Name: 使用氧化二氮作为评估哺乳动物体内成分和耗水量的非侵入性、非致命性工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解使用氧化氘稀释技术评估哺乳动物体内水分、瘦体重和脂肪含量的非侵入性方法。该技术适用于濒危物种、家养动物及自由放养野生动物的生理学研究。

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本研究得到了MDC合作协议（#416）、美国林务局合作协议（16-JV-11242311-118）、美国兽医营养学会与Waltham/Royal Canin资助项目（资助编号：00049049）、美国国立卫生研究院培训资助（资助编号：T32OS011126）以及密苏里大学兽医研究学者项目的资助。作者感谢Shannon Ehlers对本文稿的预审。我们感谢Robert Backus博士提供D2O标准品并允许使用他的实验室。

本文所述所有实验均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并在密苏里州自然资源保护部（MDC）野生动物科学研究采集许可证（许可证号 #16409 和 #17649）下进行。
1. 无菌、等渗、含盐 D2O 储存液的制备
<ol>
	<li>配制50 mL浓度为9.0 g/L的盐化D2O储备液。
	<ol>
		<li>称取450 mg药用级NaCl，并将全部NaCl转移至一个100 mL的无菌烧杯中。在实验记录本中精确记录NaCl的质量，保留至小数点后四位。</li>
		<li>使用无菌量筒量取50 g、纯度≥99.8%的重水（氧化氘），并转移至含有NaCl的无菌烧杯中。在实验记录本或电子表格中精确记录重水的质量，保留至小数点后四位。</li>
		<li>将10 mL等渗浓度的NaCl溶液（9.0 g/L）通过带有亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜进行过滤。</li>
		<li>将一支20 G针头连接至带有10 mL注射器筒的、具亚微米孔径（0.2 µm）的无热原无菌滤膜上。将针头插入一个100 mL无菌空瓶的隔膜中。</li>
		<li>将真空管连接至一支22 G针头，并将该针头插入100 mL无菌空瓶的隔膜中。</li>
		<li>将10 mL储备液倒入注射器筒中。缓慢开启真空，使D2O储备液开始缓慢滤入无菌瓶中。持续将D2O储备液倒入注射器筒，直至全部50 mL溶液完成过滤。 
		注：储备液可能需要根据所需剂量进行稀释或浓缩。D2O的剂量取决于物种及分析方法的灵敏度。对于猫，工作液用于给予0.7 g/kg的D2O剂量。上述储备液可最大限度减少皮下注射给动物时引入的NaCl溶液体积，同时仍能准确测量给药剂量。对于蝙蝠等小型哺乳动物，必须将该浓度稀释为如0.1600 g/mL的工作液。此浓度可确保在约100 µL或更少的NaCl溶液中准确测量并给予0.75 g/kg的D2O剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蝙蝠用无菌等渗盐化D2O储备工作溶液的制备
<ol>
	<li>称取一个10 mL的空无菌瓶，记录重量至小数点后四位。将天平去皮归零。</li>
	<li>使用1.0 mL注射器将0.65 mL的D2O储备液转移至已去皮的10 mL空无菌瓶中。记录D2O的重量至小数点后四位。将天平去皮归零。</li>
	<li>计算10 mL空瓶中D2O的体积。使用以下公式： 
	<img alt="速度计算公式 V=W/D；物理方程；静力学平衡分析。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	其中 W 为记录的重量，D 为99.8% D2O的密度（1.107 g/mL）。</li>
	<li>利用计算所得的D2O体积及其已知质量，确定配制约0.1600 g/mL工作液所需的等渗盐水体积。</li>
	<li>将连接真空管的22 G针头插入10 mL无菌瓶的隔垫中；再将连接有0.22 µm注射式滤器（安装于10 mL注射器筒上）的20 G针头插入同一无菌瓶的隔垫中。</li>
	<li>将计算所得质量/体积的等渗NaCl溶液倒入注射器筒中，开启真空，使其缓慢滴入10 mL无菌瓶中。</li>
	<li>记录瓶的总重量，确保已配制成约0.1600 g/mL的工作液。</li>
</ol>
3. 利用D2O测定大棕蝠（Eptesicus fucsus）的身体成分
注意：本方案中使用的 D2O 储备溶液浓度为 0.1598 g/mL。采血前，需确保采集不超过 200 µL 的血液体积不超过蝙蝠总血容量的 10%，并符合机构动物护理与使用委员会（IACUC）规定的采血指南。所有动物均应禁食或通过腹部触诊确认胃部为空。近期进食可能改变动物体重，由于测定体脂率的计算依赖于动物体重，这将导致结果混淆。
<ol>
	<li>麻醉一只大棕蝠。
	<ol>
		<li>使用5.0%异氟烷进行诱导，以0.5%−3.0%异氟烷维持稳定的麻醉深度。</li>
		<li>通过测试足部回缩反射（捏压蝙蝠脚趾）判断麻醉深度是否合适。蝙蝠不应对此刺激产生反应，且呼吸频率应保持缓慢稳定。根据需要调整异氟烷浓度，以维持稳定的麻醉状态。</li>
		<li>按照IACUC要求记录异氟烷浓度、心率、呼吸频率及其他相关信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量大棕蝠体重，并将重量记录至小数点后四位。</li>
	<li>使用酒精棉片清洁股间膜（尾膜）上覆盖股间静脉的区域，待其自然干燥。在股间静脉上方涂抹一层薄薄的凡士林。</li>
	<li>使用29 G针头穿刺股间静脉的背侧部分，用塑料肝素钠毛细管采集100 µL血液。采集后轻轻滚动每根毛细管，确保全血与肝素钠充分混合，并对毛细管进行标记。</li>
	<li>使用已校准用于小型哺乳动物的DXA仪器，对蝙蝠进行三次DXA扫描10。</li>
	<li>通过将蝙蝠体重（kg）乘以D2O剂量0.75 g/kg，计算需注射的D2O质量（g）。将计算所得的D2O质量除以工作液浓度，得到所需D2O的体积（V）。 
	<img alt="剂量计算公式，剂量 = 体重(kg) × 0.75 g/kg，以方程式形式展示。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> 
	<img alt="以克为单位的剂量体积计算公式；化学方程式。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程3"></li>
	<li>使用带29 G针头的胰岛素注射器抽取计算所得体积的D2O。称量D2O、胰岛素注射器及针头的总重量，并记录至小数点后四位。</li>
	<li>将D2O注射至麻醉状态下蝙蝠背部髋部区域的皮下组织。</li>
	<li>让蝙蝠从麻醉中恢复，并记录注射时间。</li>
	<li>注射后立即称量已空的带29 G针头的胰岛素注射器，重量记录至小数点后四位。</li>
	<li>通过从注射前含D2O的胰岛素注射器重量中减去注射后的空注射器重量，计算实际注射的D2O剂量，并记录至小数点后四位。</li>
	<li>在采血后30分钟内，使用血细胞比容离心机以10,000 x g转速（若离心机支持多档转速）对每根毛细管离心5分钟。</li>
	<li>使用锋利剪刀在全血与血浆交界处剪断塑料毛细管。使用200 µL移液器将血浆直接吹入已标记的500 µL储存管中。</li>
	<li>经过平衡期后，再次从股间静脉采集100 µL血液。 
	注：平衡期因物种及蝙蝠是否进入蛰伏状态而异。对于大棕蝠，通常2小时足以完成平衡期。</li>
	<li>通过重复步骤3.13，将血浆分离至第二个已标记的500 µL带螺帽微量离心管中。样品储存于-20 °C或更低温度，直至分析。</li>
</ol>
4. 傅里叶变换红外光谱分析
<ol>
	<li>将沙浴温度设定为 60 °C，以促进蒸馏（使水和 D2O 与其他血液成分分离）。</li>
	<li>用移液器将每份血浆样品和标准品各 50 µL 加至 1.5 mL 锥形微量离心管管盖内侧。标准品应包含已知浓度的 D2O，用于质量控制。 
	注：理想情况下，每只动物每个样品应设置三个重复，并报告三个重复的平均值。由于样品体积有限，以及作者所使用的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）设备所需的样品体积，蝙蝠样品未进行重复测定。若任一样品血浆体积少于 50 µL，则将全部样品体积加至锥形微量离心管管盖内侧，并记录实际体积。</li>
	<li>将微量离心管盖倒置，拧上 1.5 mL 锥形微量离心管。将倒置（管盖朝下）的离心管放入沙浴中，使管盖与沙子接触，至少放置 12 小时（过夜）。</li>
	<li>12 小时后，取下管盖并更换为新的洁净管盖。在离心机中瞬时离心 10 秒。</li>
	<li>配制以下标准品：0 ppm（1 L 蒸馏水中含 0 mg D2O）、293 ppm（1 L 蒸馏水中含 293 mg D2O）、585 ppm（1 L 蒸馏水中含 585 mg D2O）、878 ppm（1 L 蒸馏水中含 878 mg D2O）和 1170 ppm D2O（1 L 蒸馏水中含 1170 mg D2O）。 
	注：上述数值建议用于标准曲线。也可使用其他数值，如 250 ppm、500 ppm、750 ppm 等。</li>
	<li>将液体透射池安装至傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）中（材料表）。用甲醇填充透射池并连接进样口。在小心移除甲醇注射器的同时，缓慢注入背景水，以降低产生气泡的风险。在出口端连接管路，以便分析后排出样品。</li>
	<li>设置 FTIR 光谱仪软件（材料表）以分析水中 D2O。本实验方案所用光谱仪软件的参数设置见表 1。</li>
