一种无需酶解法分离与扩增人脂肪源性间充质干细胞的方法
2019年12月16日
本方案提供了一种无需使用酶消化的方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离间充质干细胞。该方法避免了剧烈的酶处理或离心步骤，所获得的干细胞更符合临床应用需求，可用于体外研究或重新返回临床应用。
本方案提供了一种简单且经济有效的方法，用于分离脂肪源性基质细胞（ASCs），无需使用剧烈的酶解或离心步骤，从而避免了对细胞表型和行为的改变。由于避免了剧烈处理步骤，所获得的细胞受人为干预更少，相较于使用酶解和离心法分离的细胞，可最大限度地减少实验观察结果是否为分离方法所导致的人工假象的疑问。该组织块培养法可获得具有临床应用价值的ASCs，可用于患者体内以治疗多种疾病，或在生命科学研究中进行扩增和应用。
用文字完整描述切碎组织的方法较为困难。通过可视化演示，可帮助其他科研人员免去自行摸索组织分离技术的麻烦。类似的组织块法也可用于分离其他来源的间充质干细胞（MSCs），例如脐带组织来源的间充质干细胞。
将腹壁成形术组织样本剪碎时，首先将组织转移至无菌100毫米培养皿的皿盖中。然后用无菌针固定一块组织，再用无菌手术刀将组织切成小于1毫米的碎块。将组织转移至新的离心管中，并颠倒或轻轻振荡样品5至6次，以确保各层充分混匀。
然后，使用无菌刮勺将 2.5 至 5 毫升组织转移至一个 100 毫米经真空气体等离子体处理的组织培养皿中。通过将组织倒入新的离心管中，测量样品的体积。接着，向培养皿中加入与组织体积相等的组织培养基，并轻轻晃动培养皿以混匀内容物。
将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育，直至在培养板底部观察到足够数量的细胞。一旦培养板上出现足够数量的细胞，或七天后（以先到者为准），移除所有残留的组织块。随后，将ASCs在组织培养基中继续培养，直至细胞达到70%融合度，或细胞簇变得致密，此时应进行传代。
用1×磷酸盐缓冲液轻轻冲洗培养板。消化贴壁细胞时，吸去磷酸盐缓冲液，每块培养板加入1毫升含0.25% EDTA的胰蛋白酶溶液，在37°C孵育5分钟。向培养板中加入少量培养基以终止胰蛋白酶消化。
然后从培养板顶部向下轻轻吹打培养基中的胰酶，使贴壁不牢的细胞脱离培养板。接种细胞时，先向培养板中加入培养基，再以滴加方式加入细胞，随后轻轻摇晃培养板，确保细胞在板内均匀分布。
经过三次传代后，进行流式细胞术和分化检测。经过三次传代后，从脂肪抽吸物和腹部成形术样本中分离得到的ASCs表现出类似于经酶消化法分离的ASCs的MSC形态和表型。与其他MSCs相似，通过组织块法分离的ASCs呈CD45阴性，CD73、CD90和CD105阳性。
在切碎组织时，每块组织的表面积必须足够大，以利于脂肪来源的干细胞（ASCs）从组织中迁移出来。这些是具有广泛用途的基础性干细胞。分离得到的ASCs可用于任何后续应用，无论是体内还是体外实验。
概述
本方案介绍了一种无需使用酶的分离方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离脂肪来源的干细胞（ASCs）。该方法最大限度地减少了对细胞的操作，确保获得适用于多种应用的具有临床相关性的干细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 细胞分离技术
背景
- 传统的分离ASC方法通常涉及使用强烈的酶和离心步骤。
- 这些方法可能改变细胞表型和行为。
- 组织块法提供了一种更温和的替代方案。
- 可视化演示有助于理解组织剪切过程。
研究目的
- 建立一种经济高效且简便的ASCs分离方法。
- 降低因剧烈分离技术导致实验观察中出现假象的风险。
- 获得具有临床应用价值的ASCs用于治疗用途。
使用的方法
- 将切碎的腹部整形手术组织在组织培养板中进行培养。
- 细胞在37°C、含CO2的环境中孵育。
- 待细胞充分生长后，移除残留的组织碎片。
- 对细胞进行传代培养，并鉴定干细胞标志物。
主要结果
- 通过组织块法分离的ASCs表现出与酶消化法获得的细胞相似的形态学特征和表型。
- 组织块法分离的ASCs表达CD73、CD90和CD105，但不表达CD45。
- 该方法获得的细胞受人为操作影响较小，可提高实验的可靠性。
- ASCs可用于多种体内和体外的下游应用。
结论
- 外植体法是分离ASCs的一种可行替代方法。
- 该技术比传统方法更能保持细胞特性。
- 分离获得的ASCs在科研和临床应用中具有广泛潜力。
常见问题
行业重要性概述
这种无需酶解的分离方法解决了再生医学领域的一个关键难题：在不引入剧烈酶解或机械处理所导致的人为干扰的情况下，获取具有临床相关性的间充质干细胞。通过保持细胞原有的表型和功能，该方法提高了在疾病建模和药物筛选等下游应用中的预测可靠性。该方法适用于早期发现阶段的研究流程，其中生物学风险评估和靶点验证依赖于可靠且经最少干预的细胞来源。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：利用保留多向分化潜能和表面标志物谱型的脂肪来源干细胞，可对治疗假设进行验证。
- 操作价值：通过消除酶诱导的表型改变，降低实验结果的变异性。
- 预测价值：生成经较少操作的细胞用于靶点验证实验，有助于降低生物学风险。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可制备适用于标准化体外检测的脂肪来源干细胞，满足对一致间充质表型的需求。
- 操作价值：通过基于组织块的扩增方法维持CD73、CD90和CD105的阳性表达，便于检测前的细胞准备。
- 可扩展性：支持可重复的细胞生产，适用于化合物筛选和机制研究。
转化与临床前研究
- 转化连续性：提供与再生医学应用相契合的具有临床相关性的细胞来源。
- 临床前模型：可在无需暴露于异源性酶的条件下，生成用于疾病相关研究系统的脂肪来源干细胞。
- 机制性风险降低：减少因分离过程产生的人工假象对细胞分化能力或免疫调节功能评估所带来的影响。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期干细胞分离到临床前验证的整个发现流程，支持细胞来源完整性影响数据可靠性及决策（继续/终止）的研究流程。
- 发现生物学：通过提供具有类原生形态和表型的脂肪来源干细胞，支持假设验证。
- 筛选：为需要间充质基质细胞特性的检测平台提供标准化、可扩增的细胞。
- 分析：在三次传代后进行流式细胞术和分化检测，以确认干细胞身份。
- 转化研究：通过保留具有临床相关性的细胞特性，将细胞分离与治疗潜力相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用、无需酶解的脂肪来源干细胞生产平台，适用于多个项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少干细胞实验中因分离导致的人工假象，提高预测的可信度。
- 操作价值：提供一种经济、简便的方案，无需依赖昂贵的酶或离心步骤。
- 战略价值：通过提高基于细胞检测结果的可信度，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：提供可靠的间充质干细胞用于临床前评估，支持基于风险调整的项目推进。
实施注意事项
- 需要无菌操作技术和基本的组织培养设备，用于机械切割和组织块培养。
- 依赖无菌器械，包括手术刀、针头和刮匙，用于组织制备。
- 需要在37°C、5% CO2条件下进行标准化培养，以获得最佳的细胞迁移生长。
- 在初始组织移除后，根据细胞融合度或细胞簇密度进行人工传代。
- 依赖流式细胞术和分化鉴定实验，在分离后对细胞表型进行确认。
