Name: 非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病的一种先进的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病的小鼠模型构建方法。本研究通过高脂饮食和非SPF环境饲养建立可靠模型，并利用流式细胞术分析肝脏和脂肪组织中的免疫细胞亚群，为研究肥胖相关炎症的免疫机制提供重要工具。

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感谢Anke Jurisch、Diana Woellner、Kathrin Witte博士和Cornelia Heckmann在实验操作方面的协助，以及Biolegend公司Benjamin Tiburzy对设门策略提出的有益建议。J.S. 获得了亥姆霍兹基金会（ICEMED）的资助。本研究得到了柏林健康研究所（BIH）临床研究单元、德国联邦教育与研究部的“BCRT项目资助”以及爱因斯坦基金会的资助。K.S.-B. 和 H.-D.V. 由FOR2165项目资助。

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》和《动物福利法》，并在本机构动物护理与使用委员会的监督下进行。动物实验方案根据德国柏林夏里特医院的机构伦理准则实施，并已获得柏林州卫生与社会事务局的批准，符合ARRIVE指南的要求。
1. 非酒精性脂肪性肝炎的饮食诱导动物模型
<ol>
	<li>在4周龄时将小鼠（C57Bl/6J，雄性）转移至非SPF级饲养环境，并使其持续暴露于广泛的环境病原体/抗原中。通过每日抓取处理实验动物以确保暴露，因为抗原可通过空气传播实现扩散。</li>
	<li>将小鼠（C57Bl/6J，雄性，12周龄）饲养于开放式笼具系统中，配备常规过滤器，维持12小时光照/12小时黑暗循环，温度控制在22 °C。实验饮食和垫料不进行辐照或高压灭菌处理。进入动物饲养设施时不佩戴口罩或头套，开放动物房之间的门，不使用风淋设备。</li>
	<li>确保每日对实验动物进行抓取处理，并定期更换饲养房间，以促进抗原通过空气传播。同时补充非特异性微生物暴露，每日将邻近房间内哺乳类实验动物使用的垫料引入饲养环境，以增强抗原暴露。</li>
	<li>采用流式细胞术检测血液和脾脏中CD44-CD62L-效应记忆型CD4+和CD8+ T细胞的比例（方法见参考文献13）。 
	注意：在此，我们将CD8+ T细胞中效应记忆型CD8+ T细胞比例增加20%定义为微生物暴露充分的证据。</li>
	<li>使用高脂饮食（HFD，60 kJ%来自脂肪，19 kJ%来自蛋白质，21 kJ%来自碳水化合物）并自由饮用含6%蔗糖的水，对5周龄C57Bl/6J雄性小鼠饲喂7至15周。为在整个实验过程中诱导胰岛素抵抗的形成，HFD中应含有60% kJ的脂肪（如上所述）。 
	注意：应进行苏木精染色，并观察到肝细胞气球样变性、Mallory-Denk小体、免疫细胞浸润及大泡性脂肪变性等组织学特征，以证实存在类似NASH的肝脏病理改变（见参考文献13所示）。</li>
</ol>
2. 试剂与溶液的配制
<ol>
	<li>准备70%乙醇、磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙和镁）并添加0.5% BSA，以及ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液。</li>
	<li>染色缓冲液
	<ol>
		<li>将10 mL胎牛血清（FCS）溶解于500 mL PBS中，配制成含2% FCS的PBS溶液。使用前将染色缓冲液置于冰上预冷。</li>
		<li>将溶液储存在塑料瓶中，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于脂肪组织消化的胶原酶溶液
	<ol>
		<li>将2.5 g牛血清白蛋白（BSA）溶解于500 mL PBS中，得到0.5% BSA/PBS溶液。</li>
		<li>将74.5 g CaCl2溶解于10 mL 0.5% BSA/PBS中，得到10 mM CaCl2溶液。</li>
