Name: 使用直接快速免疫性化学测试增强狂犬病监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习直接快速免疫组织化学检测技术用于狂犬病现场诊断，该方法利用普通光学显微镜在一小时内获得结果，为实验室人员和野外生物学家提供经济高效的诊断工具，助力全球狂犬病监测与防控。

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我们感谢所有美国农业部野生动物服务部门的工作人员，他们目前或曾参与加强型狂犬病监测样本的采集，并开展直接快速免疫组化检测（DRIT）以进行狂犬病诊断。同时，我们也感谢众多协助我们完成加强型狂犬病监测样本采集工作的合作人员。此外，我们感谢美国疾病控制与预防中心（CDC）和威斯塔研究所提供开展DRIT所必需的关键试剂，并提供培训机会。我们还感谢美国疾病控制与预防中心以及纽约州卫生部瓦兹沃思中心提供的确诊检测和技术支持。任何商业产品的使用仅用于比较目的，不构成对产品的认可。

每位从事狂犬病诊断检测的人员均应接受标准的暴露前狂犬病疫苗接种程序，并定期进行血清学抗体评估，必要时加强免疫。未接种疫苗的人员不得进入开展此类工作的实验室或区域。所有组织和载玻片的操作均应避免液体气溶胶化或产生空气传播的颗粒。实验室无需强制使用通风橱，但若条件允许，通风橱可额外提供对异味、外寄生虫和骨碎片的防护。在样本采集和检测过程中，必须始终穿戴最低限度的个人防护装备，包括手套和眼部防护装置。
1. 脑干采集
<ol>
	<li>在采集尸体后立即采集脑干样本，或确保将尸体放入冷冻设备中保存以备后续检测。若动物尸体已被冷冻，在采集脑干前应于室温下解冻，以便于操作。在某些情况下，可直接从冷冻状态的动物体内采集样本。</li>
	<li>对于新鲜采集或已解冻至室温的动物，将其仰卧置于平坦表面，颈椎轻微向检查者一侧旋转。通过触诊确定颈椎侧方的枕寰关节。
	<ol>
		<li>对于仍完全处于冷冻状态的尸体，如条件允许，按上述方法将动物仰卧放置。使用锯子、刀具、骨剪或其他类似器械将头部与身体完全分离。 
		注意：所有非一次性使用的器械在处理不同样本之间必须彻底清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手术刀片在枕寰关节水平的腹侧进行切口，切开所有层次的肌肉和软组织，包括气管和食管，直至接近颈椎椎体的前部。对于冷冻组织，使用手术刀片去除残留的肌肉和软组织，暴露枕骨大孔。</li>
	<li>将动物头部置于最大程度的后伸位置，直至可见脑干。使用手术刀片切除所有可见的脑干/中枢神经系统（CNS）组织用于取样。对于冷冻样本，使用手术刀片尽可能从颅腔内刮取冻结的脑干/CNS组织。</li>
	<li>将脑干样本放入不易破碎的容器中（例如金属药膏盒、冻存管等），并做好相应标记。</li>
	<li>确保脑干样本在采集后立即通过DRIT检测进行检测，或在检测前于4 °C冷藏不超过24小时，或于-20 °C冷冻保存，若检测时间在样本采集24小时之后进行。</li>
</ol>
2. DRIT 所需材料的准备
<ol>
	<li>设置10个玻片染色缸（图1） 
	注意：染色缸应足够深，以确保玻片完全浸没（直径96 mm，高度72 mm，深度42 mm，体积250 mL）。6
	<ol>
		<li>在1号缸中加入10%磷酸盐缓冲甲醛溶液。每完成2次检测或每周更换一次甲醛溶液。</li>
		<li>在2、4和5号缸中加入含1% Tween-80的磷酸盐缓冲盐水（TPBS）。每次检测前更换新鲜TPBS。</li>
		<li>在3号缸中加入3%过氧化氢溶液。每次检测前更换过氧化氢溶液。</li>
		<li>在6、8、9和10号缸中加入蒸馏水或去离子水。每次检测前更换水。</li>
		<li>在7号缸中加入Gills苏木精染液#2，按1:1比例用蒸馏水稀释6。每完成2次检测或每周更换一次苏木精染液。 
		注意：根据美国疾病控制与预防中心（CDC）开发的原始DRIT方案12，若复染颜色过深，可采用1:2比例的Gills苏木精染液与水进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氨基乙基咔唑（AEC）储备液的配制
	<ol>
