Name: 在Vivo直接重新编程居民胶质细胞到内神经通过病毒载体的脑内注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 了解利用AAV病毒载体将小鼠脑内驻留胶质细胞直接重编程为成熟中间神经元的体内方法。该技术可生成小白蛋白阳性神经元，为精神疾病研究与细胞替代疗法提供新途径。

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Marcella Birtele 获得了欧洲联盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2015）下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络及资助协议编号676408的资助。Daniella Rylander Ottosson 获得了瑞典研究理事会（2017-01234）的资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在表达 Cre 的小鼠品系中，可使用 AAV FLEX 载体实现体内直接重编程。需要注意的是，不同小鼠品系在重编程效率方面存在差异。在纹状体中进行体内重编程时，与其他品系相比，NG2-Cre 小鼠品系已被证明效率更高。在开始使用新的动物品系前，应查阅小鼠供应商提供的关于 Cre 随时间表达的指导信息，因为动物年龄常会影响该蛋白表达的特异性。在我们的研究中，未使用超过 12 周龄的动物进行体内重编程，以避免 Cre 在 NG2 胶质细胞以外的细胞中表达。建议持续使用仅注射 Synapsin-FLEX-GFP 构建体的对照动物并进行监测，以便观察是否存在 GFP 阳性细胞；若未使用重编程基因（ALN），则不应出现此类细胞。
为了鉴定新重编程的神经元，采用一种神经元特异性的鉴定方法（例如本方案中所述的方法）至关重要。该方法能够准确识别重编程神经元，并将其与内源性邻近细胞区分开来，这在同源区域进行重编程时尤为重要。
靶向病毒注射的正确脑区结构也非常重要。因此，病毒注射的立体定位手术至关重要，尤其是在靶向较小的脑区结构时，必须确保操作的精确性。
我们先前已证明11，基于相同的重编程因子，在体外重编程实验中无法可靠地预测体内重编程的结果。因此，所有感兴趣的因子都必须在体内进行测试。据我们观察，尽管这些基因被认为参与了其他类型神经元的发育，但多种不同的因子组合在体内均产生相同亚型的神经元（即中间神经元11）。
重编程神经元的全细胞膜片钳记录是一种精细的技术，良好的组织处理对于获得理想结果至关重要。使用冰冻的 Krebs 溶液进行灌流&#160;溶液可改善组织质量。此外，需谨慎处理膜片钳记录的神经元。尽管可通过全细胞膜片钳技术对重编程神经元的成熟度及表型特征进行一定程度的评估，但这些细胞与内源性对应细胞并不完全等同。应结合其他分析方法（如基因组测序，例如RNA测序）进一步确认重编程细胞的身份。
本文所述技术可为未来需要脑内神经元替代的治疗方案提供参考。尽管体内重编程仍处于早期阶段，且尚无预见其向人类应用的转化，但该技术可提供一种在脑内评估外源基因功能以及研究细胞体内成熟过程的方法。

本方法的总体目标是高效地将脑内固有的胶质细胞在活体中转化为功能性且亚型特异性的神经元，例如表达小清蛋白的中间神经元。这为开发无需外源细胞来源的脑疾病替代细胞替代疗法提供了新的进展，同时也创建了一种用于原位研究细胞命运转换的工具。&#160;
大脑生成新神经元的能力有限。因此，在神经系统疾病中，需要外源性细胞来源以实现脑组织修复。为此，多年来研究人员已对多种细胞来源进行了深入研究，包括原代组织来源的细胞、干细胞衍生的细胞以及重编程细胞。1,2,3将脑内常驻细胞直接重编程为神经元是一种新兴方法，有望为脑修复提供一种极具吸引力的策略，因为它利用患者自身的细胞在脑内生成新的神经元。迄今为止，已有多个研究报告通过病毒载体递送在脑内实现体内重编程。4,5,6,78,9 在大脑的不同区域，如皮层、脊髓、纹状体和中脑5,10,11，以及在完整和损伤的脑组织中5,8,11,12已获得抑制性和兴奋性神经元4,8但这些细胞的精确表型或功能尚未得到详细分析。&#160;
在本方案中，我们描述了一种更高效的重编程方法及对体内重编程神经元的细胞特异性鉴定，并提供了用于评估重编程神经元成熟度与表型的功能分析方案。&#160;基于功能及免疫组织化学特征的表征&#160;
我们采用了一种 Cre 诱导型 AAV 载体和 GFP 报告基因来鉴定体内重编程神经元。这种病毒载体的优势在于能够感染脑内分裂和非分裂细胞，从而增加靶向细胞的数量，可作为逆转录病毒使用的替代方案7,8。通过使用神经元特异性的突触素驱动的 FLEX 报告系统（GFP），我们能够特异性地检测新生成的神经元。以往的研究采用亚型特异性启动子进行体内重编程7,9，这些启动子也可实现重编程基因和报告基因在特定细胞类型中的表达。然而，该方法需要通过死后分析报告基因与神经元标记物的共表达来进一步鉴定重编程神经元。而使用神经元特异性报告基因（如本文所述）则可实现直接鉴定，从而为重编程成功提供直接证据，并支持活细胞鉴定，这对于膜片钳电生理实验至关重要。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;AAV5 克隆与病毒载体制备试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP（FLEX）序列1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac&lt;br/&gt;gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc&lt;br/&gt;accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg&lt;br/&gt;acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa&lt;br/&gt;gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga&lt;br/&gt;agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP（FLEX）序列 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac&lt;br/&gt;gaagttatcattgggattcttcctattttgatc&lt;br/&gt;caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct&lt;br/&gt;caccatcgacccataacttcgtatagcatacat&lt;br/&gt;tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa&lt;br/&gt;ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>质粒工厂</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>质粒工厂</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293细胞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm²</td></tr><tr><td>Tris H-Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> TE 缓冲液使用 10 mM，pH 8.0；裂解缓冲液使用 50 mM，pH 8.5；IE 缓冲液使用 20 mM，pH 8.0；洗脱缓冲液使用 20 mM，pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA：Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> 使用含 1 mM EDTA 的 TE 缓冲液 </td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td> 参见超纯水系统 </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 