Name: 通过对Rho激酶活性的暂时抑制,增强人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞的诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解通过Rho激酶抑制剂Y-27632预处理增强人诱导多能干细胞衍生心肌细胞移植效率的方法。该技术可显著提高细胞在心肌梗死模型中的存活率和植入率，为心脏再生医学研究提供低成本高效方案。

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作者感谢斯坦福大学的 Joseph C. Wu 博士慷慨提供 Fluc-GFP 载体，以及 Yanwen Liu 博士提供的出色技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 RO1 HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764（资助对象：J.Z.），HL121206A1（资助对象：L.Z.），R56 HL142627（资助对象：W.Z.），美国心脏协会科学家发展基金 16SDG30410018，以及阿拉巴马大学伯明翰分校教师发展基金（资助对象：W.Z.）。

本研究中的所有动物实验程序均经阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院实验室动物照护与使用指南（NIH出版物第85-23号）。
1. 培养基和培养板的制备
<ol>
	<li>培养基制备
	<ol>
		<li>对于hiPSC培养基，将400 mL人多能干细胞（hPSC）基础培养基（材料表1）与100 mL hPSC 5倍补充剂混合；于4 °C保存。</li>
		<li>对于RPMI 1640/B27不含胰岛素（RB-）培养基，将500 mL RPMI 1640与10 mL不含胰岛素的B27补充剂混合。</li>
		<li>对于RPMI 1640/B27（RB+）培养基，将500 mL RPMI 1640、10 mL B27补充剂和5 mL青霉素-链霉素（pen-strep）抗生素混合。</li>
		<li>对于纯化培养基16，将500 mL无葡萄糖RPMI 1640、10 mL B27补充剂、5 mL pen-strep抗生素和1,000 μL DL-乳酸钠溶液（终浓度为4 mM）混合。</li>
		<li>对于中和溶液，将200 mL RPMI 1640、50 mL胎牛血清（FBS）、2.5 mL pen-strep抗生素和50 μL Y-27632（终浓度为10 μM）混合。</li>
		<li>对于冻存培养基，将9 mL FBS、1 mL二甲基亚砜（DMSO）和10 μL Y-27632（终浓度为10 μM）混合。</li>
		<li>对于细胞外基质溶液（EMS），在4 °C条件下解冻浓缩的细胞外基质（材料表1），直至其完全变为均匀液体状态。在冰上操作前，预先冷却移液器吸头和离心管，将基质分装为每份350 µL，于-20 °C保存。在包被培养板前，将一份解冻的分装物溶于24 mL预冷的DMEM/F12培养基中（EMS）；EMS可在4 °C保存最多2周。 
		注意：所有包被步骤均需在冰上进行，以防止基底膜基质凝固。</li>
		<li>对于Tyrode溶液，取所需终体积90%的组织培养级水，加入适量以下试剂，并搅拌至完全溶解。然后用1 N NaOH调节pH至7.4。加水至终浓度为140 mmol/L氯化钠、1 mmol/L氯化镁、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L氯化钾、10 mmol/L葡萄糖和1.8 mmol/L氯化钙。使用0.22 µm滤膜过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养板包被
	<ol>
		<li>对于hiPSC培养板，向6孔板的每孔加入1 mL EMS，在37 °C孵育至少1小时。接种细胞前吸除DMEM/F12溶液。</li>
		<li>对于明胶包被，将0.2 g明胶粉末溶于组织培养级水中，配制成0.2%（w/v）溶液。在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟。每孔加入2 mL该溶液包被6孔板，在37 °C孵育1小时。传代细胞前，吸除溶液，并在组织培养超净台内室温干燥至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. hiPSC 的维持与心肌细胞分化
<ol>
	<li>将hiPSCs在hiPSC培养基（见步骤1.1.1）中培养，每天更换培养基，直至每个孔的细胞汇合度达到80%–90%。 
	注意：为维持培养，hiPSCs通常每4天左右可传代一次。</li>
	<li>传代hiPSCs时，吸除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔内细胞1次。每孔加入0.5 mL干细胞解离溶液（材料表1），于37 °C孵育5–7分钟。 