		<li>向每毫升含10 mM CaCl2的0.5% BSA/PBS溶液中加入1 mg II型胶原酶（见材料表）。</li>
		<li>每克脂肪组织样本准备3 mL胶原酶消化液。每次分离前均需新鲜配制胶原酶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于肝脏组织消化的胶原酶溶液
	<ol>
		<li>将2.5 g BSA溶解于500 mL汉克平衡盐溶液（HBSS）中，得到0.5% BSA HBSS溶液。</li>
		<li>向500 mL 0.5% BSA/HBSS溶液中加入10 mL FCS，得到含2% FCS的0.5% BSA/HBSS溶液。</li>
		<li>向每毫升2% FCS 0.5% BSA/HBSS溶液中加入0.5 mg IV型胶原酶（见材料表）。</li>
		<li>向每毫升2% FCS 0.5% BSA/HBSS胶原酶溶液中加入0.02 mg DNase。</li>
		<li>每个肝脏组织样本准备13 mL胶原酶消化液。</li>
		<li>每次分离前均需新鲜配制胶原酶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>脂肪组织消化
	<ol>
		<li>通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位处死小鼠。用70%乙醇喷洒胸部。沿肋骨全长小心地在皮肤和腹壁上做一道5-6 cm的中央切口，以暴露胸膜腔和心脏。 
		注意： 不要损伤深层器官，并保持剪刀尖朝上。</li>
		<li>使用26 G针头在左心室顶端注射至少10 mL的0.9%生理盐水溶液。 
		注意： 灌注成功以肝脏变白为标志。</li>
		<li>用剪刀打开腹腔，用精细弯剪切除两侧的腹膜周围脂肪垫。用精细弯剪分离性腺组织，称量脂肪组织。</li>
		<li>使用剪刀在4 °C的培养皿中对脂肪组织进行机械解离，将其剪成细小碎片。将脂肪组织转移至50 mL锥形离心管中，并用1 mL 0.5% BSA/PBS冲洗培养皿。</li>
		<li>每克脂肪组织加入3 mL脂肪组织消化液（按步骤2.3配制）。将脂肪组织消化液在37 °C、轻柔振荡（200 rpm）条件下孵育20分钟。</li>
		<li>每克脂肪组织加入 5 mL 0.5% BSA/PBS，置于冰上。用 10 mL 血清移液管反复吹打混匀，然后在推杆辅助下通过 100 µm 滤网过滤。</li>
		<li>以 500 x g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>用移液器去除漂浮的脂肪细胞组分。将细胞沉淀（基质血管组分）重悬于 1 mL ACK 裂解缓冲液中（见 材料表加入10 mL含2% FCS的PBS。</li>
		<li>以 500 x g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL含2% FCS的PBS中。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏组织消化
	<ol>
		<li>将肝脏置于装有PBS的锥形离心管中，冰上运输。</li>
		<li>在4 °C条件下，使用注射器活塞在培养皿中进行机械解离。将解剖得到的肝组织放入含有10 mL预热肝消化液的50 mL锥形离心管中。用3 mL肝消化液冲洗培养皿。</li>
		<li>将肝组织溶液在37 °C、轻柔振荡（200 rpm）条件下孵育20分钟。</li>
		<li>加入20 mL HBSS，用10 mL血清移液管反复吹打混悬液数次，并借助推杆将液体通过100 µm细胞筛过滤。</li>
		<li>500 x g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。倾去上清液，将细胞沉淀重悬于 20 mL HBSS 中。</li>
		<li>在室温下以 30 x g 离心 1 分钟，以去除肝细胞基质。弃去细胞沉淀。</li>
		<li>将上清液在500 x g条件下离心 g 4 °C下离心10分钟。将沉淀重悬于10 mL 33%低黏度密度梯度介质溶液中（见 材料表) 在 HBSS 中，随后进行离心（800 x g；30 分钟；室温；无离心刹车。</li>