M</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;acute;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> HBS 使用 140 mM；裂解缓冲液使用 150 mM；IE 缓冲液使用 15 mM；洗脱缓冲液使用 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> 裂解缓冲液：1 mM </td></tr><tr><td>超速离心密封管</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&amp;reg;&amp;nbsp;聚丙烯管</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&amp;trade;&amp;nbsp;密度梯度介质</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器-18G 针头</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>实验室玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>阴离子交换滤膜</td><td>PALL 实验室</td><td>MSTG25Q6</td><td> 带Mustang Q膜的Acrodisc装置 </td></tr><tr><td>离心过滤装置</td><td>默克</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 装置 </td></tr><tr><td>内毒素去除型质粒DNA提取试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Falcon管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>反转录终端重复序列（ITR）的上游引物</td><td></td><td></td><td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>反向引物用于反转末端重复序列（ITR）</td><td></td><td></td><td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&amp;acute;FAM / 3&amp;acute;BHQ1 探针</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 mm 滤膜</td><td>默克</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV 滤器</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AAV5 病毒载体准备设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰箱 -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻柜 -80 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰箱 +4 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV病毒室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水系统</td><td>默克</td><td>Milli-Q&amp;reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K 超速离心机</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>聚合酶链式反应（PCR）</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch 梯度PCR仪</td><td></td></tr><tr><td>定量聚合酶链式反应（qPCR）</td><td>罗氏</td><td>LightCycler&amp;reg; 480 系统</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre 小鼠</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129，货号 #008533</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脑内注射重编程因子所需试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> 用温水稀释至1%溶液。 </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> 腹腔注射，剂量为60 mg/ml，用于终末实验操作。 </td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>默克</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>逆行标记微球</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脑内注射重编程因子所需设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td> 来自 RSG Solingen。 </td></tr><tr><td>剪刀</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>来自生物化学</td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>20号</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>小鼠耳杆</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 μl</td></tr><tr><td>带可拆卸针头的注射器</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 内径0.75，外径1.5 </td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管拉制仪</td><td>Sutter公司</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>牙科钻头</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉舱及泵</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>针头</td><td>默克</td><td>Z192414&amp;nbsp;Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>小鼠和新生大鼠立体定位框架适配器</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> 来自 Covidien 2187。 </td></tr><tr><td>棉纱布</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>橡胶管</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;全细胞膜片钳记录试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;- H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> 参见超纯水系统 </td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td>制备 1 或 2 M。