	<li>使用稀释液（0.22 µm 滤膜过滤的蒸馏水）采集背景光谱。该水应与配制标准品所用水相同。</li>
	<li>注入 40 µL 的 0 ppm D2O 标准品并记录光谱。将光谱数据保存为逗号分隔值（CSV）文件。</li>
	<li>继续依次注入并保存所有标准品的光谱，以建立标准曲线。</li>
	<li>每 60−90 分钟重复一次背景和标准曲线测定。</li>
	<li>将每份蒸馏后样品 40 µL 注入液体透射池，并保存光谱。 
	注：根据液体透射池的体积调整标准品和蒸馏样品的进样体积。若样品体积低于 40 µL，可使用更小体积的透射池，或用背景蒸馏水 1:1 稀释后进样。</li>
	<li>使用电子表格软件（如 Jennings 等人11所述）或光谱分析软件，根据 FTIR 光谱确定各样品中 D2O 的浓度。若进行了重复测定，则采用平均浓度计算体成分。</li>
</ol>
5. 身体成分的计算
<ol>
	<li>使用以下公式12将每个样品的氘富集度（ppm）转换为原子百分比浓度： 
	<img alt="静态平衡方程，原子百分比，计算公式。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 
	其中 x 为测得的样品氘富集度（ppm），0.0001557 为维也纳标准平均海水（VSMOW）中报道的氘的摩尔分数13。</li>
	<li>使用以下公式4，12，14计算每个样品的总体水含量： 
	<img alt="静态平衡方程；物理学中力平衡计算的公式。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5">) 
	其中 E 为背景校正后测得的样品中氘的富集度（原子%），B 为注射质量（g），0.998 为注入的 D2O 的浓度。 
	注：氘与不稳定氢发生交换会导致总体水质量被高估约 2%。应通过将总体水质量估计值减少体重的 2% 来进行校正。</li>
	<li>使用以下公式估算每只蝙蝠的无脂质量（瘦体重及其他所有非脂肪组分）： 
	<img alt="无脂质量方程；重量/水分比例，在营养分析背景下的公式。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6"> 
	注：对于健康、正常水合状态且未哺乳的蝙蝠，采用公认的瘦体重水分比例值 0.732。哺乳期大棕蝠的无脂质量水分比例会随产后周数而变化15。对于其他物种，应使用文献中已发表的数值，或在进行瘦体重计算前先行测定其瘦体重的水分比例。</li>
	<li>使用以下公式估算体脂肪质量： 
	<img alt="体脂肪质量计算方程；生物学研究中体重分析的公式。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 7"></li>
	<li>使用以下公式将体脂肪质量（g）转换为体脂百分比： 
	<img alt="体脂肪质量计算公式，体重分析中体脂百分比的方程。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 8"></li>
</ol>
6. 食肉动物（Felis catus，家猫）体内水分组成的测定
<ol>
	<li>按照第1节所述方法制备储备溶液。</li>
	<li>将每只猫的体重称量至小数点后三位，并记录体重。根据步骤3.6所述方法，使用0.70 g/kg的D2O剂量计算每只猫的给药剂量。</li>
	<li>按照步骤3.7–3.8所述方法准备每份剂量，使用3 mL或5 mL注射器配22 G针头，而非胰岛素注射器。</li>
	<li>采集500 µL全血，随后皮下注射0.7 g/kg的D2O。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20°C保存直至分析。</li>
	<li>在注射后4小时采集500 µL全血。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。</li>
	<li>在注射后14天采集500 µL全血。将全血在2,000 × g下离心15分钟，将血浆储存于1.5 mL带螺口盖的微量离心管中，于-20 °C保存直至分析。 
	注：采血间隔的天数可根据实验需求以及D2O在背景水平以上可检测的时间范围确定。14天是Hooper等9研究中饮食处理阶段的持续时间。</li>
	<li>根据本方案第4节进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，并根据第5节计算身体成分。</li>
	<li>使用以下公式计算每日水消耗量（mL/天）： 
	<img alt="体水丢失方程：TBW(kg)×((初始D2O−最终D2O)/初始D2O)；生理学计算。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程9"> 
	<img alt="静态平衡方程，水的分数变化，含D2O数据的示意图，科学分析。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程10"> 
	<img alt="水消耗量公式；mL/天；分数变化；H2O；初始TBW；方程；研究分析。" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程11"> 
	其中TBW为总体水含量，初始D2O和最终D2O为注射后D2O样品中测得的ppm浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+body+condition+scoring+in+zoo+animals+%E2%80%93+composite%2C+algorithm+and+overview+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zoo+Aquarium+Research%22%5BJournal%5D)">Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches.</a> Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).</li>
<li>Peig, J., Green, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+for+estimating+body+condition+from+mass%2Flength+data%3A+the+scaled+mass+index+as+an+alternative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method.</a> Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).</li>
<li>Bissell, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBissell%2C+H+%22Body+Condition+Scoring+Resource+Center%22">Body Condition Scoring Resource Center</a>. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).</li>
<li>McWilliams, S. R., Whitman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+to+assess+body+composition+of+birds%3A+a+review+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ornithology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study.</a> Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).</li>
<li>Lukaski, H. C., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+inexpensive+method+of+determining+total+body+water+using+a+tracer+dose+of+D2O+and+infrared+absorption+of+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).</li>
<li>Chusyd, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiposity+and+Reproductive+Cycling+Status+in+Zoo+African+Elephants%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants.</a> Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).</li>
<li>Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutering+Induces+Changes+in+Food+Intake+Body+Weight%2C+Plasma+Insulin+and+Leptin+Concentrations+in+Normal+and+Lipoprotein+Lipase%E2%80%93Deficient+Male+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats.</a> The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).</li>