	注意：孵育时间取决于细胞密度和解离速度，可在显微镜下观察判断。</li>
	<li>用1 mL添加了5 μM Y-27632的hiPSC培养基中和干细胞解离溶液。将混合液收集至15 mL离心管中，以200 × g离心5分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于1 mL含5 μM Y-27632的hiPSC培养基中。</li>
	<li>按1:6至1:18的比例，将hiPSCs接种至新的EMS包被的6孔板中。24小时后更换为不含Y27632的hiPSC培养基。</li>
	<li>冻存细胞时，将解离后的hiPSCs重悬于冻存液中，浓度为每500 μL含0.5–1×10⁶个细胞，将细胞悬液分装至冻存管中，置于-80 °C冰箱中保存。24小时后转移至液氮中长期保存。</li>
	<li>诱导分化时，在细胞汇合度达80%–90%时，将hiPSC培养基更换为2 mL添加10 μM GSK-3β抑制剂CHIR99021（CHIR）的RB-培养基。24小时后更换为3 mL RB-培养基，继续孵育48小时（第3天）。</li>
	<li>第3天，更换为含10 μM Wnt抑制剂IWR1的3 mL RB-培养基，作用48小时（至第5天），随后更换为3 mL RB-培养基，继续维持培养48小时（至第7天）。</li>
	<li>第7天，将培养基更换为3 mL RB培养基，并自此每3天更换一次培养基。hiPSC-CMs的自发性搏动通常在第7至10天之间出现。</li>
</ol>
3. hiPSC-CMs 的纯化与小分子预处理
注意：采用高纯度的重组细胞解离酶（材料表 1）对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）进行解离。
<ol>
	<li>在hiPSC-CM分化后的第21天，吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞1次。每孔加入0.5 mL细胞解离酶，在37 °C孵育5–7分钟。使用1 mL移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。</li>
	<li>细胞解离后，每孔加入1 mL中和液，将细胞混合物收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，用中和液重悬细胞。</li>
	<li>以每孔200万个细胞的密度，将细胞重新接种至明胶包被的6孔板中。</li>
	<li>24–48小时后，将培养基更换为纯化培养基，持续培养3–5天。 
	注意：当显微镜下每个视野中超过90%的细胞出现搏动时，表明纯化完成。为避免对心肌细胞造成进一步损伤，纯化时间不应超过5天。若第一轮纯化未达到所需纯度，可先用RB+培养基培养1天，再进行第二轮纯化。</li>
	<li>移植前，将处理组细胞在添加了10 μM Y-27632的RB+培养基中培养12小时。同样，将另一组细胞在含1 μM维拉帕米的RB+培养基中处理12小时（hiPSC-CMs+VER）。</li>
	<li>处理结束后，用PBS洗涤hiPSC-CMs 1次，每孔加入0.5 mL细胞解离酶，孵育时间最多不超过2分钟。使用1 mL移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。用中和液中和细胞，将细胞混合物收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至0.1百万个细胞/5 μL，以备注射使用。</li>
</ol>
4. 心肌梗死与细胞移植
注意：所有手术器械均经高压灭菌器预灭菌，并在多次手术过程中通过热珠灭菌器（材料表 2）保持无菌状态。
<ol>
	<li>使用吸入式异氟烷（1.5%–2%）对 NOD/scid 小鼠（材料表 2）进行麻醉。通过脚趾夹捏反应监测麻醉深度。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止手术期间角膜干燥。</li>
	<li>术前皮下注射 0.1 mg/kg 布托啡诺以进行镇痛管理。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于加热手术台上，使用脱毛膏去除颈部腹侧及左侧胸部的毛发，暴露皮肤后用 70% 酒精消毒。</li>
	<li>使用手术剪在颈部中央做 0.5 cm 切口，用无菌镊子分离皮下脂肪组织，暴露气管。经口将插管套管插入气管，连接至小型动物呼吸机，并调节通气参数（设定潮气量为 100–150 μL，呼吸频率为 100–150 次/分钟）。</li>
	<li>待小鼠生命体征稳定后，在左侧胸壁皮肤中部做 0.5 cm 切口。用镊子钝性分离肌层，在第五肋间做小切口以暴露胸腔。将牵开器置入切口以打开胸腔，定位左前降支冠状动脉（LAD）。在解剖显微镜下，使用 8-0 不可吸收缝线结扎 LAD。</li>
