Name: 病毒测试,水样中检测病毒的一种使用点方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 了解VirWaTest方法用于水样中肠道病毒检测，该方法简便便携，适用于现场即时检测。通过有机絮凝浓缩病毒并结合磁珠核酸提取，可在人道主义危机环境中提升水质安全与公共卫生保障。

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VirWaTest 是由 ELHRA（人道主义学习促进组织）的 HIF（人道主义创新基金）项目资助的一项研究计划 &amp;#38; 人道主义援助研究）。作者感谢参与本研究的供水、环境卫生和个人卫生（WASH）团队的大力支持。厄瓜多尔样本分析工作由乐施会厄瓜多尔分会和拉丁美洲大学研究部（AMB.BRT.17.01）资助。S. Bofill-Mas 是巴塞罗那大学的塞拉-亨特学者。

1. 准备与包装
注意：待包装的材料/设备列于表1中。在处理过程控制试剂、浓缩试剂、核酸提取试剂&#160;以及&#160;检测试剂时，请佩戴手套。在处理核酸提取所需试剂时，应佩戴护目镜。
<ol>
	<li>过程控制
	<ol>
		<li>按照 ISO 10705-1:1995 程序14，在实验室中制备含有 1 × 1010 PFU/mL 的 MS2 噬菌体储备培养物（美国典型培养物保藏中心 [ATCC] 15597-B1）。</li>
		<li>然后，将悬浮液每管分装 10 µL（每管含 1 × 108 PFU）至 10 mL 管中，并在 37 °C 下使水分蒸发。每个水样使用一管。</li>
		<li>此外，为每个采集的样品另准备一管含 10 mL 无菌蒸馏水的试管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浓缩试剂
	<ol>
		<li>对于预絮凝脱脂乳溶液（PSM），使用以下用量以浓缩五个 10 L 的水样。
		<ol>
			<li>准备一个塑料管，内含 5 g 脱脂乳。</li>
			<li>准备一个拉链塑料袋，内含 16.66 g 海水盐。</li>
			<li>准备一个塑料瓶，内含 500 mL 蒸馏水。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备用于调节 pH 值的试剂。使用以下用量调节 PSM 及五个 10 L 水样的 pH 值。
		<ol>
			<li>将 5 g 一水合柠檬酸加入一个 10 mL 塑料管中。 
			警告：柠檬酸接触眼睛会引起严重刺激。若发生接触，应小心用清水冲洗数分钟。若刺激持续，请就医咨询。</li>
			<li>将 2 g 氢氧化钠放入一个 10 mL 塑料管中。 
			警告：氢氧化钠可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。若误吞，应漱口，切勿催吐。若接触眼睛，应小心用清水冲洗数分钟，然后就医咨询。</li>
			<li>将 25 mL 无菌蒸馏水放入一个塑料容器中。</li>
			<li>将 50 mL 无菌蒸馏水放入一个塑料容器中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备用于絮凝的样品调理袋、用于保存核酸的防腐溶液以及用于中和废弃水和材料的中和袋。每个待检测的 10 L 水样使用以下用量。
		<ol>
			<li>将 15 g 海水盐和 8 g 一水合柠檬酸放入一个拉链塑料袋中，作为调理袋。</li>
			<li>向一个 5 mL 管中加入 2 mL 裂解缓冲液（材料表）和 0.3 mL 核酸保存剂（材料表）。 
			警告：裂解缓冲液含有硫氰酸胍和 Triton X-100。与酸接触会释放有毒气体，若吞咽、吸入或皮肤接触均有害。若误吞，应漱口，切勿催吐。若皮肤接触，应用大量水冲洗，然后就医咨询。核酸保存剂会引起皮肤和眼睛刺激，若吞咽有害。若接触皮肤或眼睛，应以大量水冲洗数分钟。任何情况下，尤其是吞咽后感到不适时，应就医咨询。</li>
			<li>将 40 g 洗涤剂粉末分装至四个拉链塑料袋中。 
			警告：粉末洗涤剂会引起眼睛刺激。若接触眼睛，应以大量水冲洗数分钟。若刺激持续或误吞，请就医咨询。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核酸提取试剂
	<ol>
		<li>将 50 µL 磁性颗粒（材料表）和 1 mL 96% 乙醇加入一个 5 mL 管中，构成结合缓冲液。 
		警告：磁性颗粒缓冲液含有叠氮化钠，与酸或重金属离子接触时会形成有毒气体，若摄入或皮肤接触具有毒性。若摄入或皮肤接触，应以大量水冲洗口腔或皮肤，并立即就医咨询。乙醇为高度易燃液体和蒸气，会引起严重眼刺激。应远离热源、高温表面、火花及其他点火源。若皮肤或眼睛接触，应以大量水冲洗。若大量摄入和/或吸入，应移至室外新鲜空气处。任何情况下均应就医咨询。</li>
		<li>分别向三个 2 mL 管中加入洗涤缓冲液 1、2 和 3 各 500 µL、600 µL 和 200 µL（材料表）。 
		警告：洗涤缓冲液含有硫氰酸胍和盐酸胍，若吸入或吞咽有害，并对皮肤和眼睛有刺激性。与酸接触会释放剧毒气体。若接触皮肤或眼睛，应以大量水冲洗。若误吞，应以大量水漱口，切勿催吐。务必就医咨询。</li>
		<li>向一个 0.5 mL 管中加入 120 µL 洗脱缓冲液（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HAdV 和 MS2 检测试剂 
	注意：若使用 8 孔热循环仪，每个 PCR 检测可同时分析两个不同的核酸提取反应。所有 PCR 检测均需将分子生物学用水分装至 1.5 mL 管中。
	<ol>
		<li>HAdV 检测
		<ol>