		<li>使用玻璃移液管，将5 mL N,N-二甲基甲酰胺加入玻璃容器中。</li>
		<li>加入一片20 mg的3-氨基-9-乙基咔唑片剂，振荡至完全溶解。在容器上标注“AEC储备液”及配制日期。 
		注意：AEC储备液可在4 °C冷藏保存，使用期限为1-2个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AEC工作液的稀释配制
	<ol>
		<li>向一个15 mL离心管中加入7 mL醋酸盐缓冲液。</li>
		<li>使用玻璃移液管，向离心管中加入0.5 mL AEC储备液。</li>
		<li>向管中加入0.075 mL的3%过氧化氢溶液。</li>
		<li>使用10 mL注射器和0.45 µm注射器滤器过滤该溶液。 
		注意：AEC工作液应在每次DRIT检测前现配，因其稳定性仅为2-3小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 直接快速免疫组织化学检测
<ol>
	<li>使用防涂抹、防水、永久性墨水记号笔，在每张玻璃显微镜载玻片上标注唯一编号以标识每个样本。
	<ol>
		<li>使用手术刀片从容器中取出脑干，并置于纸巾上。用另一张纸巾轻轻吸去多余的液体、血液或毛发，仅保留脑干组织13。如有需要，可对脑干组织进行切片，以暴露其横截面。</li>
		<li>非常轻柔地将显微镜载玻片接触脑干组织的横截面。在多个位置接触脑干组织，过程中避免横向移动，以便将脑干多个区域转移至载玻片上13。确保仅通过轻触将1至2层细胞从脑组织转移至载玻片。无需使用封固剂即可将脑干组织固定在载玻片上。每次DRIT实验均应包含阳性和阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片在室温下自然晾干约5分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入10%缓冲福尔马林溶液中10分钟（第1个培养皿）。</li>
	<li>从福尔马林中取出载玻片，并在TPBS溶液中浸洗（第2个培养皿）。</li>
	<li>将载玻片浸入3%过氧化氢溶液中10分钟（第3个培养皿）。</li>
	<li>从过氧化氢溶液中取出载玻片，在新鲜TPBS溶液中浸洗（第4个培养皿）。去除多余过氧化氢后，将载玻片放入新鲜TPBS溶液中（第5个培养皿），每次操作一张载玻片，其余载玻片保持浸没于TPBS中。</li>
	<li>从TPBS溶液（第5个培养皿）中依次取出载玻片，甩去并用纸巾吸去多余缓冲液，将其放置于实验台湿润的纸巾上，作为“湿室”的基础。使用移液器，在每张载玻片上滴加足量的一抗（抗狂犬病毒抗体），以完全覆盖中枢神经系统（CNS）组织。将载玻片在湿室中（即用孔板或其他简易盖子覆盖放置于湿润纸巾上的载玻片）室温孵育10分钟（图2）。</li>
	<li>从湿室中取出载玻片，甩动并用纸巾吸去多余的一抗，然后在TPBS溶液中浸洗（重复使用第5个培养皿中的TPBS）。</li>
	<li>每次操作一张载玻片，其余载玻片保持浸没于TPBS中——使用移液器滴加足量链霉亲和素-过氧化物酶复合物，以完全覆盖中枢神经系统（CNS）组织。在湿室中室温孵育10分钟。</li>
	<li>从湿室中取出载玻片，甩动并用纸巾吸去多余的复合物，然后在TPBS溶液中浸洗（第5个培养皿）。</li>
	<li>每次操作一张载玻片，其余载玻片保持浸没于TPBS中——甩去并吸去多余缓冲液，使用移液器滴加足量AEC显色液（配制方法见上文，应在使用前立即配制），以完全覆盖中枢神经系统（CNS）组织。在湿室中室温孵育10分钟。</li>
	<li>将载玻片在蒸馏水中浸洗（第6个培养皿）。</li>
	<li>将载玻片放入Gill苏木精复染液中（用蒸馏水按1:1稀释）复染2分钟（第7个培养皿）。</li>
	<li>立即在蒸馏水中浸洗所有载玻片（第8个培养皿），每次更换新鲜蒸馏水，重复两次（第9和第10个培养皿）。</li>
	<li>每次操作一张载玻片，其余载玻片保持浸没于蒸馏水中（第10个培养皿）——甩去并吸去多余水分，使用水溶性封片介质封固盖玻片。</li>
	<li>使用配备20倍物镜的光学显微镜观察载玻片，如需更详细检查，可使用40倍物镜。</li>
</ol>

