霉素试剂溶液</td><td>gibco</td><td>15710-064</td><td>庆大霉素</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I（100倍浓度）</td><td>gibco</td><td>35050-061</td><td>Glutamax</td></tr><tr><td>Gold Seal 微型载玻片</td><td>金印</td><td>3039</td><td>25 x 75 mm 载玻片</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>eCG</td></tr><tr><td>hCG 重组蛋白</td><td>NHPP</td><td>AFP8456A</td><td>hCG</td></tr><tr><td>透明质酸酶，IV-S型：源自牛睾丸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td>透明质酸酶</td></tr><tr><td>珠宝匠风格镊子</td><td>Integra</td><td>17-305X</td><td>4-3/8 号镊子&quot;，5F型，直型，超细钳口</td></tr><tr><td>L-(+)-乳酸，游离酸&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>190228</td><td>L-乳酸</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>MgSO4-7H2O</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>25-025-Cl</td><td>非必需氨基酸</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-C</td><td>25 × 25 × 0.15 mm 盖玻片</td></tr><tr><td>Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope 探针</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501891-C2</td><td>Nanog 探针</td></tr><tr><td>Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope 探针</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501611-C3</td><td>Pou5f1 探针</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>多聚甲醛</td></tr><tr><td>PES 0.22 微米膜 - 无菌</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RS</td><td>0.22 微米滤器</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0930</td><td>聚乙烯吡咯烷酮</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>KCl</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60218</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭剂</td><td>invitrogen</td><td>P36934</td><td>不含DAPI的抗荧光淬灭剂</td></tr><tr><td>RNAscope DAPI</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320858</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320852</td><td>放大器 1</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320853</td><td>放大器 2</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320854</td><td>放大器 3</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320855</td><td>放大器 4 ALT A</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320856</td><td>放大器 4 ALT B</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT C</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320857</td><td>放大器 4 ALT C</td></tr><tr><td>RNAscope 荧光多重检测试剂盒</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320851</td><td>FISH 试剂盒</td></tr><tr><td>RNAscope探针 三重阴性对照探针</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320871</td><td>阴性对照</td></tr><tr><td>RNAscope探针三重阳性对照</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320881</td><td>阳性对照</td></tr><tr><td>RNAscope 探针稀释液</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>300041</td><td>探针稀释液</td></tr><tr><td>RNAscope 蛋白酶 III</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322337</td><td>蛋白酶 III</td></tr><tr><td>RNAscope蛋白酶III &amp;amp; IV 试剂盒</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322340</td><td>FISH 蛋白酶试剂盒</td></tr><tr><td>RNAscope蛋白酶IV</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322336</td><td>蛋白酶IV</td></tr><tr><td>S/S 针头，带鲁尔接头，30G</td><td>Component Supply 公司</td><td>NE-301PL-50</td><td>钝头30号针头</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>NaHCO₃</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>丙酮酸钠， &gt;= 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>丙酮酸</td></tr><tr><td>溶液6孔板</td><td>Agtechinc</td><td>D18</td><td>6孔板</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>牛磺酸</td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td>60 mm 培养皿</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Triton X-100</td></tr></tbody></table>

利用单分子荧光原位杂交（sm-fish）定量并定位小鼠卵母细胞中的mrna

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

目前常规用于定量卵母细胞和胚胎中mRNA的方法包括数字逆转录聚合酶链式反应（dPCR）、定量实时RT-PCR（RT-qPCR）以及RNA测序。当这些技术应用于单个卵母细胞或胚胎时，低拷贝数的mRNA难以被可靠检测。为解决这一问题，可将多个卵母细胞或胚胎合并后进行分析；然而，这种方法通常会导致样本间高度变异。在本方案中，我们描述了采用分支DNA化学技术的荧光原位杂交（FISH）方法。该技术可识别单个细胞内mRNA的空间分布模式。当该技术与Spot Finding and Tracking&#160;计算机软件结合使用时，还可对细胞内mRNA的丰度进行定量。采用此方法可显著降低实验组内的变异程度，并减少检测实验组间显著差异所需的卵母细胞和胚胎数量。市面上可购得的分支DNA单分子FISH试剂盒已优化用于检测载玻片上组织切片或贴壁细胞中的mRNA。然而，卵母细胞无法有效贴附于载玻片，且试剂盒中的某些试剂过于剧烈，会导致卵母细胞裂解。为防止此类裂解，我们对FISH试剂盒进行了多项改进：具体而言，采用专为卵母细胞和胚胎免疫荧光设计的卵母细胞透化液和洗涤&#160;缓冲液替代了试剂盒中的专有缓冲液；透化、洗涤以及探针和扩增剂孵育步骤均在6孔板中进行，最后通过封片介质将卵母细胞转移至载玻片上完成制片。这些改进克服了商用试剂盒的主要局限性，特别是卵母细胞裂解问题。为准确且可重复地计数单个卵母细胞中mRNA的数量，本研究采用了计算机软件辅助分析。综上所述，该方案提供了一种可替代PCR和测序的方法，用于比较单细胞中特定转录本的表达水平。