		<li>将沉淀重悬于1 mL ACK裂解缓冲液中，室温孵育4分钟。然后加入10 mL HBSS。 
		注意： 用移液管小心吸取上清液，尽量避免吸到含有免疫细胞和红细胞的沉淀物，仅弃去上清液（保留位于界面相的肝细胞）。</li>
		<li>将细胞通过30 μm滤网过滤至15 mL锥形离心管中，于500 x g离心 g 4 °C下离心10分钟。倾去上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL含2% FCS的PBS中。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 表面染色
<ol>
	<li>按照 表1 和 表2 所述方法，制备用于T细胞亚群（Panel 1）和固有免疫细胞（Panel 2）的抗体混合液。抗体体积已根据抗体浓度优化，适用于一个样本（100 µL）。 
	注意： 淋巴细胞与固有免疫细胞在自发荧光方面存在差异，应分别进行分析。</li>
	<li>在聚苯乙烯FACS管中，使用最多3 x 106个细胞，体积为100 µL，用于表面染色。为阻断Fc受体，加入10 µL抗-CD16/CD32抗体（1:100稀释），冰上孵育10分钟。使用未染色的阴性对照样本，调节侧向散射（SSC）和前向散射（FSC），以确定阴性细胞群的位置。</li>
	<li>涡旋混匀，并加入适量体积的Panel 1和Panel 2抗体混合液。向每个样本中加入1 µL活性染料，以区分活细胞与死细胞。在4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>用2 mL含2% FCS的PBS洗涤两次，于4 °C以300 x g 离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于300 µL含2% FCS的PBS中，4 °C保存，直至进行FACS分析。 
	注意： 开始检测前，将细胞通过30 µm细胞滤网转入聚苯乙烯FACS管中，并涡旋混匀。流式细胞术使用在4 °C、含2% FCS的PBS中保存1–3小时的标记细胞进行。为获得最佳结果，细胞应尽快分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞术的补偿、采集与设门
<ol>
	<li>运行未染色的阴性对照样本，设定流式细胞仪的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），并调整电压以检测白细胞群，区分碎片与活细胞。排除碎片和死细胞。 
	注意：由于额外的密度梯度分离步骤，肝脏来源的细胞悬液活力可能低于来自性腺周围脂肪组织的细胞悬液。</li>
	<li>运行单染对照样本进行多色补偿。 
	注意：如果目标细胞群体的细胞数量过少，无法用于补偿，可使用抗体捕获微球来校正光谱重叠。建议为每种抗体设置荧光减一（FMO）对照以检测细胞可能存在的自发荧光信号，但本实验方案中未采用。</li>
	<li>开始检测，收集足够数量的事件（至少 50,000 个事件），并记录实验数据。</li>
	<li>导出 FCS 数据文件用于分析，并设定门控策略。首先圈选 CD45+ 白细胞，以鉴定后续的细胞亚群。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脂肪性肝炎与肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常等代谢异常密切相关15。多项研究表明，脂肪组织炎症可促进2型糖尿病的发病过程，其中包括先天性和适应性免疫系统的多种细胞水平发生改变4,5,16,17。此外，研究发现肥胖可调节免疫通路的活化，进而导致肝脏并发症18。目前，人们对脂肪组织和肝脏炎症反应中免疫细胞表型的特征日益关注，因为不同的免疫细胞亚群在胰岛素抵抗和脂肪性肝炎的发生发展中发挥着各自不同的作用。
该方法详细介绍了如何从腹股沟周围脂肪组织和肝脏中分离并定量相对数量的免疫细胞。此外，该方法还展示了如何在非SPF条件下维持高脂饮食喂养的小鼠，以诱导脂肪性肝炎。本方案可用于研究免疫细胞功能，并在微生物环境标准化的条件下，探究不同组织间特定免疫细...