<ol><li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).</li>
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<li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+public+health+impact+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li>
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<li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).</li>
<li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+rabies+vaccination+in+north+america%3A+opportunities%2C+complexities%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).</li>
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 <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019).</li>
<li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhalid%2C+A+%22Touch+Impression+Cytology+Versus+Frozen+Section+as+Intraoperative+Consultation+Diagnosis%22">Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis</a>. 2, (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

直接快速免疫组化试验（DRIT）是一种灵活的方法，适用于基于现场的狂犬病病毒检测监测，可在分散的实验室区域使用。尽管整个检测过程可以在野外环境下进行（例如在卡车后挡板上操作），但由于涉及化学品、设备和耗材的储存问题，最好设有专门用于DRIT的小型室内空间。此外，必须遵守所有适用的联邦、州和地方关于化学品使用与处置的法律和法规。目前，美国农业部野生动物服务局（USDA WS）设有15个DRIT实验室，用于检测来自17个州的样本。这些DRIT实验室是与大学及州公共卫生实验室合作建立的，设置在大型设施内的指定房间中，或位于经过改造的封闭式拖车中，后者可在发生紧急疫情暴发需要加强狂犬病监测并要求快速出结果时，作为移动检测单元投入使用（图5）。
尽管使用不同质量的脑干组织进行检测已取得成功，但最佳选择是无组织分解的新鲜脑干组织。当组织发生分解、干燥或液化时，样本质量会下降，检测可能出现更多非特异性染色，从而干扰结果判读。这一现象在直接免疫荧光法（DFA）和直接快速免疫组化法（DRIT2）中均类似。脑干/中枢神经系统组织应尽快采集，并在检测前冷冻保存（-20 °C）。
通常，美国农业部野生动物服务部门（USDA WS）的大多数实验室在一次DRIT检测中会同时处理12至24张载玻片，其中包括一张经DFA确认的阳性对照和一张经DFA确认的阴性对照。阳性和阴性对照为每次DRIT检测提供参考基准，以确保检测成功，并在检测载玻片结果存在判读疑问时用于确认。如果某样本无法明确判定为阳性或阴性，则将其标记为不确定结果，并通过DRIT再次检测一次。若该样本经过两次DRIT检测后仍无法明确判定为阳性或阴性，则将其送至参考实验室进行DFA或相关检测。
与任何诊断试验一样，在出现意外结果时进行“故障排查”非常有用。例如，如果DRIT试验运行不成功（即阳性对照未显示出+3或+4的染色强度及抗原分布），应确保所有化学品和试剂均未过期。我们发现，每周至少使用一次新开封的过氧化氢瓶，有助于通过氧化脑组织防止非特异性染色。此外，我们建议无论标签上的有效期如何，乙酸盐缓冲液至少每年更换一次。
与直接荧光抗体检测（DFA）相比，双抗体夹心免疫染色法（DRIT）具有多项优势，包括成本较低、可在非中心化实验室环境中开展检测、仅需普通光学显微镜而非荧光显微镜，以及对实施和判读检测结果人员的培训过程相对简便2,3,4。这些优势，加之DRIT在敏感性和特异性方面与DFA相当2,7,8,9，已充分证明该方法在北美地区大规模强化狂犬病监测项目中是一项重要工具8,10。此外，随着世界动物卫生组织（OIE）和世界卫生组织（WHO）近期将其列为推荐检测方法，DRIT有望在资源有限的发展中国家或其他地区推动监测范围的扩大和检测响应速度的提升。

