病毒测试,水样中检测病毒的一种使用点方法

肠病毒大多存在于不同的水生水库，包括地下水、静止水、溪流、河流和 r 水。它们与健康风险有关，并对人类感染负责。肠病毒通常引起肠胃炎，并且大多通过粪便-口腔途径传播。

其他水传播疾病由甲型肝炎病毒和E型肝炎病毒引起急性肝炎，其相关死亡率显著，特别是孕妇的E型肝炎。为人道主义情况提议的水质监测实际协议旨在将E.Coli等细菌作为粪便污染的指标。但众所周知，与其他微生物（如对许多激活过程更具抵抗力的病毒）没有相关性。

到目前为止，在人道主义危机环境中已经进行了病毒检测，使现有协议适应这些情况，并运送样品到参考实验室进行病毒分子检测。需要从观点中检测病毒病原体和病毒指标的方法，以减少公共卫生风险，防止疫情爆发，提高人道主义干预的效率。提出了一种10升水样病毒检测方法，分为病毒浓度、核酸提取和病毒检测三个步骤。

所有这些步骤都根据我们实验室目前使用的方法进行了调整，并且可以通过使用便携式试剂和设备，生产出电源和冰柜的受抚养者，在观点上执行。此外，在方法中添加了防腐剂溶液，以保证核酸的稳定性，如果需要，可运往参考实验室。我们提出的方法叫做VirWaTest，是经过GenIUL和乐施会的合作开发的。

在开始之前，应考虑要测试的样品数量，以制备试剂和材料。建议收集每个水样两个副本，以获得有代表性的结果。如果有适当数量的材料可用，可以同时测试多个样品。

在移动或运到需要的方法的地方之前，应准备和包装试剂和材料。表一描述了应包装的材料和小型设备清单。准备一个噬菌体MS2库存，按照相应的ISO方法作为过程控制添加到每个水样中。

然后分配10微升的悬浮液，其中含有10至10个平台装置，预制作成10毫升管，让水干燥。每个水样需要一管。此外，每采集的样品制备一个含有10mL无菌蒸馏水的管子。

对于预絮状脱脂牛奶溶液，准备一个管子，里面装着脱脂牛奶，一个拉链塑料袋，里面装着海盐，还有一个装有蒸馏水的塑料瓶。对于 pH 调整，准备一个含有柠檬酸的管子、一个含有氢氧化钠的管子以及两个含有 25 和 50 mL 蒸馏水的塑料容器。对于要测试的每个水样，通过将海盐和柠檬酸加入拉链塑料袋来准备一个调理袋，通过将解解缓冲液和核酸防腐剂添加到 5 mL 管中来制备保鲜溶液。

最后，准备四个中和小袋，在四个拉链塑料袋中加入强力洗涤剂。对于要提取的每个水样，准备一个含有磁性颗粒和乙醇的五毫升管，以及三个含有500、600和200微升洗涤缓冲液的2mL管，以及一个含有洗涤缓冲液的管。如果使用纽厄尔热循环器，则每个 PCR 测定中可同时分析两种不同的核酸提取。

对于所有PCR测定，准备分子生物学水。根据协议中描述的体积和浓度，准备包含两个底向和一个特定目标病毒的混合物。对于每种病毒，将指示的卷添加到管内一至八个管托盘。

切条，分成两条。管子一到五，管子六到八。对于每种病毒，含有10至5、10至7和10至9的风干DNA悬浮液，以及预制作成管6、7和8的已知拷贝。

这种浓度协议基于有机絮凝原理，低pH和高导电性条件驱动脱脂牛奶蛋白组织成病毒吸收的絮凝。一旦絮凝，可以很容易地收集。在带盖子的平底桶中收集 10 升水样。

如果从管道中收集，让水在收集水之前运行几秒钟。使用透明铲斗来可视化颗粒非常重要。在远离阳光直射的新鲜地方寻找一个平坦的空间，将磁力搅拌器连接到桶支撑下的电池，并在每个支撑上放置包含水样的水桶。

重新考虑柠檬酸和氢氧化钠，并摇动，直到它们完全溶解。将 500 mL 的蒸馏水倒入立式袋中，然后将袋子放在磁性搅拌器上。加入一个海盐袋的内容和一个脱脂奶管的内容，以中等速度搅拌五分钟。

