多点PCR和毛细血管电泳对鱼类致病菌的多点变量数串联重复分析

这一MLB基因分型协议极大地增进了我们对国际重要鱼类致病性细菌Yersinia ruckeri的流行病学和全球种群结构的了解。与以前建立的 Yersinia ruckeri 打字方案相比，它提供了非常高的应变分辨率。该程序简单、便宜，可奖励可跨实验室轻松比较的便携结果。

该技术大大提高了诊断特异性，并实现了感染追踪。例如，我们现在可以经常区分在非毒环境菌株的背景下存在的毒的Yersinia ruckeri克隆。演示这个程序的将是赛马·纳斯林·穆罕默德，我们实验室的技术人员。

首先，使用无菌接种循环播种出耶尔西尼亚鲁赫里纯培养任何合适的阿加类型在培养皿。在22摄氏度下孵育一至两天或15摄氏度3至4天。之后，使用接种循环，从每个培养皿中挑选一个具有代表性的菌落，并转移到1.5毫升离心管，含有50微升超纯水，以重新暂停。

涡流在100摄氏度的加热块上短暂孵育7分钟。然后，在16，000克的离心机3分钟，并使用移液器小心地将上流模板DNA转移到空的1.5毫升离心管中。继续执行下一步，或将DNA储存在20摄氏度。

要准备主混合物，首先根据要分析的细菌样本数量计算试剂体积，还占一个阴性对和一个阳性对照，最后10%的剩余体积，详见手稿。请注意，使用不同的底向度浓度。在两个独立的离心管中，每PCR测定一个，添加多路复用PCR加主混合、底流和无RNase水。

Vortex 准备的主混合在低速下轻轻地，然后，将每个主混合的 22 微升分别分配到 PCR 条或板上的单个孔中。然后，将制备的DNA模板的三微升添加到每个包含主混合物的井中;每个细菌样本两口，每个检测一个。使用经过验证的 Yersinia ruckeri 菌株的 DNA 进行阳性控制，使用超纯水进行阴性控制。

短暂密封和离心机。将准备好的反应加载到 PCR 热循环器上，然后根据手稿设置程序。该计划将在三小时内完成。

根据制造商的建议，加入阿加罗斯凝胶粉在一次TBE缓冲达到1.5重量/体积百分比和热量溶解。铸造前，在自来水下短暂冷却溶解凝胶溶液，每50微升凝胶溶液加入5微升荧光核酸染料并混合。组装和升级铸造盘。

根据需要添加圆锥体以适合样本数。将凝胶溶液倒入铸件中，等待其凝固。之后，将含有凝胶的铸件淹没在凝胶电泳系统中的一次 TBE 缓冲液中。

将 PCR 产品的五微升与两个微升的装料染料混合到新的 PCR 条中。将混合物的五微升转移到凝胶中的孔中。至少保存一个空井。

在空井中加入五升DNA梯子，供参考。插入电极，以每 15 厘米 110 伏特的速度运行凝胶约 1 小时。使用基于 UV 的凝胶成像系统验证是否存在代表 PRC amplicons 的多个波段。

确认 PCR 安普利森后，使用新的 PCR 条或板在纯化水中稀释 PCR 产品 1 至 10。漩涡和离心机短暂。在烟柜中工作时，在由甲酰胺和参考尺寸标准溶液组成的离心管中准备主混合物。

根据要分析的 PCR 产品数量，使用手稿中详述的试剂量。允许 10% 的剩余卷。涡流短暂地将 9.5 微升分片分配到适合可用毛细管电泳系统的 PCR 板上的单个孔中。

然后，添加0.5微升稀释PCR产品。短暂密封和离心机。然后，将含有样品的板装入 PCR 热循环器中，在 95 摄氏度下将样品变性三分钟，然后无限期地冷却至 4 摄氏度。

在 1000 g 下离心一分钟，小心地取出密封件，然后按照制造商的说明将板装到经过校准的毛细管电泳系统中。运行片段分析毛细管电泳，使用适合器具的试剂，根据手稿中的描述调整运行条件。对于 Yersinia ruckeri VNTR 毛细管电泳大小调用，首先导入毛细管电泳结果文件到基因映射器 5 软件。

将分析方法设置为"微卫星默认值"，在尺寸标准下选择适当的产品选择，然后按"分析"按钮。通过大小匹配编辑器，验证大小标准片段的正确标识，并纠正任何明显错误的分配。然后，选择要读取的示例，点击"显示绘图"按钮，然后按控件 A 以启用大小表的视图。

在顶部面板中，按住"控制"，同时单击表示 VNTR 安普利森的五个峰值。按 Control G 筛选大小表，仅显示五个突出显示峰值的特征，并记录下游应用的每个 VNTR 位点的大小调用。为了考虑毛细管电泳过程中偏置的安培移动模式，通过结合特定位置变量使用采集的尺寸调用来计算准确的 VNTR 重复计数。

该公式可以实现在电子表格模板中实现自动化。在电子表格中，舍入计算的 VNRT 重复计数到下游分析之前最接近的整数。在 BioNumerics 软件中，创建一个新数据库，并选择激活 MLVA 插件。

在实验类型面板中，按"创建新实验类型"，选择"字符类型"，并在询问时使用默认设置。然后选择新实验，并为每个 10 个 VNTR 位点添加新字符，使用零到 100 作为值范围。回到主面板中，通过选择导入字段和字符导入 Yersinia ruckeri VNTR 重复计数和方法数据。

找到存储此内容的文件，并在"目标类型"列中进行选择。对于 VNTR，这意味着选择适当的字符值，而杂项元数据被归类为输入信息字段。所做的选择可以存储为模板，以便以后简化该过程。

选择用于 MST 群集分析的导入样本，然后单击"比较"面板中的"创建新比较"按钮。如果需要用于 MST 的可视化显示，请根据特定的元数据功能将样本分配给彩色组。然后，选择"高级群集分析和 MST"以用于分类数据，以基于所选样本生成 MST 关系图。

通过添加分区参数、交叉长度、节点分支标记等，进一步修改 MST 的可视显示。如果需要，使用导出图像选择以所需的格式导出最终的 MST。在多路复用 PCR 之后，凝胶电泳图像验证所有 12 个包含样本的通道中是否存在多个安普利森，第一通道表示使用的 DNA 阶梯。

在毛细管电泳产生的电图中，不同的 VNTR 位点可以根据尺寸和染料标签的组合进行识别。橙色峰值表示采用的大小标准。根据 Yersinia Ruckeri 从五个不同挪威养殖场从大西洋鲑鱼中回收的 MLVA 配置文件，显示了一个最小生成树的例子。

可以观察到与服务器场源相关的明显聚类趋势。MLVA对以鱼类物种为主导的不同耶尔西尼亚罗赫里克隆的鉴定，已经用于改进针对这种病原体的疫苗接种策略。