尽管直接荧光抗体检测法（DFA）是常规狂犬病诊断应用最广泛的检测方法1，但购买和维护荧光显微镜的成本可能对发展中国家2,3,4以及大规模强化狂犬病监测项目3,4构成限制。此外，DFA检测需要在样本固定期间具备冷藏条件，并在抗体-抗原反应过程中将样本孵育于环境温度以上，这在缺乏相应基础设施的国家可能成为重大障碍。部分由于现代DFA检测所存在的局限性，狂犬病的全球影响长期以来一直被低估5。
在这方面，有必要验证更多诊断技术，以在全球范围内改进狂犬病监测，尤其是在发展中国家。本文介绍的DRIT方案提供了一种基于实验室或现场检测的替代方法，可替代直接荧光抗体检测（DFA），其使用光学显微镜，且在检测过程中无需冷藏或实验室孵育6。DRIT与DFA的相似之处在于，两种技术均使用来自疑似狂犬病动物的脑组织样本的触压印片。然而，DRIT的第一步采用甲醛作为样本的传统固定剂，可使狂犬病病毒失活。这相较于DFA方案中用于样本固定的丙酮，显著提高了生物安全性3，这一点不仅在实验室环境中至关重要，在基于现场或分散式实验室环境中可能更为重要。迄今为止，DRIT的敏感性和特异性与DFA相当2,7,8,9。
自2005年以来，美国农业部野生动物服务局（USDA WS）项目在北美地区开展大规模强化狂犬病监测工作，将直接快速免疫组化法（DRIT）作为综合性野生动物狂犬病管理计划的一部分10。强化狂犬病监测作为基于暴露事件的公共卫生监测的补充手段，主要检测未涉及人类或家养动物暴露的野生动物中型食肉动物物种，包括浣熊（Procyon lotor）、条纹臭鼬（Mephitis mephitis）、灰狐（Urocyon cinereoargenteus）、赤狐（Vulpes vulpes）和郊狼（Canis latrans）。用于检测的动物尸体通过强化狂犬病监测项目提交至美国农业部野生动物服务局，这些动物属于狂犬病传播宿主物种，其特征为：出现疾病症状或行为异常；被发现已死亡、死于路杀或被视为滋扰动物；且未与人类或家养动物发生接触。DRIT提供了一种狂犬病诊断检测方法，经培训的野外生物学家即使缺乏或仅有少量实验室经验也可实施该检测，从而提升狂犬病监测能力，并减轻公共卫生诊断实验室的经济负担和工作负荷10。针对美国农业部野生动物服务局野外工作人员的基础DRIT培训通常持续1.5至2天，其中包括约4小时的课堂讲授，内容涵盖生物安全基本原则、样本采集方法及DRIT操作流程，以及&#62;8小时的实验室实操训练。培训机会由美国疾病控制与预防中心（CDC）、LYSSA LLC和沃斯塔研究所向美国农业部野生动物服务局及其合作项目人员提供。
在美国农业部野生动物服务局（USDA WS）的战略管理区域，已使用DRIT检测了超过94,000份野生动物样本，检出1,850多份狂犬病阳性样本，这些样本若仅依赖针对可疑动物的公共卫生暴露检测，极有可能未被发现。DRIT提供的增强型狂犬病监测数据对于更全面地呈现狂犬病在时间和空间上的分布格局至关重要，从而支持全美范围内的野生动物口服狂犬病疫苗接种计划10,11。同样，加拿大的省级野生动物机构也已成功将DRIT纳入大规模野生动物狂犬病监测工作中，并与公共卫生项目协同实施8。美国农业部野生动物服务局和加拿大的DRIT监测项目均利用国家级参考实验室通过DFA方法确认狂犬病感染，并在必要时进行病毒变异株分型8。此外，美国农业部野生动物服务局的野外生物学家将10%的阴性样本送至参考实验室进行DFA复核确认，并自2008年以来，定期参加由威斯康星州卫生实验室提供的每半年一次的DRIT能力验证测试，作为标准质量保证措施的一部分。
该方法的目的是提供一种狂犬病诊断检测的替代方案，可在分散的实验室、现场或无法常规使用电子显微镜的地区进行。