			<li>配制混合液，包含 10 µL 22.5 µM AdF 正向引物、10 µL 22.5 µM AdR 反向引物和 5 µL 11.25 µM AdP 探针（表 2）。</li>
			<li>将 2.5 µL 混合液加入管条的 1 至 8 号管中，在室温下干燥，盖紧管盖，并避光保存。</li>
			<li>将管条剪开，分为两段：1-5 号管和 6-8 号管。</li>
			<li>制备含有 HAdV 扩增区域核苷酸序列的 DNA 悬液系列稀释液。将含 1 × 105、1 × 107 和 1 × 109 GC/mL 的悬液各 1 µL 风干至 6-8 号管中。 
			注意：含引物、探针及风干悬液的管子应避光保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>MS2 检测
		<ol>
			<li>配制混合液，包含 10 µL 25 µM pecson-2F 正向引物、10 µL 25 µM pecson-2R 反向引物和 2.5 µL 25 µM PecP-2 探针（表 2）。</li>
			<li>将 2.25 µL 混合液加入管条的 1 至 8 号管中，在室温下干燥，盖紧管盖，并避光保存。</li>
			<li>将管条剪开，分为两段：1-5 号管和 6-8 号管。</li>
			<li>操作同步骤 1.4.1.4，但使用专为 MS2 设计的标准悬液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 病毒浓缩
注意：在样品采集、试剂配制、絮凝、絮体收集和废物处理过程中，必须始终佩戴手套。在试剂配制过程中，需佩戴护目镜。
<ol>
	<li>样品采集
	<ol>
		<li>使用带盖的平底桶采集10 L水样。每个样品至少采集两个重复样本。 
		注意：必须使用透明桶以便观察沉淀物。如果水样中含有悬浮物质（例如沙子、藻类），应静置使其沉降，然后将上清液转移至新桶中。</li>
		<li>记录每个水样的采集体积、采集地点和采集日期。</li>
		<li>将连接电池的磁力搅拌器置于桶架下方，并将盛有水样的桶放置在支架上。 
		注意：应选择平坦、阴凉的位置，避免盛有水样的桶直接暴露在阳光下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂配制
	<ol>
		<li>pH调节试剂
		<ol>
			<li>将柠檬酸粉末和氢氧化钠颗粒分别倒入装有25 mL和50 mL蒸馏水的容器中。</li>
			<li>手动轻轻摇晃，直至柠檬酸和氢氧化钠完全溶解。 
			注意：切勿将水倒入氢氧化钠颗粒中，而应将氢氧化钠颗粒缓慢加入水中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>预絮凝脱脂乳液（PSM）
		<ol>
			<li>将直立袋放置在磁力搅拌器上，加入500 mL蒸馏水。将搅拌磁子放入袋中，并开启磁力搅拌器。</li>
			<li>将一份海水盐小袋和一根脱脂乳管中的内容物倒入直立袋中，在中等速度下搅拌5分钟，使其充分溶解。</li>
			<li>使用巴斯德移液管向PSM溶液中加入3 mL柠檬酸，确保pH值在3.4至3.6之间。使用pH指示试纸测定PSM溶液的pH值。当pH接近3.5时，应少量添加柠檬酸或氢氧化钠进行微调。</li>
			<li>关闭磁力搅拌器，确认絮状物可见。可使用手电筒辅助观察絮状物。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>絮凝
	<ol>
		<li>将搅拌磁子放入水中，将磁力搅拌器调至最高速并开启，确保搅拌磁子开始旋转。</li>
		<li>向一个过程对照管中加入10 mL蒸馏水。反复倒置数次以重悬病毒储备液，然后将溶液倒入水中。</li>
		<li>将一个样品预处理小袋中的内容物倒入水中，并搅拌5分钟。</li>
		<li>使用pH指示试纸测定水样的pH值。向水样中滴加少量柠檬酸或氢氧化钠，确保pH值在3.4至3.6之间。当pH接近3.5时，应少量添加柠檬酸或氢氧化钠进行调节。</li>
		<li>使用100 mL量筒加入100 mL的PSM溶液。</li>
		<li>用盖子密封桶，将磁力搅拌器调至最低速，持续搅拌8小时。</li>
		<li>关闭磁力搅拌器，静置至少5小时，使絮状物充分沉降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>絮&#160;状物收集
	<ol>
		<li>构建一个由移液控制器、两支移液管和一根塑料管组成的虹吸系统，用于吸取上清液，避免扰动絮状物。
		<ol>
			<li>将一支10 mL封口移液管连接到移液控制器上，再将移液管尖端连接至塑料管。</li>
			<li>使用镊子移除一支10 mL开口移液管的滤芯，并将该移液管连接至塑料管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将一个空桶放置在地面上。</li>
		<li>将开口移液管的尖端浸入水中，保持靠近水面以避免扰动絮状物。吸取上清液，直至液面到达封口移液管位置。</li>
		<li>捏住连接封口移液管一端的塑料管，并将其从移液管上拆下。</li>
		<li>将塑料管放入空桶中，松开管子使水流入空桶。</li>
		<li>当水位接近搅拌磁子时，捏住塑料管以停止水流，并将移液管移开。</li>
		<li>轻轻摇晃桶使絮状物重新悬浮，然后将其倒入一个500 mL直立塑料袋中。再静置1小时使絮状物沉降。</li>
		<li>使用50 mL移液管和手动移液控制器小心吸取上清液，避免扰动絮状物。</li>
		<li>使用100 mL移液管吸取絮状物，并转移至一个50 mL带刻度的离心管中。记录浓缩样品的最终体积，并使用巴斯德移液管取1 mL转移至含有保存液的5 mL管中。 
		注意：离心管必须带有刻度，以便尽可能准确地测量并记录浓缩样品的最终体积。</li>
