一种通用嵌套逆转录酶链反应检测裂解病毒的评价
May 2nd, 2019
一种泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应已开发出来, 专门检测所有已知的溶酶病毒。利用不同动物物种的狂犬病脑样本进行验证, 表明该方法具有与金标准荧光抗体检测相当的敏感性和特异性, 可用于常规狂犬病诊断。
嵌套RT-PCR已开发检测所有莱萨病毒，包括所有16个ICTV批准和两个新的莱萨病毒物种。在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中，利用9000多个动物脑标本验证了这种方法。嵌套的RT-PCR不仅能对新鲜的脑组织样本产生可靠的结果，还可以在降解的样品上产生可靠的结果。
这种方法可用于检测生尿液标本，如脑脊液、唾液和尿液，因此该方法可应用于最后通令诊断。为了最大限度地减少 PCR 结带污染，准备消极和积极的控制措施非常重要，采取措施非常重要。例如，对于每种RNA提取需求制备，PCR设置和凝胶电泳应在物理上独立的区域操作。
还建议在RNA提取和逆转录中使用螺旋胶带，以防止狂犬病污染肽链。正确处理，如在冰上准备您的制剂，定期更换手套，以及使用无核糖核酸酶材料，将防止核糖酶的引入，并消除RNA的降解。为了开始这个程序，从狂犬病疑似组织、皮肤活检、唾液、脑脊液或RABV感染细胞培养中提取RNA，如文本协议中所述。
准备好继续操作时，从冰柜中取出所需的试剂，并放在冰上。使用前，请确保解冻并旋转每个试剂。对于病毒RNA到cDNA的逆转录，为冰上每个样品和1.5毫升离心管制备12微升的反应混合物，如洁净室文本协议表1中所述。
要考虑移液变化，请准备至少一个比所需大小大的主混合物，然后将反应混合物分成 0.2 毫升 PCR 管。在模板室的 PCR 工作站中，将样品的八个微升或其中一个控件添加到反应组合中。阳性对照是从感染固定RABV菌株CVS11的细胞培养物中提取的RNA，而负对照含有无Rnase双蒸馏水。
首先涡旋，然后短暂离心，混合每个管的内容。在此之后，将反应管加载到热循环器中。设置并运行文本协议中概述的 cDNA 合成程序。
首先，取回必要的试剂，并把它们放在洁净室的冰上，直到准备好使用。准备就绪后，解冻并旋涡试剂。接下来，根据文本协议表2中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第一轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。
在模板室的 PCR 工作站中，将 cDNA 的两微升样本添加到第一轮 PCR 混合中。包括两个CVS11 cDNA的微升作为正对，两个微升的双蒸馏水作为负对。然后，将密封管转移到 PCR 热循环器中，并使用文本协议表 3 中列出的参数循环。
首先，根据文本协议表4中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第二轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。将第一轮 PCR 产品的两个微升添加到第二轮 PCR 组合中。包括双蒸馏水作为本轮PCR的负对。
然后，使用文本协议表 3 中列出的参数执行 PCR 热循环。首先，在100毫升三醋酸EDTA中加入1.5克的气糖，并在微波炉中加热，将其彻底溶解。接下来，以0.01%的最终浓度加入溴化乙酰胺，将凝胶倒入模具中，并在环境温度下凝固至少30分钟。
通过将每个 PCR 产品的五微升与一个 6 倍加载缓冲器的微升混合来准备加载样品。将样品和合适的DNA标记物单独加载到井中，在120伏特下运行凝胶约30至45分钟，直到染料线在凝胶下约75至80%。运行完成后，关闭电源并断开电极与电源的连接。
然后，小心地从凝胶盒中取出凝胶。使用紫外凝胶记录设备可视化和拍摄DNA片段。如文本协议中所述，对嵌套的反向转录 PCR 进行描述。
此处显示了一个代表性嵌套的 RT-PCR 检测 18 个 Lyssa 病毒物种的结果。PCR 正对显示第一轮放大时 845 个碱基对的预期波段，第二轮放大的 371 个基对的预期波段。对于负控件，未看到带。
所有 18 个 Lyssa 病毒都被认为产生与阳性对照相同的两个波段，表明嵌套的 RT-PCR 检测到所有 18 个 Lyssa 病毒。虽然16个质粒在两轮PCR中有效扩增，其中两个质粒，即阿拉万病毒和Ikoma病毒，只在第一轮或第二轮被放大。该方法的灵敏度在检测不同的莱莎病毒质粒时各不相同，从每微升2.24到2，240分子不等。
这些差异可归因于由于病毒序列多样性导致的底像和模板之间的不匹配。对通过嵌套 PCR 测试的临床标本中的 9，624 个脑组织与 FAT 测试的脑组织进行比较后发现，嵌套RT-PCR的灵敏度为100%，特异性为99.97%。所有 10 个实验室获得的嵌套 RT-PCR 结果都符合 FAT 的 100%，无假阴性或误报，表明嵌套的 RT-PCR 具有高特异性和可重复性。
RT-PCR 现在被国际动物技术研究公司推荐用于狂犬病技术。我们的嵌套RT-PCR已被证明是2018年中国狂犬病技术国家标准。
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概述
已经开发了一种全泛性狂犬病毒嵌套逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来检测所有已知的狂犬病毒。这种方法显示出高灵敏度和特异性，使其适用于常规的狂犬病诊断。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 诊断方法
- 传染病
背景
- 狂犬病毒包括狂犬病和其他相关病毒。
- 狂犬病传统诊断方法可能耗时且需要专业设备。
- 需要快速且可靠的诊断技术。
- 嵌套RT-PCR方法旨在解决这些挑战。
研究目的
- 开发一种用于检测狂犬病毒的敏感和特异性方法。
- 使用大量动物脑组织标本验证该方法。
- 评估该方法在各种生物液体中的适用性。
所用方法
- 用于狂犬病毒检测的嵌套RT-PCR技术。
- 使用超过9000个动物脑组织标本进行验证。
- 在新鲜和退化样本上进行测试。
- 应用于脑脊髓液、唾液和尿液等生物液体。
主要结果
- 嵌套RT-PCR显示出高灵敏度和特异性。
- 结果与金标准荧光抗体测试相当。
- 该方法对新鲜和退化样本都有效。
- 可用于临床环境中的常规狂犬病诊断。
结论
- 嵌套RT-PCR是检测狂犬病毒的可靠方法。
- 该技术可以增强狂犬病监测和诊断。
- 未来应用可能包括在各种生物标本中的更广泛使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