<table><tbody><tr><td>3-氨基-9-乙基咔唑（AEC片剂；50片）</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>乙酸盐缓冲液，0.1 M，pH 5.2，32 oz</td><td>Poly Scientific R&amp;amp;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Ag Tek MiniScalpel，PN110，非无菌#10，每包40个</td><td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td><td>PN110</td><td>用于样本触印的辅助设备；也可通过Clipper Distributing（http://www.clipperdist.net/）获取</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 无针一次性注射器，10 cc</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>14-823-2A</td><td>BD制造商编号 309604</td></tr><tr><td>带Seidentopf目镜头或同等配置的双目光学显微镜</td><td>多个供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色矩形非UN认证废弃容器，5加仑</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01BLU</td><td>用于化学废料储存/处置的辅助设备（吉尔苏木精染液和AEC溶液）</td></tr><tr><td>康宁方形和矩形盖玻片，24×60</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>12-553-465</td><td>康宁制造商编号 2975246</td></tr><tr><td>康宁通用适配移液器吸头：排架式，非无菌（1–200 µL）</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>07-200-300</td><td>康宁制造商编号 4863</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管，聚丙烯材质</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>14-959-70C</td><td>康宁制造商编号 352097</td></tr><tr><td>Falcon 96孔检测板（组织培养板盖）</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>08-772-5</td><td>康宁制造商编号 353910</td></tr><tr><td>Fisher Brand 25 mm 注射器滤器，尼龙材质，0.45 &amp;mu;m，无菌</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Chemical 吉尔法苏木精染液（Gill-2），4 L</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sharps-A-Gator 即用型锐器盒，5夸脱</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>14-827-122</td><td>用于正确设置BSL-2实验室的辅助设备</td></tr><tr><td>含Tris缓冲液的Fluoro-Gel（封片介质），20 mL</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>102092-122</td><td>Fluoro-Gel 可替代BioMeda&amp;trade; Gel-Mount（Electron Microscopy Sciences）</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林，10%，4 L</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>SF100-4</td><td>可单瓶或每箱4瓶购买</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 移液器，50–200 &amp;mu;L</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF9930E</td><td></td></tr><tr><td>Hy-Clone 磷酸盐缓冲液，1×溶液，1 L（PBS）</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>SH30256LS</td><td>也可使用替代的干粉产品</td></tr><tr><td>过氧化氢，3%</td><td>多个供应商</td><td></td><td>任何市售来源，如药店或商店品牌等</td></tr><tr><td>显微镜物镜：20× 和 40×</td><td>多个供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysol IC 季铵盐消毒清洁剂，1加仑</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF8481</td><td>用于BSL-2实验室正确消毒的辅助材料</td></tr><tr><td>Miltex品牌一次性解剖刀，22号（MiniScalpel的替代型号）</td><td>AMD Next (www.amdnext.com)</td><td>999112314</td><td>用于样本触印的辅助设备；Ag Tek MiniScalpel的替代型号</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺，琥珀色玻璃包装，500 mL</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>D119-500</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，50 mL</td><td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td><td>5550-0001</td><td>KPL 免疫分析与试剂盒参考编号 71-00-38</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液干粉（Fisher液体PBS的替代品）</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P3813</td><td>需用1 L去离子水配制；可按1包、10包或50包数量购买</td></tr><tr><td>一抗：多克隆抗核蛋白抗体或抗丽沙病毒生物素化抗体混合物</td><td></td><td></td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>PYREX 一次性血清移液管，玻璃，无菌，带塞，Corning，1.0 mL</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-1</td><td>VWR制造商编号 89091-220</td></tr><tr><td>PYREX 一次性血清移液管，玻璃，无菌，带塞，Corning，10.0 mL</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-10</td><td>VWR制造商编号 89091-106</td></tr><tr><td>PYREX 一次性血清移液管，玻璃，无菌，带塞，Corning，5.0 mL</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>7078D-5</td><td>VWR制造商编号 89091-484</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific 吉尔苏木精染液 No. 2，1品脱（上述产品的替代品）</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>22-050-201</td><td>Thermo Scientific制造商编号 72504</td></tr><tr><td>载玻片架，24位</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>25608-868</td><td>Sakura&amp;reg;Finetek供应商编号 4465；可通过多个供应商获取</td></tr><tr><td>样本锡盒，1/2盎司</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>101412-452</td><td>用于脑组织样本储存的辅助设备</td></tr><tr><td>Taylor 2事件数字计时器/时钟</td><td>多个供应商</td><td></td><td>辅助设备</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 载玻片染色套装</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>25608-902</td><td>Sakura&amp;reg;Finetek供应商编号 4551；可通过多个供应商获取</td></tr><tr><td>TWEEN 80，聚乙二醇，500 mL</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P1754</td><td>也可提供25 mL、1 L和1加仑规格</td></tr><tr><td>VWR FLIP 移液管助吸器（0.05–100 mL）</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>53497-055</td><td></td></tr><tr><td>VWR 柔韧腈检查手套，L号（每盒100只）</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>89038-272</td><td>用于正确个人防护装备（PPE）的辅助设备</td></tr><tr><td>去离子水（20 L）</td><td>VWR，隶属于Avantor (https://vwr.com)</td><td>10806-022</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton 透明玻璃样品瓶，8 mL</td><td>Fisher Scientific（隶属于Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html）</td><td>06-408C</td><td>DWK Life Sciences制造商编号 224884</td></tr><tr><td>白色涂层双孔模式载玻片，14 mm</td><td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td><td>2-140</td><td></td></tr><tr><td>白色矩形非UN认证废弃容器，5加仑</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01WHT</td><td>用于化学废料储存/处置的辅助设备（福尔马林）</td></tr></tbody></table>

