从未引用的太平洋牡蛎生成虚拟序列的 cDNA 库的聚合策略
June 13th, 2019
我们描述了如何使用未引用的太平洋牡蛎标本的RNA样本的策略,并通过与公开提供的基因组数据进行比较来评估遗传物质,以生成几乎序列化的cDNA库。
我们要用这种方法解决的关键问题是，我们如何使用当地食品市场采购的材料中的RNA样本来克隆与生物技术相关的基因？在这里，我们使用太平洋牡蛎作为案例研究，以演示这种方法和潜在的进一步应用。这项技术的主要优点是可以绕过牡蛎样品的传统基因组或cDNA测序。
相反，将细胞色素c氧化酶亚基一和NADH脱氢酶的序列与太平洋牡蛎公开提供的参考序列进行比较，以选择最密切相关的标本。从该样本中编写的cDNA可以直接用于克隆与生物技术相关的基因，这些基因可以使用公共序列信息进行选择。展示这个程序的将是南京农业大学糖学和糖生物工程研究中心的两名研究生李永梅和李玉泉。
要准备牡蛎组织样本，请使用灭菌手术刀从每个牡蛎标本的近似几何中心切出约100毫克的均匀软组织。将样品转移到装满50毫升液氮的砂浆中。将闪冻的牡蛎组织研磨成细粉。
将每个标本的冷冻组织中的75毫克称重到无菌的1.5毫升离心管中，并混合一毫升硫化酸酯-酚提取试剂。此过程最关键的步骤是 RNA 提取步骤。为了最大限度地减少RNA降解，必须缩短收获牡蛎组织和RNA提取之间的时间。
将样品在14，000倍g和4摄氏度下离心15分钟。将上清液转移到新的1.5毫升离心管中，加入200微升氯仿，在涡流混合器上彻底混合10至15秒，直到混合物变成乳白色。接下来，像之前一样，离心机15分钟。
使用 200 微升移液器，小心地将上水层（而不会干扰相间）转移到新的 1.5 毫升离心管中。将500微升异丙醇加入离心管，轻轻反转以混合样品。然后将样品留在冰上20分钟。
在14，000倍的g和4摄氏度下离心8分钟，并取出上光。将颗粒重新浓缩在一毫升75%乙醇中，在14，000倍的g和4摄氏度下离心5分钟。取出所有上继剂，然后用乙醇重复洗涤。
在室温下干燥颗粒6分钟。然后，将干燥的RNA颗粒溶解在25微升DEPC处理的水中，并保持管在冰上。在24小时内使用RNA样本。
要生成 cDNA 库，首先根据手稿添加溶液，为 300 微升 PCR 管中的每个 RNA 样本制备反应混合物。将提取的RNA样品的微升加入管中。在42摄氏度下在PCR热循环器中孵育混合物60分钟，然后将温度升高至95摄氏度5分钟。
在零下 20 摄氏度下存储生成的 cDNA 库长达 12 个月。首先，在含有PCR混合物的管子中加入一个微升的cDNA库，根据手稿准备。将 PCR 管放入 PCR 热循环器中，然后执行 PCR 放大，初始变性步骤和 35 个 PCR 反应周期，包括退火步、伸长步和变性步骤（根据手稿）。
循环后，执行一个最终的伸长步骤五分钟。使用 PCR 产品的五微升通过红糖凝胶电泳验证质量。分别在759或748个碱基对上将扩增的COX1或ND基因作为单波段观察。
为了净化PCR产品的其余部分，在每个样品中加入100微升含有高浓度的超热带盐的DNA结合缓冲液。漩涡短暂地混合内容。将净化柱放入两毫升离心管中。
将反应混合物移入柱中。将装有装置的柱管以14，000倍g将装有的柱子放在离心机中，在室温下放置一分钟。在丢弃两毫升离心管中的滤液后，用 700 微升和 400 微升的洗涤溶液 W2 以 14，000 倍 g 离心洗涤两次。
接下来，在金属块加热器中加热一毫升去电水至65摄氏度。将柱转移到新的1.5毫升离心管中，将25微升的预热去电化水移液器转移到白柱膜的中心。让膜在室温下浸泡一分钟。
然后，在室温下将带柱的管以14，000倍g离心一分钟。丢弃柱，在零下 20 摄氏度下储存纯化 PCR 产品长达 12 个月。可选地，COX1 或 ND 反向底转也可用于双向测序。
对于桑格测序，请使用相关的 COX1 或 ND 前底。检索测序结果后，使用NCBI核苷酸 BLAST 在线工具将序列与太平洋牡蛎参考菌株的基因组序列进行比较。使用MgUGD和MgUXS基因的分别前向和反向底因，像以前一样，通过PCR进行放大和纯化。
使用消化缓冲液孵育纯化PCR产品后，在1.5毫升离心管中溶解500毫微克的pET-30a，并加入去电化水以补充16微升，来准备预消化的pET-30a载体。然后，在管中加入两个10倍浓缩消化缓冲液和一个微升，每个20个单位限制内接性Nde1和Xho1。在37摄氏度下孵育混合物3小时。
之后，加入一单位碱性磷酸酶的微升，在37摄氏度下再孵育一小时。然后，将管子放在预热金属块加热器中，在 75 摄氏度下放置 10 分钟，以灭活碱性磷酸酶。培养带有MgUGD和MgUXS基因的大肠杆菌BL21细胞后，在两升摇瓶中将培养成400毫升LB介质，并在37摄氏度的温度下以200转/小时将其放在摇摇器上。
三小时后，检查波长为 600 纳米的光度计上的光学密度，并确保其吸收量达到约 0.5。然后将摇床温度降至 20 摄氏度。加入400微升的一摩尔IPTG，诱导重组蛋白的表达3小时。
收获细胞后，在4摄氏度下通过声波干扰细胞20分钟。在14000倍的g和4摄氏度下离心20分钟，并在新管中收集上一代，用于活动测试。活动测定后，在MgUXS和MgUGD混合物中加入20微升甲醇和40微升氯仿，从而抑制反应。
涡流样品混合物，并在14000倍g下离心6分钟和4摄氏度。收集新管中每个管的上水层，用于 MALDI-TOF 质谱法。在本次实验中，将高度发散标本的COX1和ND基因序列的序列排列与参考太平洋牡蛎菌株进行比较。
红色箭头显示参考序列与获得的cDNA样本序列之间的核苷酸差异。密切相关的牡蛎标本的COX1和ND基因序列显示，与参考太平洋牡蛎菌株的背离较低。MALDI-TOF质谱表明cDNA库成功应用，克隆了与工业相关的基因MgUGD和MgUXS。
凝胶图像还识别了由连续表达和纯化的MgUGD和MgUXS的酶作用产生的UDP-葡萄糖酸和UDP-xylose。此方法不需要参考序列与获得的标记序列的完美匹配，应给予研究人员处理未引用牡蛎的信心。原则上，此方法可应用于任何未引用的生物样本，这些样本中来自密切相关的参考物种的序列是公开提供的。