<li>Eichhorn, G., Visser, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Comment%3A+Evaluation+of+the+Deuterium+Dilution+Method+to+Estimate+Body+Composition+in+the+Barnacle+Goose%3A+Accuracy+and+Minimum+Equilibration+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).</li>
<li>Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+selenium+and+moisture+on+the+physical+activity+and+thyroid+axis+of+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiolgy+and+Animal+Nutrition+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats.</a> Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).</li>
<li>Stevenson, K. T., van Tets, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Energy+X-Ray+Absorptiometry+%28DXA%29+Can+Accurately+and+Nondestructively+Measure+the+Body+Composition+of+Small%2C+Free-Living+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).</li>
<li>Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+infrared+spectrophotometry+for+measuring+body+water+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces.</a> Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).</li>
<li>Beuth, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Body+Composition%2C+movemement+phenology+and+habitat+use+of+common+eider+along+the+southern+new+england+coast.+Master+of+Science+in+Biological+and+Environmental+Sciences+%28MSBES%29%22">Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis</a>. , University of Rhode Island. (2013).</li>
<li>Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoplen%2C+TB+%22U.S.+Geological+Survey+Water-Resources+Investigations+Report+01-4222%22">U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222</a>. , (2002).</li>
<li>Karasov, W. H., Pinshow, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+lean+mass+and+in+organs+of+nutrient+assimilation+in+a+long-distance+passerine+migrant+at+a+springtime+stopover+site%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site.</a> Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).</li>
<li>Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+body+composition+of+female+big+brown+bats+%28Eptesicus+fuscus.%29+during+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+B%22%5BJournal%5D)">Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation.</a> Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).</li>
<li>Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+serum+leptin+immunoreactivity+and+body+fat+mass+as+estimated+by+use+of+a+novel+gas-phase+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+deuterium+dilution+method+in+cats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats.</a> American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).</li>
<li>Moore, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Total+Body+Water+and+Solids+with+Isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes.</a> Science. 104 (2694), 157-160 (1946).</li>
<li>Voigt, C., Cruz-Neto, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoigt%2C+C+%22Ecological+and+Behavioral+Methods+in+the+Study+of+Bats%22">Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats</a>. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Assessment+of+Body+Composition+and+Total+Energy+Expenditure+in+Humans+Using+Stable+Isotope+Techniques%22">Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques</a>. , (2009).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Introduction+to+Body+Composition+Assessment+Using+the+Deuterium+Dilution+Technique+with+Analysis+of+Saliva+Samples+by+Fourier+Transform+Infrared+Spectrometry%22">Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry</a>. , (2011).</li>
<li>Shimamoto, H., Komiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Turnover+of+Body+Water+as+an+Indicator+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Anthropology+and+Applied+Human+Science%22%5BJournal%5D)">The Turnover of Body Water as an Indicator of Health.</a> Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自20世纪40年代以来，重水已被用于测定总身体水量（TBW）17 并用于人类以及多种家养和野生动物物种4,6,7其他非破坏性技术已被开发出来，包括生物电阻抗分析（BIA）、双能X线吸收测定法（DXA）和定量磁共振（QMR）。在选择用于评估体成分的特定方法之前，应充分考虑每种方法的优缺点。本方案选择DXA作为氘代氧化物法评估体成分的比较方法，原因是该设备为大学核心资源，使用成本低，每次扫描所需时间短（每只蝙蝠30秒），且不受体温和皮肤绝缘性等变量的影响。
在将重水稀释法应用于特定物种时，应首先开展预实验，以确定达到平衡所需的时间18。可通过采集基线样本，并在注射后每隔15分钟采集一次血液样本来实现。对于蝙蝠等小型物种，可在不同时间点分别采集多只个体的血液样本，而非仅使用单一个体<sup class="xr...

