利用标准化定量西方印迹技术, 对跨组织和整个开发过程中的蛋白质水平进行可靠比较

该方法描述了一种可靠且可重复的方法, 用于使用标准化的定量西方印迹法比较不同组织和不同发育时间点的蛋白质水平。

该协议可用于通过查看不同组织和时间点的蛋白质表达，解决基础和临床研究中的重要问题。为了执行可靠的定量西方印迹，我们将荧光总蛋白染色与内部载荷控制相结合。这克服了在实验条件下比较各种组织时产生的限制。

要从冷冻细胞或组织样本中提取蛋白质，请先将零下80度的样品解冻，然后适当清洗样品。使用手持式电动均质器与聚丙烯害虫，均匀化洗涤的样品，在双蒸馏水中冲洗害虫，并在样品之间用干净的组织干燥。将样品留在冰上10分钟，然后离心。

然后，将含蛋白质样本的上清液转移到冰上的新管中，而不会干扰颗粒。为了对蛋白质浓度进行定量，在三孔三酯浓度增加时建立牛血清白蛋白标准，并将每个蛋白质样品的一微升重复添加到96孔光学板的适当孔中。如果蛋白质浓度预期较低，并在板读卡器上测量560纳米的吸收量，在60摄氏度的热块上孵育蛋白质10分钟或更长时间。

导出板读卡器测量值，通过将每个样品的平均吸光度值与使用蛋白质标准获得的标准曲线进行比较来计算蛋白质浓度。要使蛋白质的含量正常化，在样品缓冲液和超纯水中制备蛋白质样品的稀释，并在70摄氏度的热块中孵育样品10分钟。然后，在涡旋和短暂离心之前将样品放在冰上。

对于电泳，在凝胶电泳室系统中设置预制四至 12%的 Bis-Tris 梯度凝胶，将 3.5 微升的蛋白质标准加载到井中。当使用膜间标准化的内部标准时，将等于其他样品的量加载到蛋白质梯旁边的前三个孔中，将每个样品的 30 微克加载到剩余的孔中。然后，以 80 伏的堆叠凝胶运行样品 10 分钟，然后运行 150 伏特，再运行 45 到 60 分钟。

在电泳的末尾，组装转移堆栈，将蛋白凝胶放在底部堆栈上，其中包含聚乙烯二氟化物膜，然后是滤纸。使用印迹辊去除任何气泡，然后将顶部堆叠放在滤纸的顶部，然后再滚动堆叠以清除气泡。将整个堆栈与设备左侧的电极一起转移到传输装置中，将凝胶海绵放在堆叠的顶部，使海绵与设备上的相应电气触点对齐。

合上盖子后，选择并启动相应的程序。在程序结束时，将膜切割到凝胶大小，用双蒸馏水快速清洗切膜，然后继续处理总蛋白污渍。对于总的蛋白质染色，将膜卷入50毫升管中，蛋白质侧朝内，并在烟罩室温下用五毫升蛋白质染色溶液在滚筒上标记膜5分钟。

在孵化结束时，用五毫升的洗涤液快速清洗膜，将管子短暂地返回到洗涤之间的滚筒中，然后用超纯水短暂冲洗。在膜中加入三毫升阻塞缓冲液，并在室温下将膜返回滚筒 30 分钟。以适当优化的浓度用感兴趣的主要抗体替换阻塞缓冲液，并在四摄氏度下将辊子上的膜孵育过夜。

第二天，在室温下，用五毫升新鲜PBS在滚筒上清洗，将膜洗涤五分钟， 五分钟。最后一次洗涤后，在室温下用适当的二次抗体溶液在滚筒上孵育膜一小时，然后每次洗涤30分钟。最后一次洗涤后，干燥膜，使用铝箔，以保持膜免受光线。

对于图像采集，请将膜放在扫描仪上，蛋白质侧朝下，然后选择软件中的扫描区域。然后，在两个通道中获取图像，然后将图像导出到适当的图像分析程序。显示 700 纳米通道以显示总蛋白质染色结果，选择分析和绘制矩形以定义用于规范化的兴趣区域。

然后，将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的样本上，以确保定义的区域对于所有分析的通道的大小相同。要量化每个通道中的蛋白质浓度，请将总蛋白质染色和感兴趣的蛋白质的结果复制到电子表格程序，并确定最高的总蛋白质染色信号。然后，将每个总蛋白质染色信号值除以该值，获得规范化蛋白质载荷值，并除以每个样品的800纳米信号值及其相应的规范化蛋白质值，计算不同样品的相对蛋白表达比。

在这些具有代表性的西方印迹中，从产后第5天获得的组织中提取的蛋白质与从10周大的成年小鼠中提取的蛋白质进行比较。通过测量每个通道上矩形盒内的荧光强度，实现了总蛋白染色的荧光强度的量化。当分析整个通道时，整个样品的荧光强度保持相对相似，表明使用总蛋白染色进行规范化是适合此目的的。

荧光总蛋白染色也可用于比较不同发育时间点的蛋白质水平。例如，虽然小鼠存活运动神经元蛋白水平随着年龄的增长而明显降低，但总蛋白质染色定量保持不变。使用内部标准、基于荧光的规范化和足够的统计数据，可提高不同条件下复杂蛋白质表达分析的鲁棒性。

该协议增加了传统的西方印迹技术，克服了实验批次中适当的载荷控制和比较问题，并为蛋白质表达分析提供了灵活性。这种方法可以扩展到比较其他实验条件下的蛋白质表达。