Name: 台湾蝙蝠种群感染病毒监测的标准操作程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 了解台湾蝙蝠种群中狂犬病毒监测的标准操作程序，学习样本采集、抗原检测和数据分析方法。该方案有助于研究人员有效开展病毒监测并提升人畜共患病防控能力。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢李天成、林怡堂、蔡佳蓉和李雅岚在本研究中的协助。本研究由台湾行政院农业委员会动植物防疫检疫局资助，资助编号为107AS-8.7.1-BQ-B2（1）。

1. 处理狂犬病毒时的安全预防措施
<ol>
	<li>确保所有处理蝙蝠样本的实验室工作人员均接受暴露前狂犬病预防接种17。在操作前监测工作人员的狂犬病抗体水平，并每6个月复查一次17。对于抗体水平低于0.5 IU/mL者，需进行加强狂犬病疫苗接种17。</li>
	<li>根据实验室所在国家的生物安全法规，确保以下操作在相应生物安全等级的实验室中进行（例如在中国台湾地区为BSL-2实验室，澳大利亚为BSL-3实验室），且工作人员具备当前有效的资质并穿戴适当的个人防护装备18。 
	注意：狂犬病疫苗对属于基因群II和III的丽沙病毒提供的保护作用极低或无保护作用18。必须告知工作人员，已在蝙蝠中鉴定出多种人畜共患病原体19，因此应在相应生物安全等级的实验室条件下，穿戴适当的个人防护装备处理样本。</li>
</ol>
2. 样本采集
<ol>
	<li>使用发现的虚弱、患病的蝙蝠或蝙蝠尸体。 
	注意：虚弱或患病的蝙蝠将被送往台北蝙蝠保育协会接受兽医护理或用于研究，而蝙蝠尸体则直接提交至动物健康研究所。本监测项目中未对任何健康蝙副实施安乐死。</li>
	<li>由蝙蝠生态学家通过形态学特征鉴定蝙蝠物种20。</li>
	<li>当检测到丽沙病毒阳性时，采用已发表的实验方法对蝙蝠物种进行DNA条形码分析21。</li>
	<li>提交每具蝙蝠尸体的信息表（采集地点、物种、临床症状等）。</li>
</ol>
3. 蝙蝠标本的尸体解剖
<ol>
	<li>准备材料。
	<ol>
		<li>准备一个干净的解剖板，并放置无菌吸水垫用于解剖。</li>
		<li>准备用于采集蝙蝠器官的收集管。</li>
		<li>准备一次性镊子和手术刀用于解剖。在每只蝙蝠解剖之间更换工具。准备用70%乙醇润湿的棉球，用于采样过程中清洁镊子和手术刀。</li>
		<li>准备两张显微镜载玻片用于荧光抗体检测（FAT）。采集新鲜标本，并将其固定于福尔马林溶液中以进行组织病理学检查。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖前检查所有外部开口。拍摄蝙蝠的外部特征照片，特别是头部、耳朵和翅膀，以用于物种鉴别。</li>
	<li>采集口腔拭子样本。将蝙蝠腹侧朝下放置在解剖板上，并用镊子固定其头部。用手术刀沿颅顶正中线切开皮肤，并将皮肤向两侧拉开。用手术刀沿颅顶正中线切开颅骨，并用镊子将其打开，暴露脑组织。</li>
	<li>将脑组织从颅腔中取出，置于无菌压舌板上，并从脑组织制备印迹涂片（见步骤4.2）。取少量新鲜脑组织，固定于福尔马林中用于组织病理学检查。将剩余脑组织放入收集管中，用于核酸提取。</li>
	<li>使用70%乙醇润湿的棉球清洁镊子和手术刀，以在标本采集过程中去除残留组织。</li>
	<li>将蝙蝠背侧朝下放置在解剖板上，并用针在腋下和尾跟两侧将其固定在板上。</li>
	<li>从下颌至肛门沿身体正中线切开皮肤。用镊子提起并分离皮肤及下方肌肉组织。采集靠近下颌骨的唾液腺。</li>
	<li>用镊子轻轻抬起胸骨，用手术刀沿正中线切开胸骨和腹壁。用手术刀切断锁骨。用针将左右肋骨固定在解剖板上，以打开胸腔。</li>
	<li>记录大体病变及死后自溶程度。</li>
	<li>使用镊子和手术刀从尸体中取出内脏组织（即心脏、肺、肝、肾、肠道）。根据未来研究需要采集内脏标本。 
	注：建议采集双份样本。一份用于分子诊断，另一份应加入或不加入病毒运送培养基后于-80 °C冷冻保存，用于病毒培养22。</li>
</ol>
4. 直接荧光抗体检测（FAT）
<ol>
	<li>对脑组织进行压印涂片以进行荧光抗体试验（FAT）。按照先前所述方法进行FAT18,23，但作如下修改。</li>
	<li>用镊子轻轻将脑组织与相连的神经组织分离，并将脑组织转移至无菌压舌板上。切取包含脑干和小脑的脑组织横截面18,23。通过轻触脑组织切面进行压印涂片，并将载玻片压在镜头纸上以去除多余组织。</li>
	<li>用丙酮在 -20 °C 下固定载玻片 30 分钟。在用结合物染色前，将待检样本载玻片以及阳性和阴性对照载玻片干燥。</li>
	<li>强烈推荐使用两种市售的FITC标记抗狂犬病病毒抗体对丽沙病毒抗原进行染色23。首次染色前应确定市售结合物的工作浓度。将稀释后的结合物经0.45 μM针头滤器滴加到载玻片上，置于湿盒中于37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>孵育后，倾去载玻片上多余的结合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片。</li>
	<li>在载玻片上滴加少量10%甘油，加盖盖玻片。</li>
	<li>用荧光显微镜观察载玻片。</li>
</ol>
5. 核酸提取
<ol>
	<li>向脑组织中加入适量体积的 MEM-10（添加 10% 胎牛血清的最低必需培养基），使组织浓度达到 10%（w/v）。</li>
	<li>使用 5 mm 钢珠在匀浆仪中匀浆脑组织，然后以 825 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>使用市售的全自动总核酸提取试剂盒，从 200 μL 上清液中提取核酸，最终洗脱体积为 50 μL。</li>
</ol>
6. 逆转录 PCR 与系统发育分析
注意：已有多种引物组发表，可用于检测所有已知的丽沙病毒或特定的丽沙病毒。此处描述的方案仅为本实验室所使用的一个示例，可能并不适用于所有实验需求。请根据实验室的具体需要选择合适的引物。
<ol>
