中国台湾蝙蝠种群狂犬病毒属监测的标准操作规程

丽沙病毒是一种人畜共患的病原体。为评估丽沙病毒在中国台湾蝙蝠种群中的存在情况，我们启动了一项监测计划。该计划在2016年至2018年期间成功鉴定出四种丽沙病毒。

本方案是关于中国台湾地区狂犬病病毒属监测的逐步操作指南。我们希望该方案能为对狂犬病病毒属监测感兴趣的研究人员提供帮助。正确连接相应的标签符号至关重要。

对于狂犬病毒监测而言，死亡或濒死的蝙蝠比活体蝙蝠更适合作为样本。根据实验室所在国家的生物安全规定，在相应生物安全等级的实验室中进行以下操作，并确保研究人员具备当前有效的资质，且穿戴适当的个人防护装备。

在采集虚弱或生病的蝙蝠个体或尸体时，应由蝙蝠生态学家根据标本的形态学特征鉴定蝙蝠物种。向实验室提交信息表，内容包括每只蝙蝠标本的采集地点、物种、临床症状及其他相关数据。在开始尸体剖检前，检查所有外部开口，并拍摄蝙蝠的外部特征照片，尤其是头部、耳朵和翅膀，以用于物种区分。

采集口腔拭子样本时，将蝙蝠置于无菌解剖板上呈仰卧位，并用镊子固定头部。使用解剖刀沿小腿区域中线切开皮肤，将皮肤向两侧拉开，沿小腿区域中线在颅骨上做切口。用镊子打开颅骨以暴露脑组织，并用镊子轻轻将脑组织与相连的神经组织分离。

切取包含脑干和小脑的脑组织横切面，轻轻将脑组织切面接触载玻片，制备涂片压印。将载玻片按压在镜头纸上以去除多余组织，随后将涂片压印载玻片置于-20°C的丙酮中固定30分钟。然后，取一小块新鲜脑组织用福尔马林固定，用于组织病理学检查。

将剩余组织放入emi-em 10中用于核酸提取。接下来，沿身体中线从下颌至肛门切开皮肤，用镊子提起并分离皮肤及皮下肌肉组织，以便采集位于下颌骨附近的唾液腺。用镊子轻轻抬起胸骨，使用解剖刀沿中线切开胸骨和腹壁，并切断锁骨。

使用针具将左右肋骨固定在解剖板上，以打开胸腔。记录肉眼可见的病灶及死后变化程度。然后根据预定的后续分析需求，使用镊子和解剖刀适当去除内脏组织。

在固定结束时进行直接荧光抗体检测，将涂片压印玻片干燥，并为分析选择至少两种荧光标记的抗狂犬病病毒抗体。将每种抗体分别通过0.45微米滤器过滤后加至一张玻片上。然后将玻片置于湿盒中，在37摄氏度孵育30分钟。

孵育结束后，倒掉多余的偶联物，并用 PBS 洗涤载玻片。然后用少量 10% 甘油将盖玻片封片于载玻片上，并通过荧光显微镜观察载玻片。当荧光抗体检测或 RT-PCR 分析显示阳性时，将脑组织标本在 emi-en 10 中制成 10% 悬液并匀浆，再通过离心快速沉淀组织。

将200微升上清液与3×10⁶个鼠源神经母细胞瘤细胞以及1毫升EMI-EN 10在37摄氏度、1%二氧化碳条件下孵育1小时。将脑组织匀浆细胞悬液转移至含有6毫升新鲜EMI-EN 10的25平方厘米培养瓶中。取1毫升脑组织匀浆细胞悬液加入四孔特氟龙包被的玻璃载片中，每孔直径为6毫米，并将载片置于37摄氏度、1%二氧化碳环境中培养3至4天。

用100%丙酮固定后，使用与荧光抗体试验相同的两种荧光标记抗狂犬病病毒抗体对玻片进行染色，并通过荧光显微镜观察玻片，以确定胞浆内包涵体的数量。根据标准操作规程对接种后的细胞培养物进行胰酶消化和传代后，将低温培养物重新放入细胞培养孵育箱中继续培养三至四天，并重复计数感染细胞数量（方法如前所述），直至感染率达到100%。

2014年1月到2017年5月期间，共采集了来自13个物种的332具蝙蝠尸体用于监测。在本研究对两例阳性蝙蝠病例的代表性分析中，使用一种商用的FITC标记抗狂犬病抗体进行荧光抗体检测时，脑组织涂片检测结果为阴性；而采用两组不同引物进行的RT-PCR检测均获得阳性结果。将获得的扩增序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，结果显示该序列与丽沙病毒（Lyssaviruses）相似，同源性低于79%，支持所检测到的病毒为丽沙病毒属成员。

随后通过荧光抗体试验和测序证实，已成功从两个脑组织样本中分离出两种丽沙病毒。确定丽沙病毒阳性的关键步骤是荧光抗体试验和RT-PCR分析。强烈建议在引物组中使用两种或更多抗狂犬病病毒抗体。

除了丽沙病毒外，其他人畜共患的蝙蝠病原体也可通过封闭式诊断方法进行监测。这些数据可用于向公众宣传避免接触蝙蝠。我们对蝙蝠丽沙病毒的研究越深入，就越能理解其进化过程及对公共卫生的影响。