这种方法允许非专家研究人员轻松获取具有潜在生物学重要性的遗传材料，并为更多的科学家使用易于获取但未完全鉴定的生物样本铺平了道路。
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概述
本研究提出了一种利用来自当地食品市场的太平洋牡蛎RNA样本克隆具有生物技术相关性的基因的方法。通过将遗传物质与公开的基因组数据进行比较，可以在不使用传统测序方法的情况下生成一个几乎测序的cDNA文库。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 基因组学
- 分子生物学
背景
- 太平洋牡蛎是生物技术应用的宝贵资源。
- 传统的测序方法可能费用高昂且耗时。
- 使用当地食品市场的标本可以提供一种新颖的基因克隆方法。
- 可以使用参考序列来比较以识别密切相关的标本。
研究目的
- 展示一种使用未参考的牡蛎标本RNA进行基因克隆的方法。
- 评估绕过传统测序的可行性。
- 利用公开的序列信息来选择相关基因。
使用的方法
- 从太平洋牡蛎标本中提取RNA。
- 将细胞色素c氧化酶亚基I和NADH脱氢酶序列与公共数据库进行比较。
- 选择最密切相关的标本进行cDNA制备。
- 从制备的cDNA克隆具有生物技术相关性的基因。
主要结果
- 通过基因比较成功识别出密切相关的牡蛎标本。
- 展示从当地市场样本生成cDNA文库的过程。
- 无需传统测序就能克隆相关基因的潜力。
- 研究过程中吸引了研究生的参与。
结论
- 该方法提供了一种成本效益高的基因克隆替代方案。
- 利用当地标本可以增强生物技术研究。
- 该技术的进一步应用可以扩大海洋生物的基因研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to access genetic material from unreferenced biological samples using publicly available reference data, reducing reliance on costly and time-consuming conventional sequencing. By leveraging market-sourced specimens and targeted gene comparison, it supports early-stage target validation and lead identification workflows with improved accessibility and reduced consumptive use of reference materials. The approach enhances predictive confidence in gene cloning efforts by aligning experimental samples with known genomic references through mitochondrial marker analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using genetic material from unreferenced specimens through comparative mitochondrial gene analysis.
- Operational Value: Reduces dependency on consumptive reference samples by utilizing locally sourced biological material for initial target exploration.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming specimen relatedness via COX1 and ND sequence alignment before gene cloning.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Generates cDNA libraries suitable for downstream cloning and expression assays without requiring full genome sequencing.
- Scientific Value: Provides a standardized workflow for preparing recombinant proteins such as UGD and UXS from market-derived samples.
- Operational Value: Enables long-term storage of cDNA libraries (up to 12 months at -20°C) for reusable screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates functional validation of cloned genes through enzymatic activity assays and MALDI-TOF detection of UDP-glucuronic acid and UDP-xylose products.
- Translational Biomarker: Links genetic accessibility to biosynthetic pathway validation, supporting mechanistic de-risking in carbohydrate engineering targets.