体况评分系统和体况指数是用于评估物种健康状况或适应性的常用技术1,2。许多家养动物和动物园物种均有独特的体况评分（BCS）系统，用于评估动物的肌肉和皮下脂肪组织3。然而，BCS评估依赖于评估者的判断——这意味着当由经过培训的评估者进行评定时，BCS仍属于主观或半定量测量。在野生动物研究中，通常使用体况指数而非BCS，该指数基于体重与体长之比或体重与前臂长度之比2。体况指数常受到摄食活动的影响，同时也可能受到个体体型大小以及统计学和推断方法问题的干扰4。
一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素来测定身体组成。一种常用的稳定同位素是重水（D2O），它是水的一种非放射性形式，其中氢原子为氘同位素。本研究中描述的重水稀释法是一种客观、定量且可重复的技术，可用于估算人类5以及多种物种4,6,7的身体组成。该技术在野生动物身体组成研究中具有优势。例如，可用于评估管理措施实施前后身体组成的纵向变化。然而，在某些野生动物物种中，重水可能会高估实际的水分含量8。因此，在将该技术应用于某一物种时，应通过将重水法与非濒危物种的尸体分析进行比较，以验证该方法的准确性。对于受威胁或濒危物种，应考虑采用双能X射线吸收测定法（DXA）等非破坏性方法，作为与完整的尸体分析这一金标准破坏性方法相对比的替代方案。
除了体成分分析外，重水（D2O）稀释法还可用于测定单个动物的饮水量9。这种重水（D2O）的独特应用不仅可用于回答科研问题，还可用于评估在大型群居环境中饲养的单个或多个动物的饮水情况。
本文介绍了重水（D2O）稀释法的改进应用，用于评估食虫动物——大棕蝠（Eptesicus fuscus）的身体成分，以及用于评估食肉动物——家猫（Felis catus）的饮水量。