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-葡萄糖酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&amp;nbsp;Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA（乙二醇双四乙酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&amp;nbsp;Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH-HEPES 酸（N-2-羟乙基哌嗪-N&amp;rsquo;-2-乙磺酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na₃GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>默克</td><td>P1675&amp;nbsp;Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>默克</td><td>C239&amp;nbsp;Sigma</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;全细胞膜片钳记录设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>Sutter公司</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管拉制仪</td><td>Sutter公司</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多钳位软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫组织化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td> 使用浓度为4%。&amp;nbsp;警告：&amp;nbsp;PFA 是一种强效固定剂，避免摄入和接触皮肤。 </td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>默克密理博</td><td>1040051000</td><td> 使用浓度为0.1%。 </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> 驴抗血清。使用浓度为 1 : 400。 </td></tr><tr><td>血清</td><td>默克密理博</td><td>S30-100ML</td><td> 用 Milli-Q 水将粉末重悬至 1 mg/mL。分装后于 -80 °C 保存。20&amp;deg;C,&amp;nbsp;对光敏感。使用浓度为 1 : 500。 </td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2&amp;prime;-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: KPBS-T 中 600 </td></tr><tr><td>链霉亲和素-Cy3</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>434315</td><td>1:5000，兔</td></tr><tr><td>抗GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000，小鼠。</td></tr><tr><td>抗-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200，山羊</td></tr><tr><td>反聊天</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000，兔</td></tr><tr><td>抗NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000，鸡</td></tr><tr><td>抗GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>封片液</td><td>默克</td><td>10981</td><td> 含 DABCO 的聚乙烯醇封片剂&amp;reg;, 抗荧光淬灭 </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗冻溶液</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N，1000 mL/件</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫组织化学设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 激光扫描共聚焦显微镜</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

将脑内常驻胶质细胞在体内直接转化为具有功能且特定亚型的神经元，为开发替代性细胞替代疗法提供了新的方向，同时也为原位研究细胞命运转变创造了工具。迄今为止，已可通过体内重编程获得神经元，但这些神经元的精确表型及其成熟过程尚未被详细分析。本实验方案中，我们采用基于腺相关病毒（AAV）的病毒载体系统，描述了一种更高效的转化方法以及对体内重编程神经元进行细胞特异性鉴定的技术。同时，我们还提供了一套用于评估重编程细胞神经元功能成熟度的实验方案。通过注射包含重编程因子基因及突触素启动子驱动的报告基因的翻转-切除（FLEX）载体，可靶向特定脑区细胞类型以实现细胞重编程。该技术可便捷地识别新生成的重编程神经元。结果表明，所获得的重编程神经元随时间推移逐步功能成熟，能够接收突触连接，并表现出多种中间神经元类型的电生理特性。利用转录因子 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1，大部分重编程细胞表现出快速放电、含小白蛋白的中间神经元特征。&#160;向大脑中作为细胞重编程靶标的特定细胞类型进行转导。该技术可轻松识别新重编程的神经元。结果表明，所获得的重编程神经元随着时间推移在功能上逐渐成熟，接收突触连接，并表现出不同类型中间神经元的电生理特性。通过使用转录因子 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1，大多数重编程细胞具有快速放电、含小清蛋白的中间神经元特性。

通过注射 AAV 载体，可在 NG2-Cre 小鼠纹状体中成功将内源性 NG2 胶质细胞重编程为神经元（图 1A）。为了特异性靶向 NG2 胶质细胞，将携带重编程/报告基因的 FLEX 载体以反义方向插入，并由两对反向平行、异型的 loxP 位点侧翼包围（图 1B）。三个重编程基因（Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1）分别位于独立的载体上，均由普遍存在的 cba 启动子驱动表达。为了确保 GFP 的表达仅限于源自 Cre 表达细胞的重编程神经元，GFP 被置于神经元特异性突触素启动子的调控之下（同样位于 FLEX 载体中）。
联合使用重编程因子与报告基因构建体可在小鼠纹状体中生成GFP阳性神经元（图1C，C’）。仅使用报告基因构建体而无重编程基因时，则无法产生GFP阳性神经元（图1D）。
重编程后被生物胞素（biocytin）填充的神经元在死后免疫染色后可见（图2A）。若转分化成功，应可观察到广泛的神经元形态。重编程神经元的电生理记录显示存在具有自发活动特征的功能性突触后连接（图2B、C）。该自发活动可被离子型GABA能或谷氨酸能阻断剂（Picrotoxin或CNQX）抑制，表明重编程神经元接受了兴奋性和抑制性突触输入。自发活动的发生率随病毒感染后时间的延长而增加（图2D），提示其逐渐成熟。 
功能性神经元中存在电流诱导的动作电位。转化后随着时间推移，动作电位数量逐渐增加图2E）。这进一步表明神经元功能的成熟。在未成熟的神经元中，电流将引发极少或完全不引发动作电位（图 2F).