增强型狂犬病监测：采用直接快速免疫组织化学检测法

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

基于实验室的监测是狂犬病预防、控制和管理工作的重要组成部分。虽然直接荧光抗体检测法（DFA）是狂犬病诊断的金标准，但仍需验证其他诊断技术以加强狂犬病监测，尤其是在发展中国家。本文介绍一种DRIT的标准操作流程，作为DFA的替代方案，可在实验室或现场使用光学显微镜进行检测。采集自疑似感染动物的脑组织压印涂片需用10%中性缓冲甲醛固定。DRIT采用针对狂犬病毒的特异性单克隆或多克隆抗体（与生物素偶联）、链霉亲和素-过氧化物酶以及显色报告分子（如乙酰-3-氨基-9-乙基咔唑），以检测感染组织中的病毒包涵体。通过DRIT，可在约1小时内完成脑组织样本的检测与结果判读。在北美、亚洲、非洲和欧洲对多种物种的疑似动物脑组织样本进行检测后，DRIT的敏感性和特异性均接近100%，与DFA结果相比具有高度一致性。自2005年以来，美国农业部野生动物服务局（USDA WS）项目已在重点狂犬病管理区域，利用DRIT对野生动物采集的超过&#62;94,000份样本开展了大规模强化狂犬病监测。DRIT是一种强大且经济的狂犬病诊断工具，可供实验室技术人员和野外生物学家使用，以在全球范围内提升当前的狂犬病监测、预防和控制项目。

DRIT 检测的阳性结果可在呈蓝染的细胞胞质内观察到呈红色、形态和大小不一的胞浆内病毒包涵体（图3）。这些包涵体边缘光滑且着色明亮，中心区域染色较浅。当检测到包涵体时，需记录其着色强度和抗原分布情况。着色强度分为 +4 至 +1 四个等级。阳性对照切片应呈现强烈的紫红色荧光，定义为 +4 强度。若样本处理不当（例如组织样本轻微腐败），可能导致颜色轻微减退，此类情况应评定为 +3。若染色明显暗淡，则评定为 +2 至 +1，此类结果不具狂犬病病毒感染的诊断意义，判定为不确定结果。
此外，抗原分布分为+4至+1级，其中+4级表示在中枢神经系统组织印片的每个（或几乎每个）视野中均可见大量大小不一、形态各异的大和小包涵体。阳性对照通常表现为+4级抗原分布。当大多数视野中存在多种尺寸的包涵体，但并非所有视野均可见时，判定为+3级抗原分布。若在10%–50%的显微镜视野中发现包涵体，则判定为+2级抗原分布。当在&lt;10%的显微镜视野中发现包涵体时，则判定为+1级抗原分布。
大多数含有狂犬病毒的中枢神经系统组织表现出典型的病毒包涵体，其染色强度和抗原分布等级为+3或+4。如果检测结果为+2或+1的染色强度，或+2或+1的抗原分布，则该样本判定为“不确定”，需进行重复检测。若同一样本重复检测结果仍为不确定，则应将样本送至参考实验室进行直接荧光抗体检测（DFA）或相关的确证检测。
使用DRIT检测的样本，若在含有中枢神经系统组织的载玻片以200倍或更高倍数放大扫描后未检测到典型的病毒包涵体，则判定为狂犬病病毒抗原阴性（图4）。阴性样本表现为细胞体呈蓝色，几乎无非特异性染色或染色程度很低。
<img alt="使用多种试剂的组织学染色过程、组织样本制备装置、实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于测试的 10 个载玻片染色皿及其所用试剂的设置。 染色皿按操作流程所需顺序标记了相应试剂名称。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于实验室药物测试的细胞培养板设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：利用湿纸巾和细胞培养板制成的简易湿度培养箱。 使用湿纸巾和细胞培养板构建的简易湿度培养箱可用于野外实验。&nbsp; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同密度的染色细胞组织切片显微镜图像，用于组织学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：狂犬病病毒包涵体阳性样本的代表性切片，染色强度为+4，抗原分布为+4。（A 和 B）显示200倍放大下的狂犬病病毒包涵体阳性结果。（C 和 D）显示400倍放大下的狂犬病病毒包涵体阳性结果。比例尺 = 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微镜图像，神经组织分析，显示细胞分布，四联图组织学切片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：无狂犬病病毒包涵体的阴性样本代表性切片。（A 和 B）显示在200倍放大下无狂犬病病毒包涵体的样本。（C 和 D）显示在400倍放大下无狂犬病病毒包涵体的样本。比例尺 = 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野外条件下用于环境研究的移动实验室装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：美国农业部野生动物服务局（USDA WS）使用的DRIT检测设施的代表性照片。（A）用于运输的封闭拖车内的移动检测设施。（B）经改装用于DRIT检测的房车。（C）与大学实验室联合使用的DRIT检测设施。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

