一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估
2019年5月2日
已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。
巢式RT-PCR已被开发用于检测所有丽沙病毒，包括国际病毒分类委员会（ICTV）批准的16种及两种新发现的丽沙病毒。该方法在中国为期10年的狂犬病临床诊断与监测中，通过对超过9000份动物脑组织样本的检测，已得到充分验证。巢式RT-PCR不仅对新鲜脑组织样本可产生可靠结果，对降解样本同样有效。
该方法可用于检测脑脊液、唾液和尿液等生物体液样本，因此可应用于最终诊断。为最大限度减少PCR残留污染，设置阴性对照和阳性对照至关重要，必须采取相应措施。例如，每次RNA提取所需的样本制备、PCR体系构建以及凝胶电泳操作，均应在物理上相互隔离的区域进行。
建议在RNA提取和逆转录过程中使用螺旋盖试管，以防止狂犬病病毒对肽链造成污染。通过在冰上配制试剂、定期更换手套以及使用无RNase的材料等规范操作，可避免RNase的引入，从而防止RNA降解。开始本实验前，请按照文本方案所述，从疑似狂犬病组织、皮肤活检样本、唾液、脑脊液或RABV感染的细胞培养物中提取RNA。
准备就绪后，从冷冻箱中取出所需的试剂并置于冰上保存。使用前确保每种试剂均已充分解冻并涡旋混匀。为将病毒RNA逆转录为cDNA，应在洁净室中按照文本方案中的表1，在冰上为每个样本配制12 µL反应混合液，并置于1.5 mL离心管中。
为避免移液误差，配制的总反应体系体积应比实际所需多出至少一个反应的量，随后将反应混合液分装至0.2毫升PCR管中。在模板室的PCR工作站内，向反应混合液中加入8微升待测样本或任一对照品。阳性对照为感染固定型狂犬病毒CVS11株的细胞培养物中提取的RNA，阴性对照则为无RNase的双蒸水。
通过涡旋振荡混匀各管中的内容物，然后短暂离心。之后将反应管放入热循环仪中。按照文本方案中所述设置并运行cDNA合成程序。
首先，取出所需的试剂，并在洁净室中将其置于冰上保存，直至准备使用。准备就绪后，将试剂解冻并涡旋混匀。接着，根据文本方案中的表 2，在 1.5 毫升离心管中为每个样本配制 48 微升的第一轮 PCR 混合液，并将反应混合液分装至 0.2 毫升 PCR 管中。
在模板室的PCR工作站中，将2 µL cDNA样品加入第一轮PCR反应体系中。同时加入2 µL CVS11 cDNA作为阳性对照，以及2 µL双蒸水作为阴性对照。随后，将密封的试管转移至PCR扩增仪中，并按照文本方案中表3所列参数进行扩增循环。
首先，根据文本方案中的表4，在1.5毫升离心管中为每个样本配制48微升的第二轮PCR反应液，并将反应液分装至0.2毫升PCR管中。向第二轮PCR反应液中加入2微升第一轮PCR产物。本轮PCR需设置以双蒸水作为阴性对照。
然后，使用文本方案中表3列出的参数进行PCR热循环。首先，将1.5克琼脂糖加入100毫升Tris-乙酸盐EDTA（TAE）缓冲液中，在微波炉中加热使其充分溶解。接着，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.01%。将凝胶倒入模具中，在室温下静置至少30分钟以使其完全凝固。
通过将每份 PCR 产物 5 微升与 1 微升 6x 上样缓冲液混合，制备上样样品。将样品和合适的 DNA marker 分别加入加样孔中，在 120 伏电压下电泳约 30 至 45 分钟，直至染料前沿迁移至凝胶的约 75% 至 80% 处。电泳结束后，关闭电源，并将电极从电源上断开。
然后，小心地将凝胶从电泳槽中取出。使用紫外凝胶成像仪观察并拍摄DNA片段。按照文本方案中所述，对巢式逆转录PCR进行表征。
此处展示了一项具有代表性的巢式RT-PCR检测18种丽沙病毒的结果。PCR阳性对照在第一轮扩增中显示出预期的845个碱基对条带，第二轮为371个碱基对条带。阴性对照未见任何条带。
所有18种丽沙病毒均显示出与阳性对照相同的两条条带，表明巢式RT-PCR可检测到全部18种丽沙病毒。在16种质粒中，经过两轮PCR可实现高效扩增，而Aravan病毒和Ikoma病毒的质粒分别仅在第一轮或第二轮中被扩增。该方法对不同丽沙病毒质粒的检测灵敏度存在差异，范围从每微升2.24至2,240个分子不等。
这些差异可归因于病毒序列多样性导致的引物与模板之间的不匹配。通过对临床标本中9,624份脑组织分别采用套式PCR与荧光抗体试验（FAT）进行检测的结果比较显示，套式RT-PCR的敏感性为100%，特异性为99.97%，两种方法的一致性达到99.07%。另有十个狂犬病实验室受邀开展该检测，以进一步验证套式RT-PCR的性能。所有十个实验室获得的套式RT-PCR结果与荧光抗体试验完全一致（100%），未出现假阴性或假阳性结果，表明该套式RT-PCR具有高特异性和良好的可重复性。
目前，世界动物卫生组织（OIE）推荐使用RT-PCR技术用于狂犬病检测。我们的巢式RT-PCR技术已于2018年被确立为中国狂犬病检测的国家标准。
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概述