完成本方案后，将获得共聚焦z系列的单个图像(图4A和图5)、拼接图像(图4C)以及mRNA计数结果(图4B)。进行多重检测时，还将获得显示两种不同mRNA标记的合并图像(图5)。mRNA计数基于使用Fiji生成的拼接图像(图3)，并通过斑点识别与追踪程序对点状荧光信号进行计数而获得(图4B)。
<p class="jove_content" fo:ke...

为了可重复地计数单个卵母细胞中mRNA的数量，已针对非贴壁细胞优化了单分子RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）技术。卵母细胞被收集后，与特定转录本的探针进行杂交，并使用图像定量软件进行定量分析。

利用单分子荧光原位杂交（SM-FISH）定量并定位小鼠卵母细胞中的mRNA

目前用于定量卵母细胞和胚胎中 mRNA 的常规方法包括数字逆转录聚合酶链式反应（dPCR）、……

该技术不仅能够实现候选mRNA在单个卵母细胞和胚胎中的定位，还能对其进行定量分析。与其他检测方法（包括PCR）相比，该技术完成后的数据具有良好的可重复性且变异程度较低。本实验操作将由我实验室的研究生Kelsey Timme进行演示。按照文本方案所述，从准备所需材料和5至8周龄的雌性小鼠开始此操作。用70%乙醇清洁小鼠。暴露腹腔并观察雌性生殖道。用镊子夹住卵巢，去除卵巢周围子宫韧带及多余的脂肪组织。将输卵管从子宫上剪下。然后将卵巢-输卵管配对组织置于35毫米培养皿的温热保存液中。取出卵巢及周围脂肪组织。使用半英寸27号针头撕开输卵管膨大的壶腹部。在撕裂处推动输卵管，即可挤出卵丘细胞-卵母细胞复合体。使用口吸移液管将排出的卵母细胞转移至含有透明质酸酶的100微升持卵液液滴中。为去除卵丘细胞，用口吸移液管在含有透明质酸酶的持卵液中反复吹打处于第二次减数分裂中期的卵母细胞-卵丘细胞复合物。待卵母细胞完全去除卵丘细胞后，使用口吸移液管将每个卵母细胞转移至仅含持卵液的洗涤液滴中。对每个洗涤液滴重复此操作。不要转移破碎或透明的卵母细胞。为进行SM-FISH染色，首先将卵母细胞固定在六孔板的单个孔中，孔内含有500 µL固定缓冲液。将20个或更少的卵母细胞浸入孔中。在室温下用固定缓冲液孵育卵母细胞20分钟。按照文本方案中所述清洗卵母细胞后，在室温下用通透缓冲液孵育卵母细胞30分钟。再次洗涤后，将卵母细胞转移至80微升预稀释的蛋白酶3缓冲液中，在室温下孵育30分钟。将预热的Nanog、Pou5f1和DapB探针组按1:50比例用探针稀释液稀释。将卵母细胞在80微升转录本特异性探针中于40摄氏度孵育2小时。当卵母细胞处于探针和AMP缓冲液中时，它们 tends to float。必须通过轻轻将其推入缓冲液中使其完全浸没。将卵母细胞转移至500 µL洗涤缓冲液中，在室温下孵育10分钟。现在，将卵母细胞依次在扩增缓冲液中孵育。首先，将卵母细胞在 80 µL 的 AMP1 中于 40 °C 孵育 30 分钟。然后将卵母细胞转移至 500 µL 洗涤缓冲液中，在室温下孵育 10 分钟。接下来，将卵母细胞在 80 微升 AMP2 中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。按照之前的方法洗涤卵母细胞后，将卵母细胞在 80 微升 AMP3 中于 40 摄氏度孵育 30 分钟，随后进行最后一次洗涤。最后，将卵母细胞加入 80 微升 AMP4FL 中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。用移液器吸取12微升抗荧光淬灭封片剂，滴加到载玻片中央，注意避免试剂中产生气泡。将卵母细胞连同尽可能少的洗涤缓冲液转移至封片剂中。