	<li>心肌梗死（MI）诱导后立即向小鼠心肌内注射 5 μL 的 hiPSC-CMs-RI、hiPSC-CMs+RI、hiPSC-CMs-VER、hiPSC-CMs+VER 或等体积 PBS（每只动物 3 × 105 个细胞，每注射位点 1 × 105 个细胞），分别注射至梗死区域及梗死周围两个区域。 
	注意：由于 5 μL 体积极小，直接用注射器吸取难以精确控制。可将无菌培养皿盖翻转，先用移液器将 5 μL 细胞悬液滴加于盖内表面。由于表面张力作用，液滴不会扩散，而是凝聚成小液珠，便于准确吸取并注入小鼠心肌组织。</li>
	<li>用温热的等渗盐水填充胸腔以排除残留空气。依次使用 6-0 可吸收缝线缝合肋骨、肌肉和皮肤。关闭异氟烷麻醉气体供应。术后将动物置于加热垫上，密切观察直至完全清醒。随后将动物转移至清洁笼具中饲养。在动物完全恢复前，不得将其与其他动物合笼。</li>
	<li>术后每隔 12 小时腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg），连续给药 3 天；每隔 12 小时注射布洛芬（5 mg/kg），持续 1 天。在指定时间点进行后续分析研究。 
	注意：镇痛处理应遵循当地动物护理委员会的相关指南。</li>
</ol>
5. 钙瞬变与收缩性记录
<ol>
	<li>高压灭菌15 mm直径的盖玻片（材料表 2）和镊子放入小玻璃烧杯中，在121 °C、15 psi条件下灭菌15分钟。将盖玻片和镊子在4 °C预冷。</li>
	<li>使用镊子将盖玻片放入12孔板中，每孔加入300 μL细胞外基质。 
	注意： 不要让基质超过盖玻片边缘，以防止基质包被量减少。将12孔板置于37 °C细胞培养孵箱中孵育1 h。</li>
	<li>吸弃已包被明胶的6孔板中含纯化hiPSC-CMs的培养基，用PBS洗涤1次，加入0.5 mL细胞解离酶消化1.5 min。加入1 mL中和液，用1 mL移液器反复吹打不超过5–10次，将混合液于200 × g离心 g 3 分钟。</li>
	<li>吸弃盖玻片上的包被细胞外基质。计数细胞数量，将细胞重悬于中和溶液中，调整浓度为40,000/300 μL，然后向每张盖玻片加入300 μL细胞悬液。将培养板置于37 °C培养箱中培养。</li>
	<li>24小时后，轻轻吸除中和液，每孔加入500 μL RB+培养基，继续培养2天。</li>
	<li>在检测钙瞬变和收缩性前12小时，向hiPSC-CMs的培养基中加入Y-27632（10 μM）、Rho激酶激活剂（RA，100 nM）、维拉帕米（1 μM）或等体积的PBS。 
	注意： 除了在化学处理12小时后检测细胞的钙瞬变和收缩性外，还在撤除化学处理后的12、24、48和72小时检测了这些参数。</li>
	<li>取出培养板，弃去培养基，用 PBS 洗涤 1 次。更换为不含酚红的 DMEM 培养基，其中添加 0.02%（w/v）表面活性剂聚醇（材料表 1），5 μM 钙离子指示剂（材料表 1），并分别加入相应体积的 Y-27632（10 μM）、RA（100 nM）、维拉帕米（1 μM）或等体积 PBS，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用不含染料的DMEM培养基洗涤细胞3次，然后静置培养基30分钟，使示踪染料去酯化。</li>
	<li>将接种细胞的盖玻片置于开放式浴槽室中，并将该室放入已通过自动温度控制器平衡至 37 °C 的微孵育系统内材料表 2），用台氏液灌注，并持续向灌注液中加入Rho激酶抑制剂（RI）、RA或PBS。</li>
	<li>使用倒置荧光显微镜（材料表 2）和一个激光扫描头（材料表 2) 采用x-t线扫描模式记录自发性钙瞬变，使用488 nm氩离子激光器激发荧光染料，并通过515 ± 10 nm带通滤光片收集发射光。利用共聚焦显微镜的微分干涉差（Differential Interference Contrast）功能记录hiPSC-CMs的自发性收缩。材料表 2).   
	注意： 钙瞬变记录使用 MATLAB R2016A 软件进行处理和分析（材料表 4）。细胞收缩变化检测使用 ImageJ 软件进行材料表 4).</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究的关键步骤包括获取纯化的hiPSC-CMs，通过Y-27632预处理提高hiPSC-CMs的活性，最后将精确数量的hiPSC-CMs移植到小鼠心肌梗死模型中。
本文解决的关键问题首先是优化了无葡萄糖的纯化方法19，并建立了一种新型高效的纯化体系。该体系的操作流程包括使用细胞解离酶、将细胞重植于明胶包被的培养板中、重铺板后在中和培养基中培养24小时，以及尽量缩短移植前的细胞消化时间。上述所有步骤均旨在获得高纯度心肌细胞的同时，确保细胞具有最高的活性。
其次，我们详细阐述了在细胞注射前12小时使用Y-27632对hiPSC-CMs进行预处理。细胞脱离基质引发的失巢凋亡（anoikis）通常由细胞黏附蛋白（如整合素4,20和N-钙黏蛋白21）的改变所诱导，进而激活凋亡通路。我们证明，Y-27632预处理可通过维持整合...