直接快速免疫组织化学检测法（DRIT）是被世界动物卫生组织和世界卫生组织（OIE/WHO）认可的狂犬病诊断直接荧光抗体（DFA）检测的替代方法。该检测可在现场应用，利用光学显微镜对脑组织涂片进行检测，约1小时内即可完成。

基于实验室的监测对于狂犬病的预防、控制和管理工作至关重要。虽然直接荧光抗体试验（DFA）是狂犬病诊断的金标准，……

DRIT 具有重要意义，因为它提供了一种狂犬病诊断检测方法，可在野外或无法常规使用电子显微镜的地区的分散化实验室中进行。DRIT 的主要优势在于仅需使用普通的光学显微镜，且结果可在约一小时内获得。DRIT 是一种经济高效的狂犬病诊断工具，可供实验室技术人员和野外生物学家使用，以在全球范围内改进狂犬病的监测、预防和控制项目。对于 freshly 收集或已解冻至室温的动物，将其仰卧置于平坦表面，颈椎轻微向检查者一侧旋转。通过触诊确定颈椎侧方的枕寰关节。使用手术刀片，在枕寰关节水平的腹侧做一切口，穿透所有肌层和软组织，包括气管和食管。继续操作直至接近颈椎椎体的前部。然后将动物头部移至最大限度的伸展位，直至可见脑干。使用手术刀片切除所有可见的脑干和中枢神经系统组织以获取样本。将脑干样本放入不易破碎的容器中，并相应标记。首先，准备足够深的染色缸，以确保样本载玻片能够完全浸入其中。在第一个染色缸中加入10%磷酸盐缓冲福尔马林溶液。将二、四、五号皿中加入 TPBS。将三号皿中加入 3% 过氧化氢。然后将六、八、九、十号皿中加入蒸馏水或去离子水。用蒸馏水按1:1比例稀释吉尔苏木精染液配方二，填充第七个培养皿。制备氨基乙基咔唑储备液时，使用玻璃移液管将5毫升N,N-二甲基甲酰胺加入玻璃容器中，再向其中加入一片120毫克的3-氨基-9-乙基咔唑，振荡至完全溶解。为配制AEC工作液，向一个15毫升离心管中加入7毫升醋酸盐缓冲液。使用玻璃移液管向离心管中加入0.5毫升AEC储存液。再加入0.75毫升3%过氧化氢溶液。使用带有0.45微米注射器滤器的10毫升注射器过滤溶液。首先，使用防污防水的永久性记号笔在玻璃显微镜载玻片上为每个样本标记唯一的编号。使用手术刀片从容器中取出脑干，并将其放置在纸巾上。用第二张纸巾轻轻按压，吸去多余的液体、血液或毛发，以暴露脑干组织。如有需要，对脑干组织进行切片，以暴露其横截面。非常轻柔地将载玻片接触脑干的多个点位，避免横向移动，使脑干多个区域的组织转移到载玻片上，注意仅转移一层或两层细胞即可。 将载玻片在室温下静置晾干约五分钟。然后将载玻片浸入一号培养皿中的10%缓冲福尔马林溶液中固定10分钟。取出载玻片，用二号培养皿中的TPBS溶液进行浸洗漂洗。将冲洗后的玻片浸入第三个培养皿中的过氧化氢溶液中，持续10分钟。随后将玻片从过氧化氢溶液中取出，并在第四个培养皿中的新鲜TPBS中浸洗。去除残留的过氧化氢后，将玻片放入第五个培养皿中的新鲜TPBS中。从第五个培养皿中一次取一张载玻片，轻轻振去并吸干多余的缓冲液，将载玻片放置在实验台面湿润的纸巾上。当所有载玻片转移完毕后，使用滴管或移液器向每张载玻片滴加足量的一抗（抗狂犬病毒抗体），以完全覆盖中枢神经系统组织。