	<li>按如下方法配制一步法 RT-PCR 试剂：将 5 μL 提取的核酸加入反应体系中，反应体系包含 2.5 μL 10x 反应缓冲液、0.5 μL 正向引物和反向引物（各 10 μM）、4 μL 1.25 mM dNTP、0.3 μL RNase 抑制剂（40 U/µL）、0.3 μL 逆转录酶（10 U/µL）、0.4 μL DNA 聚合酶（5 U/µL）以及 11.5 μL 经 DEPC 处理的水。 
	注意：本方案中使用的引物组为 JW12（5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3'）和 N165-146（5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3'）24。应根据所使用的引物组调整试剂配制和扩增条件。</li>
	<li>在以下条件下进行扩增循环：42 °C 孵育 40 分钟；94 °C 初始变性 10 分钟；进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、55 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。</li>
	<li>使用其他一种或多种引物组以提高诊断灵敏度。
	<ol>
		<li>使用 N113F（5'-GTAGGATGCTATATGGG-3'）和 N304R（5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3'）25,26 配制一步法 RT-PCR 试剂：将 5 μL 提取的核酸加入反应体系中，反应体系包含 5 μL 10x 缓冲液、5 μL 正向引物和反向引物（各 4 μM）、5 μL 1.25 mM dNTP、0.5 μL RNase 抑制剂（40 U/µL）、0.2 μL 逆转录酶（10 U/µL）、1 μL DNA 聚合酶（5 U/µL）以及 23.3 μL 经 DEPC 处理的水。</li>
		<li>在以下条件下进行扩增循环：42 °C 孵育 40 分钟；95 °C 初始变性 5 分钟；进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 1 分钟、55 °C 退火 1 分 20 秒、72 °C 延伸 1 分钟；最后在 72 °C 延伸 10 分钟。 
		注意：根据实验室需求选择合适的引物用于诊断。N113F 最初设计用于狂犬病病毒扩增，但可能对其他丽沙病毒效果不佳。N113F 与 N304R 引物组对狂犬病病毒（中国台湾雪貂獾变异株）和中国台湾蝙蝠丽沙病毒具有良好扩增效果。若上述两组引物均可扩增出丽沙病毒，则联合使用 JW12 与 N304R 引物组更易获得完整的核蛋白基因序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PCR 产物通过 2% 琼脂糖凝胶电泳进行分析，并在紫外光下观察成像。</li>
	<li>将 PCR 产物送至商业测序服务机构进行测序。</li>
	<li>将测序结果输入或上传至核苷酸基本局部比对搜索工具（BLAST）网页。选择 &#34;others (nr etc.)" 数据库，并将生物体设置为 Lyssavirus。选择 MegaBlast 算法并运行 BLAST 分析。</li>
</ol>
7. 病毒分离
注意：当 FAT 或 RT-PCR 检测任一结果为阳性时，进行病毒分离。
<ol>
	<li>将脑组织样本在 MEM-10 中制成 10% (w/v) 的悬浮液并匀浆。在 825 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>取 200 µL 上清液与 1 mL MEM-10 中含 3 × 106 个 MNA（小鼠神经母细胞瘤）细胞的悬浮液混合，于 37 °C、含 1% CO2 条件下孵育 1 小时。将脑匀浆-细胞悬浮液转移至 25 cm2 培养瓶中，并加入 6 mL MEM-10。</li>
	<li>同时，将 1 mL 脑匀浆-细胞悬浮液接种于带有直径 6 mm 孔的四孔特氟龙包被玻片中进行培养。</li>
	<li>在 37 °C、含 1% CO2 条件下孵育 3–4 天后，用 100% 丙酮（v/v）固定四孔玻片上的细胞。</li>
	<li>按照步骤 4.4–4.7 使用两种 FITC 标记的抗狂犬病病毒抗体对玻片进行染色。当观察到胞质内包涵体时，表明细胞已被感染。记录感染细胞的百分比。</li>
	<li>当玻片染色结果为阴性时，对已接种的细胞培养物进行胰蛋白酶消化和传代：
	<ol>
		<li>移除培养基，并用 5 mL PBS 清洗培养瓶。</li>
		<li>向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶，并用力敲击瓶底。</li>
		<li>加入 6 mL MEM-10，重悬细胞。</li>
		<li>将细胞悬浮液转移至新的组织培养瓶（6 mL）和四孔玻片（1 mL）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 7.4–7.6，直至达到 100% 感染率。</li>
	<li>孵育 24 小时后收集上清液。</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本实验室标准操作程序（SOP）提供了一套用于检测中国台湾蝙蝠样本中丽沙病毒抗原的系列流程。关键步骤包括使用荧光抗体试验（FAT）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。合适的样本选择以及病毒的成功分离也至关重要。此外，在蝙蝠丽沙病毒监测过程中还进行了一些问题排查。主要区别在于目标动物的不同。最初（2008–2009年），蝙蝠丽沙病毒监测的目标动物为活体蝙蝠，这些蝙蝠在中国台湾金门岛被捕获，经安乐死后进行丽沙病毒检测。大多数被捕获的蝙蝠健康状况良好，携带丽沙病毒的可能性较低，且此种监测方式不符合动物福利原则。因此，从第三年开始，仅收集死亡或濒死的蝙蝠，并将监测范围从区域性扩展至全国性。经过连续八年的监测，中国台湾最终首次检测到蝙蝠丽沙病毒病例。
尽管荧光抗体技术（FAT）是狂犬病诊断最广泛使用的方法，并被世界动物卫生组织（OIE）和世界卫生组织（WHO）推荐18，但已有少数研究显示，当FAT中使用不同的结合物时，结果存在不一致的情况5,<sup class="xref...

