VirWaTest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

肠道病毒主要存在于各种水体储库中，包括地下水、静水、溪流、河流和再生水。这些病毒具有健康风险，可导致人类感染。肠道病毒通常引起胃肠炎，主要通过粪-口途径传播。

其他水源性疾病由甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒引起急性肝炎，在孕妇中尤以戊型肝炎相关的病死率显著。目前为 humanitarian 情境下水质监测提出的真实方案，旨在以大肠杆菌等细菌作为粪便污染的指示物。但已有研究证实，这类细菌与其他更耐受多种消毒处理的微生物（如病毒）之间并无相关性。

迄今为止，在人道主义危机环境中对病毒的检测主要通过调整现有检测方案以适应当地条件，并将样本运送至参考实验室进行病毒的分子检测。目前亟需能够在现场快速检测病毒病原体及病毒指示物的方法，以降低公共卫生风险，预防疫情暴发，并提高人道主义干预的效率。我们提出一种针对10升水样的病毒检测方法，该方法分为三个步骤：病毒浓缩、核酸提取和病毒检测。

上述所有步骤均改编自我们实验室目前使用的方法，可利用便携式试剂和设备在采样现场完成，无需依赖电源和冷冻设备。此外，本方法中添加了一种保存液，以确保核酸在需要时可稳定保存并运送至参考实验室。我们提出的方法称为 VirWaTest，由 GenIUL 与 Intermon Oxfam 合作开发。

开始实验前，应根据待检测样品的数量准备试剂和材料。建议每份水样采集两个重复样本，以获得具有代表性的结果。若有足量材料，可同时检测多个样品。

在将试剂和材料转移或运送到需要该方法的地点之前，应提前准备并包装好。应包装的材料和小型设备清单见表一。按照相应的ISO方法制备作为过程对照的噬菌体MS2储备液，添加至每个水样中。

然后将含有10至10个预制平台单位的悬浮液各10微升分装到10 mL离心管中，并让水分干燥。每个水样需要一支离心管。此外，为每个采集的样品另准备一支含有10 mL无菌蒸馏水的离心管。

对于预絮凝脱脂牛奶溶液，准备一个含有脱脂牛奶的试管、一个装有海盐的自封塑料袋，以及一个装有蒸馏水的塑料瓶。为调节 pH 值，准备一个含有柠檬酸的试管、一个含有氢氧化钠的试管，以及两个分别装有 25 mL 和 50 mL 蒸馏水的塑料容器。对于每份待测水样，通过将海盐和柠檬酸加入自封塑料袋中制备一份调理试剂袋，并通过将裂解缓冲液和核酸保护剂加入 5 mL 试管中制备一份保存溶液。

最后，准备四个中和小袋，向四个带拉链的塑料袋中加入强力洗涤剂。对于每个待提取的水样，准备一个含有磁性颗粒和乙醇的5 mL离心管，以及三个分别装有500、600和200微升洗涤缓冲液一、缓冲液二和缓冲液三的2 mL离心管，另准备一个含有洗脱缓冲液的离心管。若使用Newell热循环仪，每次PCR检测可同时分析两个不同的核酸提取样本。

对于所有PCR检测，准备分子生物学用水。根据方案中描述的体积和浓度，配制包含两种引物和一种针对每种目标病毒特异的探针的混合液。对于每种病毒，将指定体积加入八联管的第1至第8管中。

将条带剪断，分成两条，分别为1至5号管和6至8号管。针对每种病毒，将含有10⁵、10⁷和10⁹拷贝数的已知DNA悬液分别预先加入6、7和8号管中，并进行风干处理。

该浓缩方案基于有机絮凝原理，即在低pH值和高电导率条件下，脱脂牛奶蛋白会形成絮状沉淀，病毒可吸附于其中。待絮状物沉降后，可轻松收集。使用带盖的平底桶采集10升水样。

若从管道中采集水样，应在采集前让水流淌数秒钟。使用透明的桶有助于观察沉淀物。选择一个远离直射阳光的新鲜平坦区域，将连接电池的磁力搅拌器置于桶的支撑架下方，并将装有水样的桶放置在每个支撑架上。

重新考虑柠檬酸和氢氧化钠，并摇动直至完全溶解。将500 mL蒸馏水倒入立式袋中，并将袋子放在磁力搅拌器上。加入一包海水盐和一根脱脂牛奶管中的全部内容物，在中等速度下搅拌五分钟。