		<li>在野外进行核酸提取。或者，将含有病毒的保存液在20–30 °C条件下保存最多15天，或运送至参考实验室进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>废液处理与材料重复使用
	<ol>
		<li>向盛有废弃水样的桶中加入一份中和剂小袋的内容物。混合均匀后静置30分钟。</li>
		<li>将处理后的水作为一般废弃物处置。</li>
		<li>将移液管和塑料管放入桶中，加水至满，并加入一份中和剂小袋的内容物。</li>
		<li>至少清洗30分钟以达到灭菌效果，然后用大量清水冲洗，彻底去除残留的中和剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 核酸提取
注意：进行核酸提取操作时，请佩戴手套并始终戴上防护眼镜。
<ol>
	<li>磁性移液器操作
	<ol>
		<li>在进行提取之前，先熟悉磁性移液器的操作方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核酸提取
	<ol>
		<li>将提取所需试剂的试管按从左到右的顺序排列在试管架中：结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。根据待分析样本或重复数设置相应数量的试管。</li>
		<li>使用一次性巴斯德移液管将1 mL样本浓缩液转移至含有结合缓冲液的试管中。轻轻颠倒试管8至10次，以混匀溶液。</li>
		<li>在室温下孵育溶液10分钟，同时持续混匀，可使用太阳能驱动的旋转混合器或手动操作。</li>
		<li>使用磁性移液器和洁净的吸头收集磁性颗粒，该吸头可在三种洗涤缓冲液中重复使用。</li>
		<li>将磁性颗粒释放到含有500 µL洗涤缓冲液1的试管中。用吸头轻轻振荡溶液30秒进行洗涤，然后收集磁性颗粒。</li>
		<li>将磁性颗粒转移至含有600 µL洗涤缓冲液2的试管中。用吸头轻轻振荡溶液30秒进行洗涤，然后收集磁性颗粒。</li>
		<li>将磁性颗粒转移至含有200 µL洗涤缓冲液3的试管中。用吸头轻轻振荡溶液30秒进行洗涤，然后收集磁性颗粒。</li>
		<li>将磁性颗粒释放到含有洗脱缓冲液的试管中，并弃去吸头。</li>
		<li>在室温下孵育溶液5分钟，同时使用太阳能驱动的旋转混合器持续混匀。 
		注意：在洗脱缓冲液中充分混匀磁性颗粒是关键步骤。若无旋转混合器，孵育期间需持续手动混匀。</li>
		<li>将磁性移液器上的吸头更换为新的吸头，从洗脱缓冲液中收集磁性颗粒。确保完全去除洗脱缓冲液中的磁性颗粒，因其可能干扰分子检测方法。</li>
		<li>弃去附着有磁性颗粒的吸头。随后可进行PCR分析，或将洗脱缓冲液运送至参考实验室，或将其在4 ˚C下保存以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用电池供电的八通道实时荧光定量PCR仪进行病毒检测
注意：进行核酸检测操作时请佩戴手套并始终佩戴防护眼镜。每次开展新的 PCR 实验时，应更换新手套，以避免交叉污染。
<ol>
	<li>HAdV 定量 PCR
	<ol>
		<li>向 2、4 和 5 号管中各加入 14 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>向 1 至 5 号管中各加入 4 µL PCR 混合液。</li>
		<li>向 1 号管中加入 14 µL 样品 A 的核酸提取物，向 3 号管中加入 14 µL 样品 B 的核酸提取物。</li>
		<li>向 2 号管中加入 2 µL 样品 A 提取的核酸，向 4 号管中加入 2 µL 样品 B 提取的核酸。封闭五管条。</li>
		<li>向 6、7 和 8 号管中各加入 14 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>向 6、7 和 8 号管中各加入 4 µL 该混合液，并封闭管子。</li>
		<li>将两个管条放入热循环仪中，并选择相应的运行程序（表 3）。</li>
		<li>丢弃水对照管，若条件允许，将提取的核酸保存在冷冻环境中；若无法冷冻，则应将其置于避光的新鲜环境中，以备可能需要进行第二次检测。</li>
		<li>使用核酸清除剂彻底清洁移液器、支架、实验器材及所有相关材料，并丢弃装有废弃枪头、手套和试管的塑料袋。 
		注意：核酸去除剂为高度易燃液体和蒸气。请勿吸入喷雾，避免液体接触眼睛或皮肤。如发生接触，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗建议。</li>
		<li>收集结果并分析所得数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MS2 定量 PCR
	<ol>
		<li>向 2、4 和 5 号管中各加入 14 µL 无核酸酶水。</li>
		<li>向 1 至 5 号管中各加入 4 µL PCR 混合液和 0.5 µL 逆转录酶。</li>
		<li>向 1 号管中加入 14 µL 样品 A 的核酸提取物，向 3 号管中加入 14 µL 样品 B 的核酸提取物。</li>
		<li>向 2 号管中加入 1 µL 样品 A 提取的核酸，向 4 号管中加入 1 µL 样品 B 提取的核酸。封闭五管条。</li>
		<li>向 5、6、7 和 8 号管中各加入 15.5 µL 无核酸酶水，并封闭管子。</li>
		<li>向 6、7 和 8 号管中各加入 4 µL PCR 混合液和 0.5 µL 逆转录酶。</li>
		<li>将两个管条放入热循环仪中，并选择相应的运行程序（表 3）。</li>
		<li>按照步骤 4.1.8 至 4.1.10 所述操作进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