狂犬病毒属（Lyssavirus）的病毒是人畜共患病原体。目前已发现至少有七种狂犬病毒属物种与人类病例相关1。除该属已确认的16个物种外1,2,3，最近还在蝙蝠中鉴定出中国台湾蝙蝠狂犬病毒（Taiwan bat lyssavirus, TWBLV）4和科塔拉赫蒂蝙蝠狂犬病毒（Kotalahti bat lyssavirus）5，但它们的分类地位尚未确定。
除莫科拉丽沙病毒（Mokola lyssavirus）和伊科马丽沙病毒（Ikoma lyssavirus）外，大多数丽沙病毒的自然宿主均为蝙蝠，而莫科拉丽沙病毒和伊科马丽沙病毒迄今尚未在任何蝙蝠中被发现1,2,3,6。关于亚洲蝙蝠中丽沙病毒的信息仍然有限。已有报道在亚洲蝙蝠中发现两种尚未明确分类的丽沙病毒（一种来自印度，另一种来自泰国）7,8。2002年在中国报告了一例与蝙蝠咬伤相关的人类狂犬病病例，但该诊断仅基于临床观察9。在中亚地区，1991年在吉尔吉斯斯坦的小鼠耳蝠（Myotis blythi）中发现了阿拉万丽沙病毒（Aravan lyssavirus），2001年在塔吉克斯坦的须鼠耳蝠（Myotis mystacinus）中发现了胡占德丽沙病毒（Khujand lyssavirus）10。在南亚地区，2015年在斯里兰卡的印度狐蝠（Pteropus medius）中发现了甘诺鲁瓦蝙蝠丽沙病毒（Gannoruwa bat lyssavirus）3。在东南亚地区，菲律宾、泰国、孟加拉国、柬埔寨和越南的多项蝙蝠血清学研究显示血清阳性率存在差异11,12,13,14,15。尽管2012年在中国吉林省的白斑长舌蝠（Murina leucogaster）中发现了伊尔库特丽沙病毒（Irkut lyssavirus）16，但东亚地区蝙蝠种群中丽沙病毒的确切物种及其分布地点仍不清楚。
为评估中国台湾蝙蝠种群中丽沙病毒的存在情况，启动了一项监测计划，采用直接免疫荧光抗体试验（FAT）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）两种方法。2016–2017年，在两例日本小蝙蝠（Pipistrellus abramus）中鉴定出中国台湾蝙蝠丽沙病毒4。本文介绍了一套针对中国台湾蝙蝠种群开展丽沙病毒监测的实验室标准操作程序。本实验室蝙蝠丽沙病毒诊断的流程图见图1。