使用柠檬酸和氢氧化钠调节絮凝脱脂乳的 pH 值，使其介于 3.4 至 3.6 之间。关闭磁力搅拌器，确保絮状物可见。使用手电筒可能有助于观察絮状物。

将搅拌子放入水中。将磁力搅拌器调至最高速并开启。向过程控制管中加入 10 mL 蒸馏水。

轻轻颠倒混匀数次，将溶液倒入水中。将一个样品预处理袋中的内容物倒入水中，搅拌五分钟。确保水样的 pH 值在 3.4 至 3.6 之间。

如有需要，调节pH值。加入100 mL预絮凝的脱脂牛奶溶液，用盖子密封桶，以最低转速持续搅拌至少8小时。8小时后，关闭磁力搅拌器，静置使絮状物沉降至少额外5小时。

使用基于移液控制器、塑料管和几支移液管的系统，弃去上清液，注意不要扰动桶底的絮状沉淀。当液面即将到达搅拌子位置时，捏紧塑料管以停止液体流动，并将移液管从桶中移开。轻轻振荡桶以重新悬浮絮状物，然后将其倒入直立的塑料袋中。

让絮状物额外静置一小时。用移液管小心吸取上清液，避免扰动絮状物。用移液管吸取絮状物，并将其转移至锥形管中。

记录样本浓缩物的最终体积，并将1 mL转移至含有保存液的离心管中。该悬浮液可用于现场进行核酸提取，或运送至参考实验室进行进一步分析。收集絮状物时丢弃的水必须在处置前进行处理。

将中和剂小袋中的内容物加入装有废弃水的桶中。混合均匀后静置三十分钟，然后将处理后的水作为普通废弃物丢弃。

可以使用磁力移液器将磁性颗粒从一个离心管转移至另一个离心管。在进行提取操作前，请先熟悉磁力移液器的使用方法。将含有提取所需试剂的离心管按顺序放置在试管架中。

即从左至右：结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。使用一次性塑料移液管将1 mL样品浓缩液转移至含有结合缓冲液的离心管中。上下颠倒混匀10次，以充分混匀溶液。

将溶液在室温下孵育10分钟，同时使用单通道旋转混合器或手动方式持续混匀。使用磁力移液器和洁净的吸头收集磁性颗粒，该吸头可重复用于三种洗涤缓冲液；随后将磁性颗粒释放至含有第一种洗涤缓冲液的离心管中。用吸头轻轻振荡溶液30秒以洗涤颗粒，然后收集磁性颗粒。

用洗涤缓冲液二和三重复此洗涤步骤。在洗涤缓冲液三中收集磁性颗粒，并将其释放至含有洗脱缓冲液的离心管中。然后弃去吸头。

将溶液在室温下孵育5分钟，同时使用solo轨道振荡器持续混匀。更换磁力移液枪的吸头，收集洗脱缓冲液中的全部磁性颗粒。弃去附着有颗粒的吸头。

核酸保留在洗脱缓冲液中，应将其储存以用于进一步分析或运输。使用预先制备的五管和三管条带检测人腺病毒。根据方案，向第一至第五管中分别加入水、PCR 混合液和核酸提取物。

随后，向第6至第8号管中加入水和PCR混合液。将两个管条放入热循环仪中，并选择相应的运行程序。运行结束后，收集结果并分析获得的数据。

只有在病毒检测结果为阴性后，才应进行MS2检测。使用为MS2检测准备的管条，并为PCR选择适当的热循环程序。VirWaTest磁性核酸提取法与QIAgen病毒RNA提取法进行了比较，通过检测人工添加人腺病毒和MS2的水样本来模拟实际检测情况。

还原试验的 p 值显示，与使用 QiAgen 方法相比，采用 VirWaTest 作为两种测试病毒的提取方法时，病毒回收率显著更高。该病毒浓缩方法已在实地进行了测试，与乐施会（Oxfam）位于中非共和国班吉和厄瓜多尔佩德纳莱斯的卫生团队合作，由其采集水样，应用所开发的浓缩方法进行浓缩后，送至巴塞罗那的实验室进行核酸提取和病毒定量。在厄瓜多尔，所有检测的样本中均检出人腺病毒；而在班吉采集并浓缩的五个样本中，有一个样本人腺病毒检测呈阳性。

该方法在中非共和国班吉由乐施会国际组织的水卫团队以及在厄瓜多尔佩德纳莱斯的另一支团队进行评估后，已被证明具有实用价值。VirWaTest 可作为早期预警系统的一部分，也可由参与水卫生工作的组织用于疫情调查。该设备有助于对水中的病毒病原体进行分析，并改善水质安全管理，旨在减少人道主义危机情境下病毒性疾病的发病事件。