神经元的放电模式具有细胞类型特异性，因为它取决于细胞形态和通道表达等因素。15体内重编程神经元中记录到的放电模式可被区分为不同组别，并与内源性神经元亚型进行比较，例如快速放电型中间神经元（细胞类型B， 图3B）或其他细胞类型（图3A，C，D）。观察到的电生理学差异可通过特定亚型标志物的存在及其与GFP的共表达来证实（图3E- H综上所述，这些数据表明纹状体中重编程产生的神经元具有多种类型中间神经元的特性，例如表达小清蛋白（Parvalbumin）、胆碱乙酰转移酶（ChAt）和神经肽Y（NPY）的中间神经元，同时也具有纹状体中等棘状神经元的特征（DARPP32+）图 3E- H).
<img alt="基因重编程的AAV注射过程示意图；NG2-Cre小鼠模型；GFP荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：体内将原位NG2胶质细胞重编程为神经元。（A）通过AAV病毒介导的纹状体NG2胶质细胞体内重编程示意图。（B）用于体内重编程的AAV5 FLEX载体示意图，其中目标细胞中Cre的表达调控基因表达。（C 和 C’）将Syn-GFP + ALN注射至纹状体后产生的体内重编程神经元。（D）当病毒混合物中未加入重编程因子，仅注射报告基因载体时，无重编程神经元产生。比例尺 = 100 μm（C）、25 μm（C’）、25 μm（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元活动、突触记录、饼图；电生理学、突触功能分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：体内重编程神经元具有功能活性，并随时间推移表现出成熟特征。（A）经生物胞素标记的重编程神经元，显示出成熟的神经元形态，包括树突棘。图中记录显示（B）抑制性（GABA能）活动，该活动可被GABAA受体拮抗剂毕叩毒素（picrotoxin）阻断；以及（C）兴奋性活动，该活动可被AMPA受体拮抗剂CNQX阻断。（D）具有突触后活动的神经元数量随时间逐渐增加。（E）在注射后5周（w.p.i.）时，膜片钳记录的神经元已能产生重复性放电，并在8周和12周时持续表现出该特性。（F）由电流诱导的未成熟神经元动作电位及突触后活动，与B和D相比，其突触事件和动作电位数量均较少。比例尺 = 25 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元细胞类型的电生理分析及GFP表达；数据图与荧光图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：体内重编程神经元表现出纹状体中间神经元的免疫组织化学和电生理特性。（A-D）体内重编程神经元的放电模式可呈现不同类型：（A）A型类似于内源性中等棘状神经元（DARPP32+）；（B）类似于快速放电型（PV+）中间神经元；（C）类似于具有明显下垂电位的低阈值放电神经元（NPY+）；（D）具有大幅后超极化放电特性的神经元（Chat+）。（E-H）共聚焦图像显示GFP与中间神经元标志物PV（E）、ChAT（F）、NPY（G）以及投射神经元标志物DARPP32（H）的共定位。所有比例尺 = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。