<table><tbody><tr><td>2.5% 胰蛋白酶 (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>胰蛋白酶</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>NIHON SHIYAKU REAGENT</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素(100X)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>化学发光系统</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>收集管</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>收集管</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>DNA 分析仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC 抗狂犬病单克隆球蛋白</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>FITC 标记的抗狂犬病抗体：试剂 B</td></tr><tr><td>四孔特氟龙涂层玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳系统</td><td>Major Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>胰蛋白酶</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS 狂犬病 FAT 试剂</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>FITC 标记的抗狂犬病抗体：试剂 A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact 仪器</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact 核酸分离试剂盒 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM 维生素溶液</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>针头</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>引物合成</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>测序服务</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>不锈钢珠</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>无菌吸水垫</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>压舌板</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td>122246</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Tennyson medical Instrument developing CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸泰乐菌素</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

中国台湾蝙蝠种群狂犬病毒属监测的标准操作规程

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

狂犬病毒属（Lyssavirus）病毒是人畜共患病原体，至少有七种狂犬病毒属物种与人类感染病例相关。由于蝙蝠是大多数狂犬病毒属病毒的天然宿主，自2008年起，中国台湾已开展针对蝙蝠的狂犬病毒属监测项目，以了解这些病毒在蝙蝠中的生态学特征。在该项目中，非政府蝙蝠保护组织与地方动物疾病控制中心合作，收集死亡蝙蝠或因虚弱、疾病而濒临死亡的蝙蝠。通过尸体解剖获取蝙蝠脑组织，并采用直接荧光抗体检测法（FAT）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测狂犬病毒属抗原和核酸。对于FAT检测，建议使用至少两种不同的狂犬病诊断用荧光结合物。对于RT-PCR检测，采用两组引物（JW12/N165-146，N113F/N304R）扩增狂犬病毒属核蛋白基因的部分序列。该监测项目对蝙蝠中的狂犬病毒属及其他重要人畜共患病原体进行持续监控。2016至2017年间，在两只日本伏翼蝙蝠（Pipistrellus abramus）中发现了中国台湾蝙蝠狂犬病毒。这些发现应引起公众、卫生专业人员及科学界对接触蝙蝠及其他野生动物潜在风险的重视。