基于干细胞的疗法在治疗由心肌梗死（MI）引起的心脏损伤方面已显示出相当大的潜力1。利用已分化的hiPSC可提供无限来源的hiPSC-CM2，并为突破性治疗方法的快速开发开辟了道路。然而，该疗法在转化应用方面仍存在诸多局限，包括移植细胞的极低定植率这一挑战。
使用胰蛋白酶消化细胞会启动失巢凋亡3，当这些细胞被注射到缺血心肌等恶劣环境时，缺氧环境会进一步加速细胞走向死亡的过程。在剩余的细胞中，很大一部分会从移植部位被冲刷进入血液循环，并扩散至外周组织。其中一条关键的凋亡通路是 RhoA/ROCK 通路4。根据既往研究，RhoA/ROCK 通路可调控肌动蛋白细胞骨架的组装5,6，而后者与细胞功能障碍密切相关7,8。ROCK 抑制剂 Y-27632 在体细胞和干细胞的消化与传代过程中被广泛应用，以增强细胞黏附并减少细胞凋亡9,10,11。本研究中，Y-27632 被用于移植前处理 hiPSC-CMs，旨在提高细胞的移植存活率。
已有多种旨在提高细胞移植率的方法被建立，例如热激处理和基底膜基质包被12。除这些方法外，基因技术也可促进心肌细胞增殖13，或将非心肌细胞重编程为心肌细胞14。从生物工程的角度来看，可将心肌细胞接种于生物材料支架上以提高移植效率15。然而，大多数此类方法操作复杂且成本较高。相比之下，本文提出的方法简便、经济且有效，既可作为移植前的基础处理手段，也可与其他技术联合使用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase（干细胞解离溶液）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 不含胰岛素</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（1×），高糖，含 HEPES，不含酚红</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM（钙离子指示剂）</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖 RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（细胞外基质）</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR（人多能干细胞培养基）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素抗生素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127（表面活性多元醇）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rho 激活剂 II</td><td>Cytoskeleton</td><td>CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>DL-乳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE（细胞解离酶）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>维拉帕米</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III 生物发光成像仪</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm 盖玻片</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>双通道自动温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描头</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>低剖面开放式灌流腔室（安装于上述微孵育系统）</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>微孵育系统</td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent 小鼠呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>预制蛋白凝胶</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 转膜试剂盒</td><td>BIO-RAD</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot 转膜系统</td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人核仁素（Alexa Fluor 647）</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>心肌肌钙蛋白 T</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>心肌肌钙蛋白 C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>心肌肌钙蛋白 I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-驴抗小鼠</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-驴抗兔</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-驴抗小鼠</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>人源心肌肌钙蛋白 T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>整合素 &amp;beta;1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-钙黏蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化肌球蛋白轻链 2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