<table><tbody><tr><td>0.2 微米无热原圆盘滤膜</td><td>Argos Technologies</td><td>FN32S</td><td>尼龙材质，直径 30 mm，0.22 µm，无菌</td></tr><tr><td>1.5 mL 锥形微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1415-9701</td><td>1.5 mL 自立式微量离心管，本色带蓝色盖</td></tr><tr><td>10 mL 无菌玻璃注射用小瓶</td><td>Mountainside 医疗设备公司</td><td>MS-SEV10</td><td>透明、无菌玻璃注射单元</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>无菌 10 mL 注射器，单个独立包装</td></tr><tr><td>100 mL 无菌玻璃注射用小瓶</td><td>Mountainside 医疗设备公司</td><td>AL-SV10020</td><td>透明、无菌玻璃注射单元</td></tr><tr><td>20 号针头</td><td>Exel</td><td>26417</td><td>一次性皮下注射针头 20g × 1&quot; 塑料接口（黄色）/普通斜面</td></tr><tr><td>22 号针头</td><td>Exel</td><td>26411</td><td>一次性皮下注射针头 22g × 1&quot; 塑料接口（黑色）/普通斜面</td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-25G</td><td>氘原子含量 99.9%</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Vetone</td><td>3060</td><td>Fluriso 异氟烷，符合美国药典标准</td></tr><tr><td>OMNIC 光谱软件</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>833-036200</td><td>傅里叶变换红外光谱标准软件</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Vaseline</td><td>305212311006</td><td>Vaseline，100% 纯凡士林，原味，皮肤保护剂</td></tr><tr><td>塑料毛细管</td><td>Innovative Med Tech</td><td>100050</td><td>含肝素钠抗凝剂，容量 50 &amp;mu;L，长度 30 mm</td></tr><tr><td>密封液体傅里叶变换红外光谱仪 SL-3 FTIR CAF2 池</td><td>International Crystal Laboratory</td><td>0005D-875</td><td>光程 0.05 mm</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Millipore</td><td>1.37017</td><td>适用于生物制药生产</td></tr><tr><td>Thermo Electron Nicolet 380 傅里叶变换红外光谱仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269-169400</td><td>已停产型号，有更新型号可供选择</td></tr></tbody></table>