2014年至2017年5月期间，共采集了来自13个物种的332具蝙蝠尸体用于监测。其中两例检测结果为阳性。在第一例蝙蝠病例中，使用一种商用FITC标记的抗狂犬病抗体通过FAT检测脑组织压片结果为阴性（图2），而采用两对引物（JW12/N165-146、N113F/N304R）进行的RT-PCR均获得阳性结果（图3）。获得了一段428 bp的扩增片段序列（使用N113F/N304R引物扩增，包含部分核蛋白基因）。该序列通过GenBank数据库进行BLAST比对分析，结果显示该序列与丽沙病毒属病毒相似，但同源性低于79%（图4），支持所检测到的病毒为丽沙病毒属成员。
随后，从这两个脑组织中成功分离出两种丽沙病毒，并通过荧光抗体检测法（图5）和测序分析确认了病毒的存在。根据序列分析结果，鉴定出的丽沙病毒被命名为中国台湾蝙蝠丽沙病毒（Taiwan bat...

本方案介绍了在中国台湾蝙蝠中进行狂犬病病毒属抗原诊断检测的标准实验室操作程序。

狂犬病病毒属（Lyssavirus）的病毒是人畜共患病原体，至少有七种狂犬病病毒属物种与人类病例相关。由于蝙蝠是……

丽沙病毒是一种人畜共患的病原体。为评估丽沙病毒在中国台湾蝙蝠种群中的存在情况，我们启动了一项监测计划。该计划在2016年至2018年期间成功鉴定出四种丽沙病毒。本方案是关于中国台湾地区狂犬病病毒属监测的逐步操作指南。我们希望该方案能为对狂犬病病毒属监测感兴趣的研究人员提供帮助。正确连接相应的标签符号至关重要。对于狂犬病毒监测而言，死亡或濒死的蝙蝠比活体蝙蝠更适合作为样本。根据实验室所在国家的生物安全规定，在相应生物安全等级的实验室中进行以下操作，并确保研究人员具备当前有效的资质，且穿戴适当的个人防护装备。在采集虚弱或生病的蝙蝠个体或尸体时，应由蝙蝠生态学家根据标本的形态学特征鉴定蝙蝠物种。向实验室提交信息表，内容包括每只蝙蝠标本的采集地点、物种、临床症状及其他相关数据。在开始尸体剖检前，检查所有外部开口，并拍摄蝙蝠的外部特征照片，尤其是头部、耳朵和翅膀，以用于物种区分。采集口腔拭子样本时，将蝙蝠置于无菌解剖板上呈仰卧位，并用镊子固定头部。使用解剖刀沿小腿区域中线切开皮肤，将皮肤向两侧拉开，沿小腿区域中线在颅骨上做切口。用镊子打开颅骨以暴露脑组织，并用镊子轻轻将脑组织与相连的神经组织分离。切取包含脑干和小脑的脑组织横切面，轻轻将脑组织切面接触载玻片，制备涂片压印。将载玻片按压在镜头纸上以去除多余组织，随后将涂片压印载玻片置于-20°C的丙酮中固定30分钟。然后，取一小块新鲜脑组织用福尔马林固定，用于组织病理学检查。将剩余组织放入emi-em 10中用于核酸提取。接下来，沿身体中线从下颌至肛门切开皮肤，用镊子提起并分离皮肤及皮下肌肉组织，以便采集位于下颌骨附近的唾液腺。用镊子轻轻抬起胸骨，使用解剖刀沿中线切开胸骨和腹壁，并切断锁骨。使用针具将左右肋骨固定在解剖板上，以打开胸腔。记录肉眼可见的病灶及死后变化程度。然后根据预定的后续分析需求，使用镊子和解剖刀适当去除内脏组织。在固定结束时进行直接荧光抗体检测，将涂片压印玻片干燥，并为分析选择至少两种荧光标记的抗狂犬病病毒抗体。将每种抗体分别通过0.45微米滤器过滤后加至一张玻片上。然后将玻片置于湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，倒掉多余的偶联物，并用 PBS 洗涤载玻片。然后用少量 10% 甘油将盖玻片封片于载玻片上，并通过荧光显微镜观察载玻片。当荧光抗体检测或 RT-PCR 分析显示阳性时，将脑组织标本在 emi-en 10 中制成 10% 悬液并匀浆，再通过离心快速沉淀组织。将200微升上清液与3×10⁶个鼠源神经母细胞瘤细胞以及1毫升EMI-EN 10在37摄氏度、1%二氧化碳条件下孵育1小时。将脑组织匀浆细胞悬液转移至含有6毫升新鲜EMI-EN 10的25平方厘米培养瓶中。取1毫升脑组织匀浆细胞悬液加入四孔特氟龙包被的玻璃载片中，每孔直径为6毫米，并将载片置于37摄氏度、1%二氧化碳环境中培养3至4天。用100%丙酮固定后，使用与荧光抗体试验相同的两种荧光标记抗狂犬病病毒抗体对玻片进行染色，并通过荧光显微镜观察玻片，以确定胞浆内包涵体的数量。根据标准操作规程对接种后的细胞培养物进行胰酶消化和传代后，将低温培养物重新放入细胞培养孵育箱中继续培养三至四天，并重复计数感染细胞数量（方法如前所述），直至感染率达到100%。2014年1月到2017年5月期间，共采集了来自13个物种的332具蝙蝠尸体用于监测。在本研究对两例阳性蝙蝠病例的代表性分析中，使用一种商用的FITC标记抗狂犬病抗体进行荧光抗体检测时，脑组织涂片检测结果为阴性；而采用两组不同引物进行的RT-PCR检测均获得阳性结果。将获得的扩增序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，结果显示该序列与丽沙病毒（Lyssaviruses）相似，同源性低于79%，支持所检测到的病毒为丽沙病毒属成员。随后通过荧光抗体试验和测序证实，已成功从两个脑组织样本中分离出两种丽沙病毒。确定丽沙病毒阳性的关键步骤是荧光抗体试验和RT-PCR分析。强烈建议在引物组中使用两种或更多抗狂犬病病毒抗体。除了丽沙病毒外，其他人畜共患的蝙蝠病原体也可通过封闭式诊断方法进行监测。这些数据可用于向公众宣传避免接触蝙蝠。我们对蝙蝠丽沙病毒的研究越深入，就越能理解其进化过程及对公共卫生的影响。

