通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

我们的数据表明，在将人诱导多能干细胞来源的心肌细胞移植到梗死动物心脏后，短暂抑制 Rho-激酶活性可增强细胞的黏附、存活和植入效果。我们提供了一种简单、低成本且高效的策略，用于提高移植的人诱导多能干细胞来源心肌细胞在受损动物心脏中的植入率。由于该技术能够安全、高效地改善急性心肌梗死和心力衰竭中的细胞植入率，因而有助于改善心脏功能、血管生成及细胞凋亡情况。

尽管我们仅在人诱导多能干细胞（hiPSCs）中测试了本实验方案，但这些方法也可应用于其他类型的细胞，例如胚胎干细胞、间充质干细胞等。Y-27632处理的剂量和持续时间至关重要。视频演示能够详尽展示方案中的所有关键步骤，对于从未操作过该技术的研究人员尤为有益。

在hiPSC-CM分化后的第21天，吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞一次。每孔加入0.5毫升细胞解离酶，在37摄氏度下孵育5至7分钟。孵育结束后，使用1毫升移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。

然后，向每个孔中加入1毫升中和液，将细胞混合物收集至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。离心结束后，弃去上清液，并用中和液重悬细胞。随后，将细胞以每孔200万个细胞的密度重新接种至明胶包被的6孔板中。

培养24至48小时后，将培养基更换为纯化培养基，继续培养3至5天。移植前，将处理组细胞在添加了10微摩尔Y-27632的RB-plus培养基中培养12小时。同样，将维拉帕米处理组细胞在含1微摩尔维拉帕米的RB-plus培养基中培养12小时。

处理后，用 PBS 洗涤 hiPSC-CMs 一次，每孔加入 0.5 µL 细胞解离酶，孵育时间最长为两分钟。使用 1 mL 移液器反复吹打细胞悬液，充分解离细胞。接着，用中和液中和细胞，将细胞混合液收集至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。

离心后，将细胞重悬于 PBS 中，浓度为每 5 微升含 0.1 百万个细胞，以备注射。在心肌梗死诱导后立即向小鼠心肌的每个位点注射 5 微升对照 hiPSC-CMs、Y-27632 预处理的 hiPSC-CMs、维拉帕米处理的 hiPSC-CMs 或等体积的 PBS，每个动物注射三个位点：一个位于梗死区域，两个位于梗死周围区域。在进行钙瞬变和收缩力检测前 12 小时，向 hiPSC-CMs 的培养基中加入 10 微摩尔 Y-27632、100 纳摩尔 RA、1 微摩尔维拉帕米或等体积的 PBS。

接下来，弃去培养基，用 PBS 洗涤培养板一次。更换为不含酚红的 DMEM 培养基，其中添加 0.02%（重量/体积）的表面活性剂聚醇、5 µM 钙离子指示剂以及相应浓度的 Y-27632、维甲酸（RA）、维拉帕米或等体积的 PBS，将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟。孵育结束后，弃去上清液，用不含染料的 DMEM 洗涤细胞 3 次，然后加入培养基静置 30 分钟，以完成示踪染料的去酯化反应。

将接种细胞的盖玻片置于开放式浴槽室中，并将该室放入已通过自动温度控制器平衡至37摄氏度的微型培养系统内。用Tyrode溶液灌流，并持续将RI、RA或PBS加入灌流液中。使用倒置荧光显微镜和激光扫描头，通过x-t线扫描记录自发性钙瞬变。

使用共聚焦显微镜的微分干涉差（DIC）功能记录hiPSC-CMs的自发性收缩。通过增强的荧光素酶活性确认移植细胞的存活率。人源心肌肌钙蛋白T和人源核抗原表达的增加表明，Y-27632预处理可显著提高细胞移植率。

经 Y-27632 预处理的细胞表现出更大且更清晰的杆状细胞骨架结构。此外，Y-27632 预处理减少了 TUNEL 阳性细胞，表明移植的 hiPSC-CM 在体内凋亡减少。Western blot 结果显示，Y-27632 预处理可上调整合素 β-1 和 N-钙黏蛋白的表达，同时下调磷酸化肌球蛋白轻链 2 的表达。

该变化在撤除 Y-27632 后 72 小时趋于正常。体外小鼠 HL-1 细胞黏附实验表明，与 HL-1 细胞相比，Y-27632 预处理显著提高了 hiPSC-CM 的黏附能力。Y-27632 预处理降低了收缩力、钙瞬变荧光峰值以及钙瞬变持续时间。

Y-27632 预处理通过显著降低 cTnI 和 cTnT 的表达来调控心肌细胞收缩。与 Y-27632 相似，维拉帕米预处理提高了荧光素酶活性以及 hcTnT/HNA 双阳性细胞的数量。最关键的步骤是将处理组细胞在添加了 10 µM Y-27632 的 Rb-plus 培养基中培养 12 小时。

基于该方法，Y-27632 的缓释以进一步提高细胞移植率是一种有前景的策略。该技术为研究人员在体内研究 hiPSC 来源心肌细胞的生理学与功能奠定了基础。用于心肌细胞分化的 小分子 CHIR99021 具有危害性，可能引起呼吸道刺激。

请勿以任何方式摄入或吸入。