使用重水作为评估哺乳动物体成分和饮水量的非侵入性、非致死性工具

Using Deuterium Oxide as a Non-Invasive, Non-Lethal Tool for Assessing Body Composition and Water Consumption in Mammals

体况评分系统和体况指数是评估物种健康状况或适应度的常用技术。体况评分系统依赖于评估者的主观判断，可能具有高度主观性。体况指数可能受到觅食行为、体重影响以及统计学和推断问题的干扰。一种替代体况评分系统和体况指数的方法是使用稳定同位素（如重水）来测定身体组成。重水稀释法是一种可重复、定量的技术，可用于估算人类、野生动物和家养动物的身体组成。此外，重水稀释技术还可用于测定单个动物的饮水量。本文中，我们描述了将重水稀释技术应用于大棕蝠（Eptesicus fuscus）身体组成的评估，以及用于家猫（Felis catus）饮水量测定的方法改良。

氘氧化物稀释法可用于评估多种物种的身体成分。为展示该方法的适用性，本文报道了首次将氘氧化物稀释法应用于北美食虫蝙蝠物种——大棕蝠（Eptesicus fuscus）以获得代表性结果。通过采集注射氘氧化物（D2O）前和注射后的血液样本，确定了平衡时间平台期，此步骤应在所有平衡期未知的物种中进行。结果表明，在非蛰伏状态的蝙蝠中，注射后两小时足以完成平衡。在已知平衡时间后，测定了13只野生捕获的大棕蝠和8只圈养大棕蝠的总体水含量、瘦体重和体脂质量（表2）。另有2只野生捕获的大棕蝠和5只圈养大棕蝠被测定为体脂质量为负值。体脂质量为负值可能由以下一个或多个原因导致：未完全接受氘氧化物剂量、在平衡期间进入蛰伏状态、具有异常大的脂肪质量而瘦体重极小，或蝙蝠体脂含量低于通过DXA测定的3%−5%（表3）。
白鼻综合征已导致多种蝙蝠种群数量下降，因此该技术被与使用...

