增强型狂犬病监测：采用直接快速免疫组织化学检测法

DRIT 具有重要意义，因为它提供了一种狂犬病诊断检测方法，可在野外或无法常规使用电子显微镜的地区的分散化实验室中进行。DRIT 的主要优势在于仅需使用普通的光学显微镜，且结果可在约一小时内获得。DRIT 是一种经济高效的狂犬病诊断工具，可供实验室技术人员和野外生物学家使用，以在全球范围内改进狂犬病的监测、预防和控制项目。

对于 freshly 收集或已解冻至室温的动物，将其仰卧置于平坦表面，颈椎轻微向检查者一侧旋转。通过触诊确定颈椎侧方的枕寰关节。使用手术刀片，在枕寰关节水平的腹侧做一切口，穿透所有肌层和软组织，包括气管和食管。

继续操作直至接近颈椎椎体的前部。然后将动物头部移至最大限度的伸展位，直至可见脑干。使用手术刀片切除所有可见的脑干和中枢神经系统组织以获取样本。

将脑干样本放入不易破碎的容器中，并相应标记。首先，准备足够深的染色缸，以确保样本载玻片能够完全浸入其中。在第一个染色缸中加入10%磷酸盐缓冲福尔马林溶液。

将二、四、五号皿中加入 TPBS。将三号皿中加入 3% 过氧化氢。然后将六、八、九、十号皿中加入蒸馏水或去离子水。

用蒸馏水按1:1比例稀释吉尔苏木精染液配方二，填充第七个培养皿。制备氨基乙基咔唑储备液时，使用玻璃移液管将5毫升N,N-二甲基甲酰胺加入玻璃容器中，再向其中加入一片120毫克的3-氨基-9-乙基咔唑，振荡至完全溶解。

为配制AEC工作液，向一个15毫升离心管中加入7毫升醋酸盐缓冲液。使用玻璃移液管向离心管中加入0.5毫升AEC储存液。再加入0.75毫升3%过氧化氢溶液。

使用带有0.45微米注射器滤器的10毫升注射器过滤溶液。首先，使用防污防水的永久性记号笔在玻璃显微镜载玻片上为每个样本标记唯一的编号。使用手术刀片从容器中取出脑干，并将其放置在纸巾上。

用第二张纸巾轻轻按压，吸去多余的液体、血液或毛发，以暴露脑干组织。如有需要，对脑干组织进行切片，以暴露其横截面。非常轻柔地将载玻片接触脑干的多个点位，避免横向移动，使脑干多个区域的组织转移到载玻片上，注意仅转移一层或两层细胞即可。

将载玻片在室温下静置晾干约五分钟。然后将载玻片浸入一号培养皿中的10%缓冲福尔马林溶液中固定10分钟。取出载玻片，用二号培养皿中的TPBS溶液进行浸洗漂洗。

将冲洗后的玻片浸入第三个培养皿中的过氧化氢溶液中，持续10分钟。随后将玻片从过氧化氢溶液中取出，并在第四个培养皿中的新鲜TPBS中浸洗。去除残留的过氧化氢后，将玻片放入第五个培养皿中的新鲜TPBS中。

从第五个培养皿中一次取一张载玻片，轻轻振去并吸干多余的缓冲液，将载玻片放置在实验台面湿润的纸巾上。当所有载玻片转移完毕后，使用滴管或移液器向每张载玻片滴加足量的一抗（抗狂犬病毒抗体），以完全覆盖中枢神经系统组织。用培养板孔或其它简易盖子覆盖载玻片，形成一个湿化 chamber，并在室温下孵育10分钟。

此后，从湿盒中取出玻片，振荡并吸去多余的结合物，然后将玻片浸入五号皿中的 TPBS 中进行漂洗。每次处理一张玻片，从 TPBS 中取出一张玻片，用滴管或移液器滴加足量的链霉亲和素-过氧化物酶复合物，以覆盖 CNS 组织。待所有玻片均被覆盖后，在室温下于湿盒中孵育 10 分钟。

然后从湿盒中取出玻片，振荡并吸去多余的复合物，将玻片浸入盛于5号培养皿中的TPBS中漂洗。每次操作一张玻片，从TPBS中取出玻片后，用移液器滴加足量AEC工作液以覆盖中枢神经系统组织。将玻片置于湿盒中，室温孵育10分钟。

此后，将载玻片浸入第六个培养皿中的蒸馏水中漂洗，然后放入第七个培养皿的Gill苏木精复染液中复染2分钟。立即在第八个培养皿的蒸馏水中漂洗所有载玻片。随后分别用第九和第十个培养皿中的新鲜水各漂洗一次，重复此步骤两次。

每次处理一张载玻片，将载玻片从水中取出，轻轻晃动并用吸水纸吸去多余的水分。使用水溶性封片剂将盖玻片固定在载玻片上。然后使用配备20倍物镜的光学显微镜观察载玻片。

DRIT 检测的阳性结果显示出位于蓝染细胞胞质内的红色胞浆病毒包涵体，这些包涵体在形态和大小上可能有所不同。包涵体外观光滑，边缘非常明亮，中心区域染色较浅。抗原分布分为从四加到一加四个等级，其中四加表示抗原分布丰富，包含大量大小和形态各异的包涵体，在中枢神经系统组织印片的每个视野中均可见。

当大多数但并非所有视野中出现不同大小的包涵体时，抗原分布记为加三分。若在10%至50%的显微镜视野中发现包涵体，则抗原分布记为加二分；当包涵体出现在少于10%的视野中时，记为加一分。大多数含有狂犬病病毒的中枢神经系统组织表现出典型的病毒包涵体，其强度和抗原分布等级为加三分或加四分。

如果检测结果显示强度或抗原分布为“+1”或“+2”，则该样本判定为不确定结果，需要重复检测。使用DRIT方法检测时，若含有中枢神经系统组织的载玻片在200倍或更高放大倍数下观察未发现典型的病毒包涵体，则判定该样本为狂犬病病毒抗原阴性。阴性样本表现为细胞体呈蓝色，几乎没有或完全无特异性染色。

每位从事狂犬病诊断检测的人员均应接受标准的暴露前狂犬病疫苗接种，并定期进行血清学抗体评估。未免疫的人员不得进入开展此类工作的区域。除操作活体狂犬病毒时需采取的预防措施外，检测中使用的多种试剂也具有危害性。

请查阅每种试剂的安全数据表。