非侵入性策略用于长期调控DREADD控制的神经元活动

DREADDs 是远程控制神经元活动最常用的化学遗传学方法。本文提供了用于重复或慢性 DREADD 操控的新替代方案，重点介绍侵入性更小的 CNO 递送方法。我们描述了两种在小鼠中实现 CNO 长期递送的策略：通过重复滴眼液给药，或通过动物的饮用水进行慢性给药。

本文所述的方案是CNO给药的慢性且非侵入性方法示例，可适用于多种实验设计，包括不同的DREADD变体、组织类型，甚至不同物种。CNO给药的一个关键问题是动物的应激与疼痛。这些方案可最大程度地减轻此类问题，且操作简便，易于在不同实验条件下进行调整和应用。

手术前，清洁并灭菌立体定位仪及所有所需器械。立体定位仪准备就绪后，确认麻醉的混合遗传背景野生型雄性小鼠对脚趾夹捏无反应，剃除头部上方毛发，并将小鼠头部固定于立体定位仪上。随后在眼睛表面涂抹眼用保护润滑剂，最后依次使用聚维酮碘和70%乙醇擦拭暴露的皮肤进行消毒。

使用无菌手术刀暴露颅骨，并将定位架校准至前囟点。在内侧-外侧坐标 2.9 毫米、前-后坐标 -2.7 毫米处钻孔，以定位海马体。暴露脑组织后，使用微量注射器和拉制的微毛细移液管，在背-腹深度 -3 毫米处向海马体单侧注射 90 纳升腺相关病毒。

然后用尼龙缝线关闭切口，并将动物从固定架上取下以给予镇痛处理。对于重复给予CNO的情况，在注射后四周开始，在滴眼液给药前的三到四天内，每天抓取小鼠颈背部皮肤使其适应操作，每次三分钟。当小鼠已适应操作后，称量每只小鼠的体重，以确定所需给予的CNO剂量，达到每千克体重1毫克CNO的浓度。

在非活动期关灯前两小时，将一到三微升配制好的CNO溶液吸入P10微量移液器中，并通过抓握背部皮肤固定小鼠。缓慢排出溶液，直至移液器尖端形成稳定的液滴，然后小心地将液滴靠近角膜，使溶液滴入眼中，注意不要让移液器尖端接触小鼠眼睛。随后将小鼠放回其饲养笼，再对下一只动物的眼睛施用CNO滴眼液。

若需在小鼠的活跃期给予CNO，请确保使用昏暗的红光，以便正确处理动物并给予CNO。对于长期CNO处理，在注射后四周开始处理前的三天，将常规水瓶更换为带有橡胶吸嘴并用铝箔包裹的小瓶，每瓶含10毫升常规水。用胶带将瓶子固定在笼具上，使小鼠适应这些水瓶。

测量每只小鼠的每日饮水量，并称量每只小鼠的体重。测试一系列CNO浓度，以确定在最小CNO浓度下表现出最大效应的剂量。然后在每个小瓶中加入八毫升普通水和所需量的CNO。

对于限制性CNO处理，在注射后第四周开始处理，并在开始处理前3天，在动物活跃期的最后阶段，将一个装有10毫升水加1%蔗糖的小瓶放置于笼内远离原始水瓶的位置。暴露结束时，从每个笼子中移除水加蔗糖溶液，并测量每只动物的蔗糖水消耗量。对于CNO给药，用5毫升水加1%蔗糖和每千克体重1毫克的CNO填充瓶子。

在活跃期的最后阶段，将瓶子放置在与糖水适应期相同的位置，移除瓶子并测量消耗的水量、蔗糖量和CNO量，操作方法如前所述。实验结束时，将处理过的动物脑组织采集至新鲜固定液中。9至12小时后，用30%蔗糖溶液对脑组织进行冷冻保护。

当脑组织沉降后，在冷冻切片机上对样本进行切片。当获得所有脑切片并阻断非特异性结合后，将组织样本与抗c-Fos抗体溶液在4°C条件下孵育过夜，并持续振荡。次日早晨，用新鲜的PBS溶液洗涤样本，每次洗涤5分钟，共洗涤三次，随后将样本与合适的荧光标记二抗溶液孵育。

室温下避光持续振荡孵育一小时后，通过荧光共聚焦显微镜获取标记组织切片的数字图像。将图像导入 ImageJ 后，勾画并测量腺相关病毒转染的 mCherry 阳性细胞区域，并对该区域内 cFos 假阳性细胞数量进行定量，以获得单位面积内的活化细胞数。通过滴眼液重复给予 CNO 可在大多数感染神经元中引发强烈的 cFos 表达，表明在重复暴露过程中 CNO 递送的有效性得以维持。

此外，在CNO处理后两小时采集的样本中，cFos的诱导水平显著高于CNO暴露后六小时采集的样本，表明CNO诱导的变化具有时间依赖性。每日摄入的含CNO水的体积与常规水的总体积相比无显著差异。同样，在夜间摄入的含1%蔗糖的水的体积不受CNO添加的影响，在为期五天的实验期间，每日摄入的含CNO水以及含蔗糖和CNO的水的体积也未观察到差异。

与使用CNO滴眼液类似，在给予CNO饮用水接触2小时后可观察到强烈的cFos诱导，但在6小时后则未见此现象。此外，CNO的作用存在明显的有效剂量阈值：低剂量CNO与生理盐水对照组相比，无法引发cFos激活；而较高剂量则可诱导出强烈且相似的cFos表达。我们建议进行剂量-反应分析，以确定不会显著降低神经元激活的最低CNO剂量，并考虑使用氯氮平（clozapine）作为配体。

本文中，我们展示了利用CNO介导的cFos诱导来反映神经元激活。然而，该方案也可轻松适用于电生理学分析或行为学测试。DREADD技术是一种远程调控神经元活性的强大工具，也可用于设计CNO递送的替代策略。

我们将扩大实验设置和潜在临床干预措施的选择范围。