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

台湾蝙蝠种群感染病毒监测的标准操作程序

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。...

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。...

一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估

本方案旨在为野外捕获蝙蝠的基因组学、转录组学和蛋白质组学分析提供最佳的组织制备方法。内容包括蝙蝠捕获与解剖、组织保存以及蝙蝠组织细胞培养的详细操作步骤。...

用于组学分析和原代细胞培养的蝙蝠组织采集

这种使用双链DNA嵌 intercalating...

泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断

我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。...

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

本研究建立了一种利用人腺病毒加标来确定小体积水样中最佳病毒浓度条件的方法。文中所述技术可用于确定其他病毒目标物的浓缩参数，并可应用于大规模病毒浓缩实验。...

一种用于从水中浓缩病毒的小体积方法

在水生环境中进行痕量金属研究时，正确采集和处理水样需要特别注意使用“洁净技术”。本文介绍了一种采样、样品处理及分析的实验方案，旨在获得可靠的环境监测数据和高灵敏度的分析结果，以支持详细的痕量金属研究。...

河流与河口水体中痕量金属研究的洁净采样与分析

浮游生物和悬浮颗粒在海洋的生物地球化学循环中起着重要作用。本文提供了一种超洁净、低扰动的方法，可用于在海上采集不同大小的颗粒物和浮游生物，并能够处理大量海水样品。...

一种用于采集粒径分级的海洋浮游生物和悬浮颗粒物的超洁净多层装置

我们提出了一种从可再生的非食用木质纤维素生物质中合成C5糖（木糖和阿拉伯糖）的方案（即，黄麻）在存在布朗斯特酸性离子液体的情况下ø布朗斯特酸性离子液体（BAILs）作为水相催化剂。与传统的无机酸催化剂（H2SO4 和...

一种用于分析黄麻生物质中戊聚糖并利用酸性离子液体将其转化为单糖的新方法

了解台湾蝙蝠种群中狂犬病毒监测的标准操作程序，学习样本采集、抗原检测和数据分析方法。该方案有助于研究人员有效开展病毒监测并提升人畜共患病防控能力。

中国台湾蝙蝠种群狂犬病毒属监测的标准操作规程

探索更多视频