本文介绍了在两种哺乳动物（一种食虫动物和一种食肉动物）中使用重水稀释技术测定总体水、瘦体重、体脂量以及水消耗量的方法。

体况评分系统和体况指数是用于评估物种健康状况或适应性的常用技术。体...

利用本实验方案，可使用重水（D2O）——一种非放射性、稳定的水同位素——来估算身体成分和饮水量。该技术具有非侵入性，因此可用于濒危物种、人类以及家养动物的身体成分评估。重水稀释法的一项独特应用在于，能够对重捕率较高的自由活动野生动物或群居饲养的动物测量其饮水量。虽然无需麻醉，但对于不熟悉皮下注射操作的人员来说，在给予重水前对动物进行镇静可能会更方便。本次操作将由兽医专业学生阿曼达·埃舍尔曼（Amanda Eshelman）和阿什莉·考恩（Ashley Cowan）以及我实验室的研究生艾丽西亚·罗伊施彻（Alicia Roistacher）与莎拉·胡珀（Sarah Hooper）和我共同示范。配制50毫升浓度为每升9克的生理盐水重水储备液时，首先称取450毫克药用级氯化钠，并精确记录至小数点后四位。将全部盐转移至一个已灭菌的100毫升烧杯中，并在无菌量筒中量取50克纯度大于或等于99.8%的重水。精确记录重水的质量至小数点后四位，然后将重水转移至盛有氯化钠的无菌烧杯中。接着，将一根20号针头连接到带有亚微米孔径的无热原、无菌滤膜盘上，并装上一个10毫升注射器筒，随后将针头插入一个无菌、空的100毫升小瓶的隔膜中。将真空管连接至22号针头，然后将针头插入100毫升小瓶的隔膜中。接着，将10毫升等渗氯化钠溶液吸入注射器筒内，缓慢开启真空，直至重水溶液开始缓慢过滤进入小瓶。继续将重水储备液倒入注射器筒中，直到全部50毫升体积完成过滤。在确认麻醉后的蝙蝠对脚趾夹捏无反应后，使用酒精棉片清洁股间膜上的股间静脉区域，并使消毒后的尾膜自然干燥。在股间静脉上涂抹一层薄薄的凡士林，用29号针头穿刺股间静脉的背侧部分，然后使用塑料肝素化毛细管采集100 µL血液。为确保全血与肝素钠充分混匀，在贴标签前，采血后应轻轻滚动每支试管。确定需注射的重水质量（单位为克）后，用配备29号针头的胰岛素注射器抽取相应体积的重水。称量装有重水的胰岛素注射器及针头，记录重量至小数点后四位，并将全部体积的重水注射至麻醉蝙蝠背部髋部区域的皮下。建议使用带有防静电挡板的精密天平，并在注射前务必回拉活塞，以确保产生负压。注射后立即称量已空的胰岛素注射器和针头，并将重量记录至小数点后四位。采血后30分钟内，使用血细胞比容离心机以10,000 × g离心每个毛细管5分钟。使用锋利的剪刀在全血与血浆之间剪断塑料毛细管，然后用200微升移液器将血浆直接排入已标记的500微升储存管中。平衡期结束后，按照上述方法，从股间静脉再次采集并储存100微升血液。进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析时，将沙浴温度设定为60摄氏度以促进蒸馏，并将每份血浆样品和标准品各50微升分别加入1.5毫升锥形微量离心管盖中。将微量离心管盖倒置，将1.5毫升锥形微量离心管旋紧在管盖上，并将倒置的管子与砂浴中的砂子接触，至少放置12小时。次日早晨，为每根管子换上新的洁净管盖，在微量离心机中瞬时离心10秒。将液体透射池安装到傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）中，并用甲醇填充透射池。连接进样口，并在小心移除甲醇注射器的同时，缓慢用背景水填充样品池，以降低产生气泡的风险。将管路连接至出口端，以便在分析后移除样品，并打开傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）软件。根据表格设置参数，并使用稀释剂——经0.22微米滤膜过滤的蒸馏水——采集背景样品。注入40微升浓度为百万分之零的重水标准品，并记录和保存光谱数据为逗号分隔值文件。在注入并保存所有标准品的光谱以建立标准曲线后，将每份蒸馏样品各40微升注入液体透射池中，并保存其光谱。在已知平衡时间的条件下，可测定野外捕获和圈养大棕蝠的总体水含量、去脂体重及体脂质量。由于以下一个或多个原因，可能会计算出负的体脂质量：未接受完整的重水剂量、在平衡阶段进入麻痹状态、具有异常大的脂肪质量及极小的瘦体重质量，或通过双能X射线吸收测定法测定的体脂含量低于3%至5%。此处展示了通过重水稀释法测定的体脂百分比与双能X射线吸收测定法的代表性比较结果。两种技术具有良好的相关性，体脂质量与体重之间表现出强相关性，且重水稀释法在测定体脂质量时并未持续地高估或低估结果。氧化氘稀释法此前已在猫中得到验证，该技术经过调整，可用于测量群养猫在实验各饮食阶段的每日饮水量。请注意，该技术仅适用于健康动物，且应对每只动物准确称重、记录并给予足量的氧化氘。可采用其他体成分测定方法（如全尸分析或双能X射线吸收测定法）来验证氧化氘技术的准确性。该技术使我们能够识别出一只群养但饮水量异常高的猫，而无需将每只猫分开以测量其各自的饮水量。