将脑内常驻胶质细胞在体内直接转化为具有功能且亚型特异性的神经元，为开发替代性细胞替代疗法提供了新的方向，同时也为原位研究细胞命运调控创造了工具。迄今为止，已可通过体内重编程获得神经元，但这些神经元的精确表型及其成熟过程尚未被系统分析。本实验方案介绍了一种基于腺相关病毒（AAV）载体系统的更高效转化方法，并实现对体内重编程神经元的细胞特异性识别。同时，我们提供了一套评估重编程细胞神经元成熟功能的实验流程。通过注射含有重编程基因及突触素启动子驱动报告基因的翻转-切除（FLEX）载体，靶向脑内特定细胞类型以实现细胞重编程。该技术可便捷地识别新生成的重编程神经元。结果表明，所获得的重编程神经元随时间推移逐步功能成熟，能够接收突触连接，并表现出多种中间神经元类型的电生理特性。利用转录因子 Ascl1、Lmx1a 和 Nurr1，大部分重编程细胞表现出快速放电、含小清蛋白的中间神经元特征。

本方案表明，可以直接在脑内由常驻胶质细胞生成新的神经元，且这些重编程细胞能够成熟为特定亚型的神经元。其主要优势在于使用了依赖 cre 的 AAV 病毒，可特异性靶向 NG2-胶质细胞，以及带有 GFP 报告基因的标记系统，用于标记重编程神经元以便分析。在脑内生成新的神经元可能为未来脑内细胞替代疗法的发展提供方向。在本方案中，我们生成了与精神疾病相关的表达小清蛋白的中间神经元。根据您希望靶向的神经元表型和神经系统疾病，体内重编程技术可应用于大脑的其他区域和神经环路。本实验操作将由本实验室的技术员Jenny Johansson、前博士生Maria Pereira以及博士生Marcella Birtele进行示范。为制备 AAV5 病毒载体，使用标准培养基在五个 T175 培养瓶中接种 HEK293T 细胞。当细胞融合度达到 50% 至 70% 时，准备以下转染混合物。在 50 毫升离心管中，加入等摩尔量的载体质粒和 pDG 系列辅助质粒。加入Tris-EDTA缓冲液至终体积为144 µL，然后加入超纯水至总体积为1296 µL，并混匀。接着，加入144 µL的2.5 M氯化钙溶液并混匀。之后，向DNA溶液中加入1.92 mL HBS，并立即涡旋振荡。室温下孵育，精确持续 60 秒。随后，将溶液转移至 28 毫升新鲜细胞培养基中并混匀。用含有转导混合物的培养基替换锥形瓶中的培养基。等待三天后，将培养基转移至废液容器中。向每个培养瓶中加入 5 mL 收集缓冲液，然后向每个培养瓶中再加入 4 mL DPBS 以冲洗残留的细胞，并将冲洗液与细胞悬液合并。在 4 °C 条件下，以 1,000 × g 离心收集的细胞 5 分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀物溶解在15毫升裂解缓冲液中。将50毫升离心管在干冰上冷冻15分钟，随后置于-20°C冰箱中保存。使用前，在37°C水浴中解冻收获的细胞裂解物。在此步骤中，通过碘克沙醇梯度超速离心法纯化 AAV，并使用超速离心管在室温下以 350,000 × g 离心 1 小时 45 分钟。为提取含有 AAV 的组分，将带有 18 号针头的 10 毫升注射器插入约位于 40% 至 60% 相界面下方 2 毫米处，针尖斜面朝上，缓慢吸取。当已提取 5 至 6 毫升病毒载体时，应在到达蛋白层之前停止操作。然后，通过阴离子交换滤膜以每秒不超过一滴的速度加压过滤，对稀释后的碘克沙醇梯度溶液进行纯化和浓缩。随后，缓慢加入三毫升 IE 缓冲液冲洗滤膜。接着，用一到两毫升洗脱缓冲液将混合物洗脱至离心过滤装置中。向装置中加入 DPBS，至终体积为 4 毫升。在室温下以 2,000 × g 离心，直至滤膜中剩余 DPBS 体积少于 0.5 毫升。随后，从管底部移除液体，重新加入 4 毫升 DPBS，再次离心。重复此步骤两次，确保最后一次离心后滤膜上的浓缩病毒液体积约为 200 微升。使用移液器吸取 200 微升浓缩病毒液，并通过 0.22 微米滤器过滤以实现灭菌。随后，将 200 微升分装至带有锁扣内插管的玻璃小瓶中。