VirWaTest 方法使无经验的使用者能够在使用现场完成水样中病毒的浓缩及核酸提取。该方法经济、快速且操作简便。浓缩基于脱脂牛奶的有机絮凝原理：在低 pH 和高电导率条件下，脱脂牛奶中的蛋白质聚集形成絮状物，病毒可吸附于其上。当絮状物沉降后，易于收集，从而实现对 10 L 水样的浓缩，而传统的超速离心法则无法处理如此大体积的水样。
该方法已进行改进，可在采样点实施，除使用电池供电的磁力搅拌器外，无需任何其他电气设备。其他一些基于水过滤的方法也已被用于病毒浓缩，并可在使用现场操作。然而，水样中悬浮的物质常常堵塞滤膜，因此，这些系统可浓缩的样品体积较小，是一个严重的限制因素。
这是首次描述一种可在使用现场对水样中的病毒进行浓缩的方法，且不受水样浊度的影响。若有合适的材料，VirWaTest 浓缩法可同时处理多个样品。此外，已有研究表明脱脂牛奶絮凝法在细菌和寄生虫的浓缩中同样有效19。
准备合适的材料对于正确实施该操作至关重要。...

在人道主义紧急事件初期，获取清洁的水源、卫生设施和保持良好的卫生条件，对受影响人群的生存至关重要。因此，监测水质是预防水源性疫情暴发的优先事项。众所周知，受污染的水往往是多种疾病的源头，但即使具备常规实验室检测手段，也常常难以确定病毒性疫情（如戊型肝炎病毒（HEV））的来源。目前水质控制主要依赖于对指示性粪便污染菌（FIB）的定量检测1,2,3,4。然而，已有大量文献证实，FIB的缺失与水源性病毒病原体（如轮状病毒（RoV）、诺如病毒（NoV）或HEV）的存在之间并无相关性5,6。因此，仅依据FIB来评估水质，可能会低估水源性病毒病原体带来的风险。监测指示性病毒（如人腺病毒（HAdV））或特定病原体，有助于明确病毒暴露风险、识别人类感染的潜在来源7,8,9,10，并验证卫生措施的有效性11。
迄今为止，这些场景中的病毒检测依赖于专业人员和复杂的后勤支持。VirWaTest（virwatest.org）旨在开发一种简单、经济且便携的方法，用于在使用现场对水样中的病毒进行富集及后续检测。
病毒浓度基于10 L水样有机絮凝的原理，通过该方法可将病毒富集于较小体积中12,13。收集形成的絮状沉淀并加入缓冲液，使病毒裂解，同时防止核酸在室温下储存不超过2周时发生降解。
核酸提取方法基于使用磁性颗粒，核酸可吸附于这些颗粒上。利用磁力移液器吸附颗粒，可将它们从一种洗涤缓冲液转移至另一种，最终转入洗脱缓冲液。所获得的病毒核酸悬液可运送至参考实验室，通过基于PCR的分子检测方法进行检测。每次核酸提取均测试两种不同的加样量，以排除样本中可能存在的酶抑制作用。此外，在设备条件有限的情况下，也可在使用现场直接开展PCR检测。整个流程设计为无需依赖电源供应即可完成（图1）。
一种用于检测人类腺病毒（HAdV）的定量PCR检测方法已被改进，可在使用现场进行。人类腺病毒由人类排出，在废水样本中浓度较高，可作为人类粪便病毒指示物。此外，针对MS2噬菌体定量的PCR方法也已得到改进，因为MS2在VirWaTest中被用作过程对照。该方法可根据需要定制，用于检测任何目标病毒。
在完成开发后，VirWaTest 方法已在中非共和国（RCA）和厄瓜多尔的两种不同环境中被用户应用，并提供了该方案在实际情况下应用的反馈。
据我们所知，这是首个可在使用现场实现病毒浓缩与检测的方法，无需依赖任何电源、大型设备以及冷冻/冷藏条件。建议每份水样采集两个重复样本，以获得可靠的结果。