- Preclinical Model: Facilitates continuity from gene discovery to protein expression and activity testing in recombinant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting progression from sample acquisition to gene cloning and functional validation, particularly when reference genome data is available for closely related species alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling selection of genetically proximate specimens using COX1 and ND markers before cDNA library generation.
- Screening: Produces assay-ready cDNA libraries for cloning biotechnologically relevant genes without prior sequencing of the target organism.
- Analytics: Enables quantitative verification of gene expression through PCR amplification, gel electrophoresis, and enzymatic activity assays.
- Translational Research: Connects genetic access to pathway-level validation by demonstrating biosynthesis of UDP-xylose from UDP-glucose via cloned UGD and UXS enzymes.
- Enterprise Reuse: Establishes a replicable protocol for accessing genetic diversity in non-model organisms using public sequence databases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by aligning experimental samples with reference genomes through mitochondrial gene comparison.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized RNA extraction, cDNA synthesis, and PCR-based verification steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on expensive sequencing and consumptive use of reference biological materials.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets based on confirmed specimen relatedness and cloning success.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA isolation, cDNA synthesis, and PCR amplification from complex tissue samples.
- Depends on access to PCR thermocyclers, agarose gel electrophoresis, and restriction enzyme digestion systems.
- Necessitates cross-team standardization of mitochondrial marker selection (COX1, ND) for specimen comparison across projects.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other non-model organisms with available reference genomes.
- Practical limitation: Success depends on the availability and quality of public reference sequences for accurate specimen matching.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:10
RNA Isolation by Guanidinium Thiocyanate-phenol Extraction and cDNA Library Generation by Reverse Transcription
4:35
Mitochondrial Gene Amplification, Purification, Sequencing and Comparison
7:27
Applying the cDNA Library for Cloning the Genes MgUGD and MgUXS
8:42
Expression and Activity Tests of MgUGD and MgUXS
10:32
Results: Sequencing and Mass Spectrometry Results
11:33
Conclusion
