用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

本方案描述了一种能够通过高效递送siRNA在体内实现基因沉默的纳米粒子系统的合成方法。通过简单更换靶向肽和siRNA载荷，这种融合性纳米粒子可作为一种潜在的治疗制剂，用于需要体内基因调控的疾病。我们此前已发表研究成果，利用该融合性纳米平台针对革兰氏阳性菌感染，通过沉默巨噬细胞中编码炎症反应的基因以终止慢性炎症。

在执行此操作之前，组装一个聚四氟乙烯刻蚀池，其中含有置于三比一氢氟酸溶液中的硅晶片。施加一个方波交流电，以50毫安/平方厘米的低电流密度持续0.6秒，随后以400毫安/平方厘米的高电流密度持续0.36秒，重复500个循环。刻蚀完成后，将刻蚀池从电路中移除，并使用注射器小心冲洗掉其中的氢氟酸溶液。

然后，用乙醇冲洗三次。要将多孔层从硅片上剥离，首先向腐蚀池的孔中加入10毫升1比29的氢氟酸溶液。然后，以3.7毫安每平方厘米的恒定电流运行250秒。

蚀刻完成后，将电池从电路中取出。多孔硅层可能出现可见的波纹，表明其已从单晶硅片上脱离。用氢氟酸溶液轻轻冲洗，并分别用乙醇和水各冲洗三次。

使用移液枪头用力沿多孔硅层的边缘划裂，使其完全脱离。用乙醇将多孔硅碎片或芯片从聚四氟乙烯刻蚀池中收集至称量舟中，然后转移至玻璃小瓶中储存。

接下来，将装有多孔硅芯片的玻璃小瓶中的乙醇替换为两毫升无RN酶的水。用封口膜紧密封盖小瓶。将玻璃小瓶放入超声波清洗器水浴中，并确保小瓶处于悬浮状态，使多孔硅芯片完全浸没于水浴液面以下。

为防止在超声过程中发生显著的水分流失，将装有水的容量瓶倒置，使瓶口接触水浴液面。然后，在35千赫兹频率和48瓦射频功率条件下对多孔硅芯片进行12小时超声处理。超声结束后，将玻璃小瓶置于平坦表面上静置1小时，使较大的颗粒沉降至底部。

然后，使用移液器收集上清液。在玻璃小瓶中加入 72.55 µL DMPC 溶液、15.16 µL DSPE-PEG 溶液和 19.63 µL DOTAP 溶液，并通过移液混匀。将小瓶置于通风橱中，瓶盖松开，使溶剂过夜挥发。

干燥后的薄膜将呈现为瓶底浑浊、坚硬、凝胶状的物质。接下来，将含有150微升多孔硅纳米颗粒的微量离心管放入预先准备好的冰浴超声装置中。在15分钟超声处理过程中，轻轻移液150微升siRNA和700微升2摩尔氯化钙至多孔硅纳米颗粒中。

从超声波仪中取出含有1毫升载有siRNA的钙包覆多孔硅纳米颗粒的离心管。用去离子水装满一个广口烧杯。将聚碳酸酯膜和四个滤膜支撑架漂浮在水面上进行浸泡。

然后，按照制造商的说明组装脂质体挤出装置。接着，用一毫升载有siRNA的钙涂层多孔硅纳米颗粒水合玻璃小瓶中的干燥脂质膜。用移液器反复吹打，直至所有脂质从瓶底完全脱离，并形成浑浊且均匀的溶液。

将磁力搅拌子加入玻璃小瓶中，然后将小瓶置于加热板上，在磁力搅拌条件下将颗粒加热至 40 摄氏度，持续搅拌 20 分钟。随后，将一个空注射器连接至挤出器的一端。接着，用另一支注射器吸取 1 毫升脂质包被的多孔硅纳米颗粒溶液，并将该注射器连接至挤出器的另一端。

开始挤出过程，缓慢推动活塞，将颗粒从一支注射器经聚碳酸酯膜推入另一支注射器，重复20次。然后，将挤出后的颗粒收集至微量离心管中。

用无RNase水配制肽浓度为1毫克/毫升的肽母液。向含有融合脂质包被的多孔硅纳米颗粒的微量离心管中加入100微升肽母液，轻轻吹打混匀。室温下静置20分钟。

为去除多余的肽、siRNA 及其他辅料，使用 30 千道尔顿的离心过滤器，在室温下以 5,000 × g 离心一小时进行洗涤。在相同条件下，再用 1 毫升 PBS 离心两次。离心完成后，将最终的肽偶联融合性脂质包覆的多孔硅纳米颗粒重悬于 PBS 中，调整至所需浓度。

颗粒可分装后于零下80摄氏度保存至少30天。成功合成的融合性多孔硅纳米颗粒应形成均匀、微浊的溶液，该溶液可储存30天并经冻融处理而不引起结构变化。若未能优化比例与浓度，或经历多次冻融循环，则可能导致载药时发生聚集。

当颗粒被挤出时，通过动态光散射测得的融合性多孔硅纳米颗粒的平均流体动力学直径应约为 200 纳米，平均泽塔电位约为正 7 毫伏。在用靶向肽进行表面修饰后，总体直径应小于 230 纳米，平均泽塔电位降至 -3.4 毫伏。可通过用亲脂性荧光染料 DiI 标记融合性脂质，并利用共聚焦显微镜观察其体外定位来确认融合情况。

当促融合性多孔硅纳米颗粒的脂质将DiI转移至细胞质膜，并且DiI定位独立于溶酶体时，表明融合成功。若融合失败，则DiI定位于细胞质内，并与溶酶体共定位。目前，这种促融合纳米颗粒系统不仅正被用于细菌感染的治疗，还被应用于癌症辅助治疗及癌症免疫治疗。

该方案可进一步优化以负载多种siRNA。这种融合性纳米颗粒系统已显示出在负载和递送较大阴离子载荷（如mRNA和CRISPR/Cas9复合物）方面的潜力。