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol 探针 qPCR 混合液 Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>包含 Solis Biodyne 的 5x HOT FIREPol 探针 qPCR 混合液 Plus (qPCR 混合液)，适用于 50 次反应</td></tr><tr><td>带盖 8 孔微量离心管条</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>低轮廓，薄管壁，适用于定量和定性 PCR</td></tr><tr><td>磁力搅拌器用电池和电源适配器</td><td>GenIUL</td><td>900011674</td><td>包含 12V 汽车电源适配器</td></tr><tr><td>桶支架</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td><td>铝制支架</td></tr><tr><td>10 L 桶</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>聚丙烯材质，防篡改，透明颜色</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>聚丙烯材质，无菌，带刻度，带裙边</td></tr><tr><td>一水柠檬酸，500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>纯品，药用级，1 千克</td></tr><tr><td>透明 PET 瓶</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>透明颜色，PET 材质，不包含瓶盖</td></tr><tr><td>Difco 脱脂奶粉，500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td>脱水状态</td></tr><tr><td>DNA/RNA Shield，250 mL</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>DNA/RNA 保存液，250 mL</td></tr><tr><td>Easy9 移液控制器</td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0.3 &amp;mu;m 滤膜，适用于 0.1 至 100 mL 移液器，可高压灭菌的硅胶移液器支架</td></tr><tr><td>0.5 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030121023</td><td>聚丙烯材质，Safe-Lock</td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>聚丙烯材质，Safe-Lock</td></tr><tr><td>5 mL Eppendorf 管</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>聚丙烯材质，无菌，带刻度</td></tr><tr><td>96% V/V 乙醇，1 L</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td><td>适用于紫外、红外&amp;nbsp;和高效液相色谱</td></tr><tr><td>实验室镊子</td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>细头，弯曲末端，长度 = 120 mm</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>电池供电</td></tr><tr><td>标记笔</td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>黑色，超细笔尖，防水，快干，适用于塑料和玻璃器皿</td></tr><tr><td>微量离心管微型旋转架</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 个模块，长 × 宽 × 高 = 208 × 100 × 100 mm</td></tr><tr><td>Mini8 实时荧光定量 PCR 仪</td><td>Coyote Biosciences, 中国</td><td>Mini-8</td><td>便携式，可使用 12V 电源或外接电池，双通道，可容纳 8 根管</td></tr><tr><td>NucliSens 裂解缓冲液</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>最多可用于 48 次提取，常温保存</td></tr><tr><td>开口尖端移液管，10 mL</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>无菌， individually 包装（纸/塑料）</td></tr><tr><td>PE 螺口盖 PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>适用于 PET 瓶</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>检测范围 pH 2.8 至 pH 4.4，每包 50 条</td></tr><tr><td>塑料试管</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>包含盖子</td></tr><tr><td>聚乙烯巴斯德移液管</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>带刻度，总体积 7 mL，非无菌</td></tr><tr><td>带螺口盖的聚丙烯螺口瓶，150 mL</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td>螺口盖，无菌，刻度至 100 mL</td></tr><tr><td>带螺口盖的聚丙烯螺口瓶，60 mL</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>螺口盖，无菌，刻度至 50 mL</td></tr><tr><td>粉末状洗涤剂</td><td>-</td><td>-</td><td>常规洗衣粉</td></tr><tr><td>磁力搅拌器电源线</td><td>GenIUL</td><td>900011692</td><td>用于连接电池与磁力搅拌器</td></tr><tr><td>QuickPick 磁性工具</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>手持式磁性颗粒操作工具</td></tr><tr><td>盒装 QuickPick 吸头</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>无 RNase，已高压灭菌，96 个</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA 磁性颗粒</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3.2 mL</td></tr><tr><td>人工海盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>一种人工盐混合物，其溶解盐组成与海水非常相似</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>5 米卷装，内径&amp;nbsp; &amp;oslash; × 外径&amp;nbsp; &amp;oslash; = 6 × 10 mm</td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒，98.5 - 100.5%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28244295</td><td>颗粒状，1 千克</td></tr><tr><td>太阳能旋转平台</td><td>SOL-EXPERT Group</td><td>70020</td><td>丙烯酸板，10 RPM，最大承重 300 克</td></tr><tr><td>SOLIScript 一步法探针试剂盒</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>包含 Solis Biodyne 的 5x 一步法探针混合液 (qPCR 混合液) 和 40x 一步法 SOLIScript 混合液 (逆转录酶)，适用于 250 次反应</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS RNA 病毒提取试剂盒</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>包含 BioTools 的 BAW 缓冲液（洗涤缓冲液 1）、BAV3 缓冲液（洗涤缓冲液 2 和 3）和 BRE 缓冲液（洗脱缓冲液）</td></tr><tr><td>SpinBar 八面体搅拌子</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>带枢轴环，长 × 直径&amp;nbsp; &amp;oslash; = 38 × 8 mm，蓝色</td></tr><tr><td>封口尖端移液管，10 mL</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>无菌， individually 包装（纸/塑料）</td></tr><tr><td>封口尖端移液管，50 mL</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>无菌， individually 包装（纸/塑料）</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - 核酸去除剂</td><td>BioTools</td><td>22001-4291</td><td>用于去除材料和表面的核酸、细菌、真菌和支原体，450 mL</td></tr><tr><td>分子生物学级水试剂，1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>无核酸酶和蛋白酶，0.1 &amp;mu;m 过滤</td></tr><tr><td>Whirl-Pak 袋，540 mL</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>稳定底座</td></tr><tr><td>普通自封袋</td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>聚乙烯材质，长 × 宽 = 120 × 80 mm</td></tr></tbody></table>