The universal nested RT-PCR method enables broad-spectrum detection of lyssaviruses, supporting early target validation in antiviral discovery programs. Its high sensitivity and specificity provide predictive confidence for de-risking lyssavirus-targeted therapeutic hypotheses. The method’s applicability to degraded samples and biological fluids enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across all known lyssavirus species, including novel variants.
- Operational Value: Provides functional target validation through detection of conserved nucleoprotein gene expression.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming pan-lyssavirus activity of candidate antivirals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, reproducible amplification of lyssavirus N gene for assay standardization.
- Operational Value: Enables screening readiness across fresh and degraded sample types, improving workflow flexibility.
- Scalability: Compatible with high-throughput formats due to nested PCR design and internal controls.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects lyssaviruses in cerebrospinal fluid, saliva, and urine, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation using clinically relevant specimen types.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false-negative risk in efficacy studies through 100% sensitivity across genetic clades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the antiviral discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming on-target activity across lyssavirus diversity.
- Screening: Enables reproducible, quantitative readouts for compound screening in BSL-2/3 environments.
- Analytics: Generates specific 371 bp amplicon readout for gel- or probe-based quantification across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by detecting viral RNA in accessible biological fluids.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized lyssavirus detection platform for reuse across antiviral programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lyssavirus-targeted studies through universal detection.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized controls and separation of pre-/post-PCR workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by minimizing biological false negatives in efficacy assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lyssavirus-targeted candidates with confirmed cross-species reactivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular virology and RT-PCR techniques.
- Needs thermocycler, gel electrophoresis, and UV documentation equipment.
- Demands physical separation of RNA extraction, PCR setup, and analysis areas to prevent contamination.
- Requires adaptation of controls when applied to non-neural specimen types like saliva or CSF.
- Limited by primer-template mismatches affecting sensitivity across highly divergent lyssavirus strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:37
RNA Extraction and Reverse Transcription of the Viral RNA
3:08
First-round PCR
4:03
Second-round PCR
4:41
Analysis of the PCR Products by Electrophoresis on Agarose Gels
5:48
Results: Evaluation of the Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses
7:44
Conclusion
