利用CRISPR/Cas9技术恢复iPSC来源的肌前体细胞中抗肌萎缩蛋白的表达

杜氏肌营养不良症是一种导致肌肉前体细胞过早耗竭的肌肉营养不良症，属于最严重的肌营养不良症之一。为了促进功能性肌肉再生，我们采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，在诱导多能干细胞来源的肌肉前体细胞中恢复抗肌萎缩蛋白的表达。

CRISPR-Cas9 基因编辑技术有望恢复抗肌萎缩蛋白基因的表达。自体诱导多能干细胞（iPSC）来源的肌肉前体细胞可补充干细胞库，修复损伤，并防止杜氏肌营养不良症（DMD）进一步发生并发症，且不会引发免疫反应。将诱导多能干细胞（iPS细胞）向成肌前体细胞分化的不同方法降低了iPS细胞肿瘤再发的风险。

多种将自体诱导多能干细胞来源的肌前体细胞与CRISPR-Cas9介导的基因校正相结合的疗法，是治疗杜氏肌营养不良症的有前景策略。该技术可通过基因编辑自体干细胞，用于治疗多种先天性疾病，包括心脏、脑部和血液疾病。我们对此方法的演示可为读者提供细胞重编程和基因编辑的操作经验，而这些操作目前仍具挑战性。

在倒置显微镜下观察感染的小鼠胚胎干细胞克隆。用自印式标记笔在培养皿底部标记克隆位置。将涂有油脂的克隆环覆盖在已标记的细胞克隆上。

向每个克隆环中加入 100 微升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，将培养板置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 5 分钟。然后，用 100 微升移液器吸头将消化后的细胞转移至含有 250 毫升 MES 生长培养基的 48 孔培养板中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 85% 湿度的培养箱中孵育。

当细胞生长至70%融合时，挑选细胞生长良好的孔，加入250毫升TVP溶液消化30分钟。随后，将每孔中的细胞培养物转移至六厘米培养皿中。重复使用克隆环并进行多次培养，直至获得形态均一、呈圆顶状的克隆。

现在，通过加入一毫升 TVP 溶液消化制备好的小鼠诱导多能干细胞。将细胞培养物转移至经纤维连接蛋白和明胶包被的24孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。当细胞达到50%融合度时，更换为含有8微克/毫升Polybrene的新鲜培养基500微升。

然后，向小鼠诱导多能干细胞（iPSCs）中加入100微升慢病毒颗粒溶液。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三天。接着，确定在24小时内达到半数杀伤率所需的Blasticidin和Hygromycin B的最低浓度。

向细胞中加入含有 2.5 微克/毫升杀稻瘟菌素（Blasticidin）和 100 微克/毫升潮霉素 B（Hygromycin B）的培养基，培养三天后，选择仍保持贴壁的细胞作为稳定感染的细胞。用 0.5 毫升 TVP 溶液消化所选的小鼠诱导多能干细胞（iPSCs），每孔接种至新的 24 孔板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。随后，将 iPSCs 吹打成单细胞悬液，并使用细胞计数板进行细胞计数。

挑选约150个已消化的单细胞，用MES培养基稀释后接种至10厘米培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下培养。约10天后，在倒置显微镜下使用10微升无菌移液器吸头挑取单克隆，将每个克隆转移至96孔板中含50微升TVP溶液的孔内。在37°C下消化30分钟。

可靠的徒手克隆挑选对于收获经 CRISPR/Cas9 编辑的诱导多能干细胞的成功至关重要。随后，将每个孔中消化后的细胞转移并分装至另外两个 96 孔培养板中。在 37 °C 下孵育，直至细胞融合度达到 70%。

当细胞集落达到70%融合度时，移除96孔板中的培养基。向每孔加入含1%蛋白酶K溶液的25微升裂解试剂，并将裂解液转移至另一96孔PCR板中。用粘性封膜密封PCR板，置于PCR仪中55摄氏度孵育30分钟，随后95摄氏度孵育45分钟，以裂解细胞并灭活蛋白酶K。然后，在PCR管中加入2微升裂解液、10微升2×DNA聚合酶预混液、7微升无DNase水和1微升DMD外显子23引物。

根据手稿说明开始PCR反应。然后，将含有2.2微升上样缓冲液的PCR反应产物上样至2%琼脂糖凝胶中。以100至150伏电压电泳30分钟，并在紫外光下观察凝胶。

在本方案中，设计了两个位于突变外显子23两侧的向导RNA。在Cas9介导产生双链断裂并经非同源末端连接修复后，突变的外显子23被删除，从而允许产生截短但具有功能的抗肌萎缩蛋白。为避免胰蛋白酶溶液泄漏，需将润滑脂均匀涂抹在环状物底部。

将CRISPR/Cas9基因编辑技术与附加的MyoD激活系统相结合，为杜氏肌营养不良症患者中具有基因修复能力的基础前体细胞进行自体移植提供了一种安全、可行且有效的策略。