已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），可用于检测所有已知的丽沙病毒。该方法具有高灵敏度和特异性，适用于常规狂犬病诊断。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 诊断方法
- 传染病
背景
- 丽沙病毒包括狂犬病病毒及其他相关病毒。
- 传统的狂犬病诊断方法可能耗时较长，且需要专用设备。
- 目前亟需快速且可靠的诊断技术。
- 巢式RT-PCR方法旨在应对这些挑战。
研究目的
- 建立一种检测狂犬病病毒属病毒的高灵敏度和高特异性方法。
- 利用大量动物脑组织样本对该方法进行验证。
- 评估该方法在多种生物液体中的适用性。
使用的方法
- 用于狂犬病病毒检测的巢式RT-PCR技术。
- 使用超过9000份动物脑组织样本进行验证。
- 对新鲜及降解样本均进行检测。
- 适用于脑脊液、唾液和尿液等生物液体的应用。
主要结果
- 巢式 RT-PCR 具有高灵敏度和特异性。
- 检测结果与金标准荧光抗体检测相当。
- 该方法对新鲜和降解样本均有效。
- 可在临床环境中用于常规狂犬病诊断。
结论
- 巢式RT-PCR是检测丽沙病毒的一种可靠方法。
- 该技术可提高狂犬病的监测与诊断能力。
- 未来应用可能包括在多种生物标本中的更广泛使用。
常见问题
行业重要性概述
通用巢式RT-PCR方法可实现对丽沙病毒的广谱检测，支持抗病毒药物发现项目中的早期靶点验证。该方法具有高灵敏度和高特异性，可为降低丽沙病毒靶向治疗假说的风险提供预测信心。该方法适用于降解样本和生物体液，有助于从发现阶段到临床前评价的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够针对所有已知的丽沙病毒属物种（包括新型变异株）进行治疗假设的验证。
- 操作价值：通过检测保守的核蛋白基因表达，实现功能靶点的有效性验证。
- 预测价值：通过确认候选抗病毒药物对泛丽沙病毒的活性，支持研发项目的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可对狂犬病毒N基因进行定量、可重复的扩增，用于检测方法的标准化。
- 操作价值：适用于新鲜和降解样本的筛查，提高实验流程的灵活性。
- 可扩展性：由于采用巢式PCR设计并包含内参对照，可兼容高通量检测模式。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：可检测脑脊液、唾液和尿液中的丽沙病毒，支持与生物标志物匹配的临床前模型。
- 转化连续性：利用具有临床相关性的样本类型，将发现结果衔接至临床前验证阶段。
- 风险调整后的推进：通过对所有遗传谱系实现100%的敏感性，降低疗效研究中假阴性结果的风险。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选，再到临床前药效测试的抗病毒药物发现全过程。
- 发现生物学：通过在狂犬病毒多样体中确认靶点活性，支持机制性风险降低。
- 筛选：可在BSL-2/3环境中实现可重复、定量的化合物筛选读数。
- 分析：在不同条件下生成特异性的371 bp扩增子读数，可用于凝胶或探针定量分析。
- 转化研究：通过检测可获取生物流体中的病毒RNA，与生物标志物策略相一致。
- 企业级复用：建立标准化的狂犬病毒检测平台，可在抗病毒项目中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过通用检测减少针对丽沙病毒研究中的机制性模糊。
- 操作价值：通过标准化对照以及PCR前后工作流程的分离，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过最大限度减少功效检测中的生物学假阴性结果，优化“进行/不进行”决策。
- 项目组合影响：能够对具有已证实跨物种反应活性的丽沙病毒靶向候选物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备分子病毒学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术的专业知识。
- 需要使用热循环仪、凝胶电泳仪和紫外成像记录设备。
- 要求将RNA提取、PCR体系构建和分析区域进行物理分隔，以防止污染。
- 当应用于唾液或脑脊液等非神经组织样本时，需对对照设置进行相应调整。
- 由于引物与模板的错配问题，该方法在检测高度变异的丽沙病毒属毒株时灵敏度受限。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
1:37
RNA Extraction and Reverse Transcription of the Viral RNA
3:08
First-round PCR
4:03
Second-round PCR
4:41
Analysis of the PCR Products by Electrophoresis on Agarose Gels
5:48
Results: Evaluation of the Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses
7:44
Conclusion