用培养板孔或其它简易盖子覆盖载玻片，形成一个湿化 chamber，并在室温下孵育10分钟。此后，从湿盒中取出玻片，振荡并吸去多余的结合物，然后将玻片浸入五号皿中的 TPBS 中进行漂洗。每次处理一张玻片，从 TPBS 中取出一张玻片，用滴管或移液器滴加足量的链霉亲和素-过氧化物酶复合物，以覆盖 CNS 组织。待所有玻片均被覆盖后，在室温下于湿盒中孵育 10 分钟。然后从湿盒中取出玻片，振荡并吸去多余的复合物，将玻片浸入盛于5号培养皿中的TPBS中漂洗。每次操作一张玻片，从TPBS中取出玻片后，用移液器滴加足量AEC工作液以覆盖中枢神经系统组织。将玻片置于湿盒中，室温孵育10分钟。此后，将载玻片浸入第六个培养皿中的蒸馏水中漂洗，然后放入第七个培养皿的Gill苏木精复染液中复染2分钟。立即在第八个培养皿的蒸馏水中漂洗所有载玻片。随后分别用第九和第十个培养皿中的新鲜水各漂洗一次，重复此步骤两次。每次处理一张载玻片，将载玻片从水中取出，轻轻晃动并用吸水纸吸去多余的水分。使用水溶性封片剂将盖玻片固定在载玻片上。然后使用配备20倍物镜的光学显微镜观察载玻片。DRIT 检测的阳性结果显示出位于蓝染细胞胞质内的红色胞浆病毒包涵体，这些包涵体在形态和大小上可能有所不同。包涵体外观光滑，边缘非常明亮，中心区域染色较浅。抗原分布分为从四加到一加四个等级，其中四加表示抗原分布丰富，包含大量大小和形态各异的包涵体，在中枢神经系统组织印片的每个视野中均可见。当大多数但并非所有视野中出现不同大小的包涵体时，抗原分布记为加三分。若在10%至50%的显微镜视野中发现包涵体，则抗原分布记为加二分；当包涵体出现在少于10%的视野中时，记为加一分。大多数含有狂犬病病毒的中枢神经系统组织表现出典型的病毒包涵体，其强度和抗原分布等级为加三分或加四分。如果检测结果显示强度或抗原分布为“+1”或“+2”，则该样本判定为不确定结果，需要重复检测。使用DRIT方法检测时，若含有中枢神经系统组织的载玻片在200倍或更高放大倍数下观察未发现典型的病毒包涵体，则判定该样本为狂犬病病毒抗原阴性。阴性样本表现为细胞体呈蓝色，几乎没有或完全无特异性染色。每位从事狂犬病诊断检测的人员均应接受标准的暴露前狂犬病疫苗接种，并定期进行血清学抗体评估。未免疫的人员不得进入开展此类工作的区域。除操作活体狂犬病毒时需采取的预防措施外，检测中使用的多种试剂也具有危害性。请查阅每种试剂的安全数据表。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用直接快速免疫性化学测试增强狂犬病监测

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一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学染色方法

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