通过瞬时抑制rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

提高细胞治疗在心肌再生中有效性的关键因素是安全且高效地提升细胞植入率。Y-27632 是一种高效的选择性 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（RhoA/ROCK）抑制剂，可用于防止因细胞解离诱导的细胞凋亡（失巢凋亡）。我们证明，在急性心肌梗死（MI）小鼠模型中，移植前对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs+RI）进行 Y-27632 预处理，可显著提高细胞的植入率。本文详细描述了 hiPSC-CMs 的分化、纯化及 Y-27632 预处理的完整操作流程，以及后续的细胞收缩功能检测、钙瞬变测量和向小鼠 MI 模型的细胞移植步骤。该方法提供了一种简便、安全、有效且低成本的技术方案，可显著提升细胞植入率。该方法不仅可与其他技术联合使用以进一步提高细胞移植效率，也为其他心脏疾病机制的研究提供了有利基础。

本研究中使用的hiPSC-CMs来源于人类，并携带荧光素酶报告基因；因此，通过生物发光成像（BLI）17检测移植细胞在体内的存活率（图1A、B）。对于心脏组织切片，人特异性心肌肌钙蛋白T（hcTnT）与人核抗原（HNA）双阳性细胞被定义为成功植入的hiPSC-CMs（图1C）。两项结果均表明，Y-27632预处理显著提高了细胞的植入率。与hiPSC-CM-RI组相比，hiPSC-CM+RI组在移植后第3、7和28天的荧光素酶活性大约提高了六倍（图1B）。此外，相对于hiPSC-CM-RI组，hiPSC-CM+RI组中hcTnT/HNA的表达量接近提高了七倍（图1C）。<...