肥胖是一种多因素疾病，也是导致心脏病、中风、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、2型糖尿病（T2D）以及某些癌症的主要风险因素。全球肥胖患病率正在迅速上升。目前，全球有21亿人——接近世界人口的30%——属于肥胖或超重1。与肥胖相关的胰岛素抵抗可导致T2D，当胰腺胰岛β细胞耗竭，无法代偿性地分泌更多胰岛素以维持葡萄糖稳态时，即发生该疾病2。
脂肪组织由多种细胞类型组成，包括脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在肥胖发展过程中，免疫细胞的数量和活性变化可导致肥大性脂肪组织发生低度炎症3，4。具体而言，已有研究发现，过量的能量摄入伴随血糖、甘油三酯和游离脂肪酸水平长期升高，会导致脂肪细胞缺氧、内质网应激、线粒体功能受损以及细胞因子分泌增加，从而激活促炎性的脂肪组织免疫细胞5，6。以往的研究主要集中在先天免疫，但近年来适应性免疫细胞（T细胞和B细胞）也被认为是葡萄糖稳态的重要调节因子。这些细胞具有促炎功能（包括CD8+ T细胞、Th1细胞和B细胞）或以调节功能为主（包括调节性T（Treg）细胞、Th2细胞），可分别加剧或保护机体免受胰岛素抵抗的影响7，8，9。
此外，已有多种机制被提出以解释肥胖如何加剧脂肪性肝炎，包括脂肪组织产生的细胞因子增加10。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病的进展形式，在发达国家构成重要的健康负担，其组织学特征包括肝细胞气球样变、脂质积聚、纤维化及窦周炎症，且可进展为肝硬化、终末期肝病或肝细胞癌。目前已知若干方案（例如缺乏蛋氨酸和胆碱的饮食11）可在非人类动物模型中诱导出类似NASH的肝脏病理改变，但大多数方法未能充分模拟人类NASH及其代谢后果，因为这些方法或需特定基因敲除、非生理性的饮食干预，或缺乏人类NASH典型的胰岛素抵抗。此外，目前对代谢性疾病潜在机制的理解主要基于在标准无特定病原体（SPF）环境中饲养的实验小鼠所开展的研究。这些屏障设施异常洁净，未考虑人类实际接触的微生物多样性，这可能部分解释了动物研究向临床应用转化过程中所遇到的困难12,13,14。
为了研究在模拟人类免疫条件的先进小鼠模型中，胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发展过程中脂肪组织和肝脏内不同免疫细胞亚群的变化，小鼠被饲养在半无菌条件下无屏障系统的独立笼具中。与在抗原暴露条件下饲养的小鼠相比，在高脂饮食（HFD）喂养15周后即已出现类似NASH的肝脏病理改变13。与同龄的无特定病原体（SPF）小鼠相比，这些小鼠出现了大泡性脂肪变性、肝脏免疫细胞浸润及其活化。
本论文描述了一种可靠的流式细胞术分析方法，用于在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中鉴定并计数来自脂肪组织和肝脏的免疫细胞亚群。与RT-PCR或免疫组织化学方法相比，流式细胞术分析能够同时检测单个细胞的多个参数。
总之，我们的研究提供了一种短期高脂饮食（HFD）的小鼠模型，可用于研究胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发生及其潜在机制，且该模型与人类疾病状况具有高度相似性。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;m细胞滤筛&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>1 mL注射器&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 G × 5/8 针头&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞滤筛&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>103127</td><td>AB_493714（BioLegend 货号：103127）</td></tr><tr><td>分析软件&amp;nbsp;</td><td>FlowJo 10.0.8 软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>117309</td><td>AB_313778（BioLegend 货号：117309）</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 KLRG1（MAFA）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>138411</td><td>AB_10645509（BioLegend 货号：138411）</td></tr><tr><td>BV421抗小鼠CD127抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>135023</td><td>AB_10897948（BioLegend 货号：135023）</td></tr><tr><td>BV421 抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>123131</td><td>AB_10901171（BioLegend 货号：123131）</td></tr><tr><td>BV605 抗小鼠 CD279（PD-1）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>135219</td><td>AB_11125371（BioLegend 货号：135219）</td></tr><tr><td>BV605 抗小鼠 NK-1.1 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>108739</td><td>AB_2562273（BioLegend 货号：108739）</td></tr><tr><td>BV650 抗小鼠/人 CD11b 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>101239</td><td>AB_11125575（BioLegend 货号：101239）</td></tr><tr><td>BV711 抗小鼠/人 B220 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>103255</td><td>AB_2563491（BioLegend 货号：103255）</td></tr><tr><td>BV785 抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100749</td><td>AB_11218801（BioLegend 货号：100749）</td></tr><tr><td>C57Bl/6J小鼠，雄性，5周龄&amp;nbsp;</td><td>研究机构&amp;uuml;实验医学基金会（FEM）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>查里特&amp;eacute; - 大学&amp;auml;柏林工业大学医学院</td><td>A119.1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 NB 4G 