使用柠檬酸和氢氧化钠将絮状脱脂牛奶的 pH 值调整为 3.4 和 3.6 之间的 pH 值。关闭磁力搅拌器，确保浮子可见。手电筒可能有助于可视化絮凝。

将搅拌磁铁扔进水中。将磁力搅拌器设置为最大速度并打开。将 10 mL 蒸馏水加入过程控制管。

倒置几次，把溶液倒入水中。将一个样品调理袋的内容倒入水中，搅拌五分钟。确保水样（应介于 3.4 和 3.6 之间）的 pH 值。

如果需要，调整 pH。加入 100 mL 预絮状脱脂牛奶溶液，用盖子密封水桶，以最低速度将水搅拌 8 小时。八小时后，关闭磁力搅拌器，让絮凝器至少多等五个小时。

使用基于移液器控制器、塑料管和几个移液器的系统，丢弃上清液，注意不要打扰铲斗底部的絮状物。当水位即将到达搅拌磁铁时，挤压塑料管以停止水流，然后将移液器从铲斗中移开。摇动水桶重新浇注絮片，然后倒入立式塑料袋中。

允许絮凝，多等一小时。使用移液器小心吸水，避免干扰絮状物。使用移液器吸气絮，并将它们转移到锥形管中。

记下样品浓缩物的最终体积，将 1 mL 转移到含有防腐剂溶液的管中。悬浮液可用于在田间进行核酸提取，或运到参考实验室作进一步分析。收集絮凝物时丢弃的水必须在处理前处理。

将中和剂袋的内容添加到包含废弃水的桶中。混合水，让水静止三十分钟。然后将处理过的水作为一般废物处理。

磁性颗粒可以使用磁性移液器从一个管转移到另一个管。在执行提取之前，先习惯磁移液器的操作。将含有提取所需试剂的管子排列在机架中。

也就是说，从左到右:绑定缓冲区、洗涤缓冲区和洗脱缓冲区。使用一次性塑料移液器将 1 mL 样品浓缩物转移到含有结合缓冲液的管中。反转管十次以优化解决方案。

在室温下孵育溶液十分钟，同时使用单独轨道或手动连续混合。使用磁性移液器和可重复使用的清洁尖端收集磁性颗粒，并释放磁性颗粒到含有洗涤缓冲液的管中。用尖端轻轻摇动溶液三十秒钟，然后收集它们。

重复此清洗过程以清洗缓冲液 2 和 3。收集洗涤缓冲液三中的磁性颗粒，并释放到含有洗涤缓冲液的管中。然后丢弃尖端。

在室温下孵育溶液五分钟，同时使用独奏轨道连续混合。将磁性移液器上的尖端更换为任何一个，然后从洗脱缓冲液中收集所有磁性颗粒。将附加颗粒的尖端丢弃。

核酸留在洗脱缓冲液中，应储存以作进一步分析或装运。使用五管和三管带准备检测人类腺病毒。根据协议，将水、PCR混合物和核酸外加加入到管中。

之后，将水和PCR混合到管六至八。将两条带放入热循环器中并选择适当的运行。运行完成后，收集结果并分析获得的数据。

只有当病毒测试导致阴性时，才应进行 MS2 检测。使用为 MS2 检测准备的管条，并选择适合 PCR 的热轮廓。VirWaTest磁核酸提取与QIAgen病毒RNA进行比较，通过测试与人类腺病毒和MS2尖峰的水样来模拟它。

减少测试 p 值显示，使用 VirWaTest 比 QiAgen 作为两种测试病毒的提取方法，病毒恢复率显著提高。在位于中非共和国班吉和厄瓜多尔佩德纳莱斯的乐施会洗涤小组的合作下，在实地测试了病毒浓度的开发方法，这些小组收集水样，采用开发浓度方法进行浓缩，并把它们送到巴塞罗那的实验室进行核酸提取和病毒定量。在厄瓜多尔，在所有检测的样本中检测到人类腺病毒，而在班吉采集和浓缩的五个样本中，有一个对人腺病毒检测呈阳性。

在中非共和国班吉的乐施会际洗涤小组和厄瓜多尔佩德纳莱斯的另一个小组对该方法进行评估时，已证明该方法是有用的。VirWaTest 可能是预警系统的一部分，也可能用于参与水卫生的组织对疫情进行调查。这种设备有助于分析水中的病毒病原体，改善水安全管理，以减少人道主义危机情况下的病毒性疾病事件。