在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

提高细胞治疗在心肌再生中有效性的关键因素是安全且高效地提升细胞植入率。

我们的数据表明，在将人诱导多能干细胞来源的心肌细胞移植到梗死动物心脏后，短暂抑制 Rho-激酶活性可增强细胞的黏附、存活和植入效果。我们提供了一种简单、低成本且高效的策略，用于提高移植的人诱导多能干细胞来源心肌细胞在受损动物心脏中的植入率。由于该技术能够安全、高效地改善急性心肌梗死和心力衰竭中的细胞植入率，因而有助于改善心脏功能、血管生成及细胞凋亡情况。尽管我们仅在人诱导多能干细胞（hiPSCs）中测试了本实验方案，但这些方法也可应用于其他类型的细胞，例如胚胎干细胞、间充质干细胞等。Y-27632处理的剂量和持续时间至关重要。视频演示能够详尽展示方案中的所有关键步骤，对于从未操作过该技术的研究人员尤为有益。在hiPSC-CM分化后的第21天，吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞一次。每孔加入0.5毫升细胞解离酶，在37摄氏度下孵育5至7分钟。孵育结束后，使用1毫升移液器反复吹打细胞悬液，以充分解离细胞。然后，向每个孔中加入1毫升中和液，将细胞混合物收集至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心3分钟。离心结束后，弃去上清液，并用中和液重悬细胞。随后，将细胞以每孔200万个细胞的密度重新接种至明胶包被的6孔板中。培养24至48小时后，将培养基更换为纯化培养基，继续培养3至5天。移植前，将处理组细胞在添加了10微摩尔Y-27632的RB-plus培养基中培养12小时。同样，将维拉帕米处理组细胞在含1微摩尔维拉帕米的RB-plus培养基中培养12小时。处理后，用 PBS 洗涤 hiPSC-CMs 一次，每孔加入 0.5 µL 细胞解离酶，孵育时间最长为两分钟。使用 1 mL 移液器反复吹打细胞悬液，充分解离细胞。接着，用中和液中和细胞，将细胞混合液收集至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。离心后，将细胞重悬于 PBS 中，浓度为每 5 微升含 0.1 百万个细胞，以备注射。在心肌梗死诱导后立即向小鼠心肌的每个位点注射 5 微升对照 hiPSC-CMs、Y-27632 预处理的 hiPSC-CMs、维拉帕米处理的 hiPSC-CMs 或等体积的 PBS，每个动物注射三个位点：一个位于梗死区域，两个位于梗死周围区域。在进行钙瞬变和收缩力检测前 12 小时，向 hiPSC-CMs 的培养基中加入 10 微摩尔 Y-27632、100 纳摩尔 RA、1 微摩尔维拉帕米或等体积的 PBS。接下来，弃去培养基，用 PBS 洗涤培养板一次。更换为不含酚红的 DMEM 培养基，其中添加 0.02%（重量/体积）的表面活性剂聚醇、5 µM 钙离子指示剂以及相应浓度的 Y-27632、维甲酸（RA）、维拉帕米或等体积的 PBS，将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟。孵育结束后，弃去上清液，用不含染料的 DMEM 洗涤细胞 3 次，然后加入培养基静置 30 分钟，以完成示踪染料的去酯化反应。将接种细胞的盖玻片置于开放式浴槽室中，并将该室放入已通过自动温度控制器平衡至37摄氏度的微型培养系统内。用Tyrode溶液灌流，并持续将RI、RA或PBS加入灌流液中。使用倒置荧光显微镜和激光扫描头，通过x-t线扫描记录自发性钙瞬变。使用共聚焦显微镜的微分干涉差（DIC）功能记录hiPSC-CMs的自发性收缩。通过增强的荧光素酶活性确认移植细胞的存活率。人源心肌肌钙蛋白T和人源核抗原表达的增加表明，Y-27632预处理可显著提高细胞移植率。经 Y-27632 预处理的细胞表现出更大且更清晰的杆状细胞骨架结构。此外，Y-27632 预处理减少了 TUNEL 阳性细胞，表明移植的 hiPSC-CM 在体内凋亡减少。Western blot 结果显示，Y-27632 预处理可上调整合素 β-1 和 N-钙黏蛋白的表达，同时下调磷酸化肌球蛋白轻链 2 的表达。该变化在撤除 Y-27632 后 72 小时趋于正常。体外小鼠 HL-1 细胞黏附实验表明，与 HL-1 细胞相比，Y-27632 预处理显著提高了 hiPSC-CM 的黏附能力。Y-27632 预处理降低了收缩力、钙瞬变荧光峰值以及钙瞬变持续时间。Y-27632 预处理通过显著降低 cTnI 和 cTnT 的表达来调控心肌细胞收缩。与 Y-27632 相似，维拉帕米预处理提高了荧光素酶活性以及 hcTnT/HNA 双阳性细胞的数量。最关键的步骤是将处理组细胞在添加了 10 µM Y-27632 的 Rb-plus 培养基中培养 12 小时。基于该方法，Y-27632 的缓释以进一步提高细胞移植率是一种有前景的策略。该技术为研究人员在体内研究 hiPSC 来源心肌细胞的生理学与功能奠定了基础。用于心肌细胞分化的 小分子 CHIR99021 具有危害性，可能引起呼吸道刺激。请勿以任何方式摄入或吸入。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

通过对Rho激酶活性的暂时抑制,增强人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞的诱导

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。...

心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。...

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

了解通过Rho激酶抑制剂Y-27632预处理增强人诱导多能干细胞衍生心肌细胞移植效率的方法。该技术可显著提高细胞在心肌梗死模型中的存活率和植入率，为心脏再生医学研究提供低成本高效方案。

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

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