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科研

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环境

使用氧化二氮作为评估哺乳动物体内成分和耗水量的非侵入性、非致命性工具

在利用小鼠肥胖模型的研究中，脂肪含量分析是常规操作。小型动物CT成像与分析的新兴方法为纵向、详尽的脂肪含量分析提供了可能。本文将逐步详细介绍进行小型动物CT成像、分析及可视化的方法流程。...

使用X射线计算机断层扫描对小鼠肥胖模型中的脂肪体积进行分割与测量

来源：Tokunou, Y., 等，电化学检测重氢动力学同位素效应对Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递的影响。J. Vis. Exp.

利用重水测量微生物电子传递的动能同位素效应

本方案描述了使用体成分分析仪和代谢动物监测系统来表征小鼠体成分及代谢参数的方法。以高脂饮食诱导的肥胖模型为例，展示了这些技术的应用。...

高脂饮食小鼠的身体成分与代谢笼分析

本文介绍了一种全细胞电化学实验方案，用于研究质子传递对Shewanella oneidensis...

电化学检测Shewanella oneidensis MR-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

本文介绍了测量线粒体耗氧量（营养能量学的核心概念）以及质子漏（线粒体生成ATP效率低下的主要原因）的方法。这些结果可解释营养利用过程中30%的能量损失，有助于评估线粒体功能。...

测量荷斯坦奶牛肝脏线粒体耗氧量和质子泄漏动力学以估算线粒体呼吸

本文介绍了一种利用重水（deuterium oxide）和气相色谱-质谱联用技术（GCMS）分析总脂肪酸的经济型定量方法 从头合成 棕色脂肪组织中的脂质生成 体内.

定量测定 从头合成 利用重水研究棕色脂肪组织中的脂肪酸合成

我们介绍一种利用氘代水（重水...

芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

本文介绍了一系列检测方法，用于独立于哺乳动物细胞消耗分子氧能力之外直接测量其线粒体功能。...

不依赖氧气的哺乳动物线粒体功能检测方法

本文详细介绍了双向轴向传输（BDAT）超声设备的测量方案，并在一项可重复性研究中进行了测试，共纳入14名健康受试者和3名操作人员。以组内相关系数（ICC）评估的可靠性在四个关注参数上均表现良好至优异。...

使用超声导波评估皮质骨：一项健康人群中的可重复性研究

本实验旨在通过使用2H2O或U13C葡萄糖进行稳定同位素标记，结合代谢组学分析，鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的代谢物。将氘标记的雄性个体与未标记的雌性个体交配，收集着床前胚胎，利用质谱分析技术区分父源（氘化）与母源（非氘化）代谢物。...

稳定同位素 体内 用于质谱鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的父源代谢物的标记方法

了解使用氧化氘稀释技术评估哺乳动物体内水分、瘦体重和脂肪含量的非侵入性方法。该技术适用于濒危物种、家养动物及自由放养野生动物的生理学研究。

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