最后，盖上盖玻片。使用Z步进共聚焦显微镜对三维卵母细胞进行成像，并按照文本方案中所述保存图像。将ND2文件拖入Fiji软件，选择多维图像（Hyperstack）。点击“图像”（Image）选项卡，选择“颜色”（Color），然后点击“拆分通道”（Split Channels）以分离ND2文件中的荧光通道。为每个卵母细胞在各荧光通道中的每个Z轴切片生成单独的TIFF文件。操作方法：单击“Image”选项卡，选择“Stacks”，然后单击“Stack to Images”。接着，再次单击“Image”选项卡，选择“Type”，然后单击“RGB Color”，将每个Z轴切片转换为独立的RGB彩色图像。将每个转换后的图像保存为 TIFF 文件。为避免拼接时混淆，将来自同一个卵母细胞的各荧光通道图像放入一个新文件夹中。按照文本方案中所述归一化文件后，点击 Plugins 选项卡，选择 Stitching，然后点击 Grid Collection。从下拉菜单中选择“连续图像”，然后点击“确定”。浏览目录，选择包含某个卵母细胞在单一波长下所有Z层图像的文件夹，然后点击“确定”。将拼接图像底部的滑块移动到与所用波长对应的适当颜色通道。通过点击图像，选择类型，然后点击RGB颜色，创建最终的RGB拼接图像。将拼接图像转换为32位最大投影图像。为此，请点击“图像”，选择“类型”，然后点击“32位”。将此图像另存为一个新的TIFF文件。在斑点识别与追踪程序中打开该32位拼接图像。选择“局部化”下拉菜单并点击“局部化”，系统将计算图像中检测到的斑点数量。此处显示的是利用斑点识别与追踪功能对 mRNA 进行的定量分析。蓝色箭头指向一个高于阈值的阳性信号。白色箭头指示一个低于阈值的荧光点，因此未被计数。mRNA 计数随后使用标准数据分析工具进行分析。图中显示了 Pouf51 和 Nanog 的中间 Z 系列图像的代表性结果。染色体在中期Ⅱ纺锤体上排列的DAPI染色显示为白色。本方案中收集的数据表明，中期Ⅱ卵母细胞中含有775个Pouf51转录本和113个Nanog转录本。重要的是，在用DapB探针标记的卵母细胞中未检测到任何信号点，该组作为阴性对照。使用非贴壁细胞时，需通过实验确定SM-FISH试剂盒中蛋白酶缓冲液的最佳稀释比例。本研究在1×PBS中采用未稀释及多种稀释浓度的蛋白酶缓冲液进行mRNA检测的梯度实验。本方案所用的蛋白酶稀释比例为1:8，因其在减数分裂II期卵母细胞中Pouf51 mRNA的平均荧光表达水平表现出最低的变异度。可以同时进行目标蛋白的免疫荧光染色，以实现mRNA与RNA结合蛋白的共定位。mRNA与RNA结合蛋白的共定位可使研究人员确定调控卵母细胞或胚胎中mRNA储存、翻译和降解的机制。

use-single-molecule-fluorescent-situ-hybridization-sm-fish-to

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

单分子荧光原位杂交 (SM-FISH) 在小鼠卵母细胞中 Mrna 的定量和定位

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学习单分子荧光原位杂交技术在小鼠卵母细胞中对mRNA进行精确定量和定位的方法。该技术相比PCR等传统方法具有更低的变异性和更高的可重复性，为发育生物学研究提供了可靠的基因表达分析工具。

利用单分子荧光原位杂交（SM-FISH）定量并定位小鼠卵母细胞中的mRNA

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