virwatest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

人类和动物排出的病毒可能污染水源，当这些水被用于饮用、灌溉食物、清洗等用途时，会对人类健康构成风险。传统的粪便细菌指示物并不总能检测出病毒病原体的存在，因此检测病毒病原体及病毒指示物对于采取风险缓解措施具有重要意义，尤其是在人道主义场景以及水源性病毒暴发频发的地区。
目前，已有多种可实现粪便指示菌（FIB）现场定量检测的商业试剂盒。然而，针对病毒检测的商业化试剂盒尚不可用。环境水样中病毒的检测需要将数升水样浓缩至较小体积。此外，浓缩后，病毒的检测依赖于病毒基因组的核酸提取及分子检测等方法（例如基于聚合酶链式反应[PCR]的检测）。
本文所述方法可利用简单且便携的设备，从10升水样中浓缩病毒，并在现场提取病毒核酸。该方法可在现场对多种病毒进行水样检测，在人道主义救援场景中具有重要应用价值，也适用于缺乏配备完善实验室的任何场合。此外，该方法还可用于浓缩水样中的病毒，并将浓缩物在室温条件下运送至实验室进行后续分析。

方法开发
该方法由水与食品中病毒污染物实验室在GenIUL和乐施会（Oxfam Intermón）的协作下开发完成，包含三个不同步骤。第一步为病毒颗粒浓缩，是对先前描述的脱脂牛奶絮凝法的一种改进12,17,18。原始方法经过修改，使其无需电源供应、操作更简便，且无需离心步骤。
通过在地下水中添加已知浓度的人腺病毒（HAdV）和MS2噬菌体，测试了VirWaTest浓缩方法的回收率。VirWaTest浓缩与提取方法对MS2的病毒回收率估计为3.01%至18.02%，对HAdV的回收率为17.52%至44.22%。这些...