为了注射重编程因子，将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪中。手术开始时给予适当的镇痛处理，然后将注射针玻璃毛细管的尖端移至颅骨前囟上方。确保毛细管尖端在前后（A-P）和内外（M-L）两个平面上均完全水平。将数字坐标计数器上的内-外（M-L）和前-后（A-P）值均重置为 0.0。为确保动物头部处于完全水平的位置，使用数字坐标计数器测量当 A-P 臂位于 +2.0 和 -2.0 时以及 M-L 臂位于 +2.0 和 -2.0 时的背-腹（D-V）坐标值，并相应调整门齿固定杆和耳杆的高度。随后，将注射器略微抬起，使用牙科钻在注射坐标处钻孔。从该位置开始，以环形且轻柔的方式进行钻孔。然后，用一块棉纱布覆盖开放的切口，并用生理盐水冲洗注射器。灌注完成后，吸入一个气泡，然后吸取一微升含有病毒载体的溶液。确保病毒溶液位于气泡下方且易于观察。接着，缓慢将注射器下降至目标深度，并确保行进路径避开骨碎片。随后，以每分钟0.4微升的速率注射1微升病毒溶液。注射完成后，留置2分钟以使病毒扩散，然后撤出注射针。扩散结束后，缓慢回撤注射针，直至毛细管尖端完全退出脑组织，随后仔细缝合切口，并将动物从立体定位仪上取下。将动物置于术后观察区进行监测，直至其意识恢复。病毒注射后，动物饲养时间最长可达12周，以使脑内固有胶质细胞重编程为成熟神经元。使用振动切片机制备用于电生理实验的脑切片时，需从脑的最前部开始，快速向下切至纹状体水平。然后以冠状面将纹状体切成275微米厚的切片，切割速度为0.1毫米/秒。每切一片后，小心移除未注射侧的纹状体组织，将注射侧放入含有底部网筛和氧合CREB sense载玻片的样品瓶中，并置于室温水浴中。待所有切片完成后，将样品瓶保持在室温下。随后，缓慢将水浴温度升至37摄氏度，维持30分钟，然后关闭加热器，使其冷却至室温。将一个组织切片转移至用于电生理记录的记录室后，将玻璃移液管安装在记录电极上，并将其浸入溶液中。再次检查电极的电阻。然后，将移液管缓慢靠近重编程细胞，同时在电极内保持轻微的正压，以防止堵塞管尖；在进行膜片钳操作前，确认该细胞为GFP阳性。细胞形成膜片钳后，将细胞维持在电流钳模式下，膜电位保持在-60至-70毫伏，并施加持续500毫秒、从-20至+90皮安、以10皮安为增量的电流刺激，以诱导产生动作电位。此结果表明细胞已实现神经元功能成熟及成功的重编程。随后，切换至电压钳模式，在去极化10毫伏的梯度下记录内向钠电流和延迟整流钾电流。此处为记录后用生物胞素填充的重编程神经元，显示成熟的神经元形态及树突棘结构。此处对重编程神经元的电生理记录显示存在功能性突触后连接，并可检测到自发性活动。图中显示了被吡格列酮（picrotoxin，GABAA受体拮抗剂）阻断的抑制性活动，以及被CNQX（AMPA受体拮抗剂）阻断的兴奋性活动。在注射后五周，膜片钳记录的神经元已表现出突触后活动，并持续至八周和十二周。随时间推移，产生电流诱导动作电位的神经元数量也逐渐增加。更详细的分析揭示了多种不同的放电模式，其中大多数细胞表现出类似于小清蛋白中间神经元的快速放电活动。12周时的免疫组织化学分析进一步显示，报告基因GFP与小清蛋白存在共表达。通过该操作流程，可利用膜片钳寻迹技术检测基因表达，或通过单突触示踪结合iDISCO方法评估三维突触连接性。现在已有可能将脑内固有胶质细胞重编程为表达小清蛋白的中间神经元，我们已开始研究这些神经元是否具有真实性及其能否作为治疗工具。在处理动物和使用 AAV 病毒时，请务必遵循既定的实验方案与指导原则。

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