本文介绍了VirWaTest，这是一种简单、经济且便携的方法，可在使用现场对水样中的病毒进行浓缩和检测。

VirWaTest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

人类和动物排出的病毒可能污染水源，当这些水被用于饮用、食品加工……时，会对人类健康构成风险。

肠道病毒主要存在于各种水体储库中，包括地下水、静水、溪流、河流和再生水。这些病毒具有健康风险，可导致人类感染。肠道病毒通常引起胃肠炎，主要通过粪-口途径传播。其他水源性疾病由甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒引起急性肝炎，在孕妇中尤以戊型肝炎相关的病死率显著。目前为 humanitarian 情境下水质监测提出的真实方案，旨在以大肠杆菌等细菌作为粪便污染的指示物。但已有研究证实，这类细菌与其他更耐受多种消毒处理的微生物（如病毒）之间并无相关性。迄今为止，在人道主义危机环境中对病毒的检测主要通过调整现有检测方案以适应当地条件，并将样本运送至参考实验室进行病毒的分子检测。目前亟需能够在现场快速检测病毒病原体及病毒指示物的方法，以降低公共卫生风险，预防疫情暴发，并提高人道主义干预的效率。我们提出一种针对10升水样的病毒检测方法，该方法分为三个步骤：病毒浓缩、核酸提取和病毒检测。上述所有步骤均改编自我们实验室目前使用的方法，可利用便携式试剂和设备在采样现场完成，无需依赖电源和冷冻设备。此外，本方法中添加了一种保存液，以确保核酸在需要时可稳定保存并运送至参考实验室。我们提出的方法称为 VirWaTest，由 GenIUL 与 Intermon Oxfam 合作开发。开始实验前，应根据待检测样品的数量准备试剂和材料。建议每份水样采集两个重复样本，以获得具有代表性的结果。若有足量材料，可同时检测多个样品。在将试剂和材料转移或运送到需要该方法的地点之前，应提前准备并包装好。应包装的材料和小型设备清单见表一。按照相应的ISO方法制备作为过程对照的噬菌体MS2储备液，添加至每个水样中。然后将含有10至10个预制平台单位的悬浮液各10微升分装到10 mL离心管中，并让水分干燥。每个水样需要一支离心管。此外，为每个采集的样品另准备一支含有10 mL无菌蒸馏水的离心管。对于预絮凝脱脂牛奶溶液，准备一个含有脱脂牛奶的试管、一个装有海盐的自封塑料袋，以及一个装有蒸馏水的塑料瓶。为调节 pH 值，准备一个含有柠檬酸的试管、一个含有氢氧化钠的试管，以及两个分别装有 25 mL 和 50 mL 蒸馏水的塑料容器。对于每份待测水样，通过将海盐和柠檬酸加入自封塑料袋中制备一份调理试剂袋，并通过将裂解缓冲液和核酸保护剂加入 5 mL 试管中制备一份保存溶液。最后，准备四个中和小袋，向四个带拉链的塑料袋中加入强力洗涤剂。对于每个待提取的水样，准备一个含有磁性颗粒和乙醇的5 mL离心管，以及三个分别装有500、600和200微升洗涤缓冲液一、缓冲液二和缓冲液三的2 mL离心管，另准备一个含有洗脱缓冲液的离心管。若使用Newell热循环仪，每次PCR检测可同时分析两个不同的核酸提取样本。对于所有PCR检测，准备分子生物学用水。根据方案中描述的体积和浓度，配制包含两种引物和一种针对每种目标病毒特异的探针的混合液。对于每种病毒，将指定体积加入八联管的第1至第8管中。将条带剪断，分成两条，分别为1至5号管和6至8号管。针对每种病毒，将含有10⁵、10⁷和10⁹拷贝数的已知DNA悬液分别预先加入6、7和8号管中，并进行风干处理。该浓缩方案基于有机絮凝原理，即在低pH值和高电导率条件下，脱脂牛奶蛋白会形成絮状沉淀，病毒可吸附于其中。待絮状物沉降后，可轻松收集。使用带盖的平底桶采集10升水样。若从管道中采集水样，应在采集前让水流淌数秒钟。使用透明的桶有助于观察沉淀物。选择一个远离直射阳光的新鲜平坦区域，将连接电池的磁力搅拌器置于桶的支撑架下方，并将装有水样的桶放置在每个支撑架上。重新考虑柠檬酸和氢氧化钠，并摇动直至完全溶解。将500 mL蒸馏水倒入立式袋中，并将袋子放在磁力搅拌器上。加入一包海水盐和一根脱脂牛奶管中的全部内容物，在中等速度下搅拌五分钟。使用柠檬酸和氢氧化钠调节絮凝脱脂乳的 pH 值，使其介于 3.4 至 3.6 之间。关闭磁力搅拌器，确保絮状物可见。使用手电筒可能有助于观察絮状物。将搅拌子放入水中。将磁力搅拌器调至最高速并开启。向过程控制管中加入 10 mL 蒸馏水。轻轻颠倒混匀数次，将溶液倒入水中。将一个样品预处理袋中的内容物倒入水中，搅拌五分钟。确保水样的 pH 值在 3.4 至 3.6 之间。如有需要，调节pH值。加入100 mL预絮凝的脱脂牛奶溶液，用盖子密封桶，以最低转速持续搅拌至少8小时。8小时后，关闭磁力搅拌器，静置使絮状物沉降至少额外5小时。使用基于移液控制器、塑料管和几支移液管的系统，弃去上清液，注意不要扰动桶底的絮状沉淀。当液面即将到达搅拌子位置时，捏紧塑料管以停止液体流动，并将移液管从桶中移开。轻轻振荡桶以重新悬浮絮状物，然后将其倒入直立的塑料袋中。让絮状物额外静置一小时。用移液管小心吸取上清液，避免扰动絮状物。用移液管吸取絮状物，并将其转移至锥形管中。记录样本浓缩物的最终体积，并将1 mL转移至含有保存液的离心管中。该悬浮液可用于现场进行核酸提取，或运送至参考实验室进行进一步分析。收集絮状物时丢弃的水必须在处置前进行处理。将中和剂小袋中的内容物加入装有废弃水的桶中。混合均匀后静置三十分钟，然后将处理后的水作为普通废弃物丢弃。可以使用磁力移液器将磁性颗粒从一个离心管转移至另一个离心管。在进行提取操作前，请先熟悉磁力移液器的使用方法。将含有提取所需试剂的离心管按顺序放置在试管架中。即从左至右：结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。使用一次性塑料移液管将1 mL样品浓缩液转移至含有结合缓冲液的离心管中。上下颠倒混匀10次，以充分混匀溶液。将溶液在室温下孵育10分钟，同时使用单通道旋转混合器或手动方式持续混匀。使用磁力移液器和洁净的吸头收集磁性颗粒，该吸头可重复用于三种洗涤缓冲液；随后将磁性颗粒释放至含有第一种洗涤缓冲液的离心管中。用吸头轻轻振荡溶液30秒以洗涤颗粒，然后收集磁性颗粒。用洗涤缓冲液二和三重复此洗涤步骤。在洗涤缓冲液三中收集磁性颗粒，并将其释放至含有洗脱缓冲液的离心管中。然后弃去吸头。将溶液在室温下孵育5分钟，同时使用solo轨道振荡器持续混匀。更换磁力移液枪的吸头，收集洗脱缓冲液中的全部磁性颗粒。弃去附着有颗粒的吸头。核酸保留在洗脱缓冲液中，应将其储存以用于进一步分析或运输。使用预先制备的五管和三管条带检测人腺病毒。根据方案，向第一至第五管中分别加入水、PCR 混合液和核酸提取物。随后，向第6至第8号管中加入水和PCR混合液。将两个管条放入热循环仪中，并选择相应的运行程序。运行结束后，收集结果并分析获得的数据。只有在病毒检测结果为阴性后，才应进行MS2检测。使用为MS2检测准备的管条，并为PCR选择适当的热循环程序。VirWaTest磁性核酸提取法与QIAgen病毒RNA提取法进行了比较，通过检测人工添加人腺病毒和MS2的水样本来模拟实际检测情况。还原试验的 p 值显示，与使用 QiAgen 方法相比，采用 VirWaTest 作为两种测试病毒的提取方法时，病毒回收率显著更高。该病毒浓缩方法已在实地进行了测试，与乐施会（Oxfam）位于中非共和国班吉和厄瓜多尔佩德纳莱斯的卫生团队合作，由其采集水样，应用所开发的浓缩方法进行浓缩后，送至巴塞罗那的实验室进行核酸提取和病毒定量。在厄瓜多尔，所有检测的样本中均检出人腺病毒；而在班吉采集并浓缩的五个样本中，有一个样本人腺病毒检测呈阳性。该方法在中非共和国班吉由乐施会国际组织的水卫团队以及在厄瓜多尔佩德纳莱斯的另一支团队进行评估后，已被证明具有实用价值。VirWaTest 可作为早期预警系统的一部分，也可由参与水卫生工作的组织用于疫情调查。该设备有助于对水中的病毒病原体进行分析，并改善水质安全管理，旨在减少人道主义危机情境下病毒性疾病的发病事件。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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来源：Fout, G. S, Cashdollar, J. L. 美国环保局方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。II. 全可培养病毒检测法。可视实验杂志...

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EPA 方法 1615 使用带正电滤膜来浓缩环境水和饮用水中的肠道病毒和诺如病毒。本论文描述了用于方法 1615...

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EPA 方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。第二部分：总可培养病毒检测

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

介绍了一种基于阴离子交换树脂的方法，该方法适用于基于液体冲击的生物气溶胶病毒采样。当与下游分子检测技术联用时，该方法可实现对生物气溶胶中病毒的简便且灵敏的检测。...

使用阴离子交换树脂从生物气溶胶中检测病毒

从环境水和废水样品中浓缩病毒是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定与定量。尽管已有多种病毒浓缩方法被开发和验证，本文展示了超滤法和脱脂乳絮凝法在不同样品类型中对RNA病毒的有效性。...

利用脱脂牛奶絮凝与超滤法从环境水和废水样品中浓缩病毒颗粒

了解VirWaTest方法用于水样中肠道病毒检测，该方法简便便携，适用于现场即时检测。通过有机絮凝浓缩病毒并结合磁珠核酸提取，可在人道主义危机环境中提升水质安全与公共卫生保障。

VirWaTest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

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