验证级&amp;nbsp;</td><td>SERVA&amp;nbsp;</td><td>11427513</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>沃辛顿&amp;nbsp;</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>过滤 30&amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Celltrics&amp;nbsp;</td><td>400422316</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗小鼠CD3抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100203</td><td>AB_312660（BioLegend 货号：100203）</td></tr><tr><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td><td>BD-LSR Fortessa&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F4142-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS&amp;nbsp;</td><td>Bioanalytic GmBH&amp;nbsp;</td><td>085021-0500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高脂饮食&amp;nbsp;</td><td>SSNIF</td><td>E15741&amp;ndash;34&amp;nbsp;</td><td>脂肪供能占60 kJ%，19&amp;thinsp;蛋白质提供的能量占总能量的21%&amp;thinsp;碳水化合物供能百分比（kJ%）</td></tr><tr><td>显微解剖剪&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S3146</td><td>用于解剖目的&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD25 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>101903</td><td>AB_312846（BioLegend 货号：101903）</td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 CD62L 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>104417</td><td>AB_313102（BioLegend 货号：104417）</td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 I-A/I-E（MHCII）抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>107629</td><td>AB_2290801（BioLegend 货号：107629）</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 抗小鼠 CD4 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100565</td><td>AB_2563684（BioLegend 货号：100565）</td></tr><tr><td>Percoll 溶液&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD44 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>103031</td><td>AB_2076206（BioLegend 货号：103031）</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 抗小鼠 Gr-1 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>108427</td><td>AB_893561（BioLegend 货号：108427）</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>带细胞滤网盖的圆底管</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>38030</td><td></td></tr><tr><td>TruStain fcX 抗小鼠 CD16/32</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>101301</td><td>AB_312800（BioLegend 货号：101301）</td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>423105</td><td>活力染色&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

肥胖与慢性低度炎症及胰岛素抵抗相关，导致2型糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等慢性代谢性疾病发病率不断上升。近期研究表明，促炎性免疫细胞会浸润到肥胖状态下增大的脂肪组织和肝脏中。鉴于免疫细胞在代谢稳态中的作用日益凸显，迫切需要对这些细胞在2型糖尿病和NASH发展过程中的变化进行定量分析和特征描述。然而，能够诱导出典型人类NASH病理生理特征的动物模型仍较为缺乏。
本文提供了一种详细的实验方案，用于在非特定病原体（non-SPF）条件下饲养高脂饮食（HFD）小鼠至少七周后建立的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）可靠小鼠模型中，鉴定从肝脏和脂肪组织分离的免疫细胞亚群。我们展示了在非SPF条件下小鼠的操作、组织消化，以及通过流式细胞术鉴定巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞亚群的方法。文中提供了来自SPF级HFD小鼠和非SPF小鼠的代表性流式细胞术图谱。为获得可靠且可解释的数据，使用特异性抗体、准确且精确的组织消化方法，以及在流式细胞术实验中进行恰当的设门分析，是关键要素。
通过将小鼠饲养在非SPF条件下并使其非特异性地暴露于微生物抗原，以恢复其生理性抗原暴露的干预措施，可能为研究免疫学改变、饮食诱导的肥胖及其相关长期并发症之间的关联提供一种有效工具。

本方案描述了在饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中，对源自雄性小鼠腹股沟脂肪组织和肝脏的先天性及适应性免疫细胞表面标志物进行表征的方法。在该模型中，通过给予C57Bl/6J小鼠高脂饮食（HFD）并辅以含6%蔗糖的饮水，持续7至15周，以诱导NASH，方法如先前报道13。重要的是，小鼠饲养于半无菌环境中，因此在整个实验过程中持续暴露于环境抗原。以HFD喂养并在SPF条件下饲养的小鼠，以及分别在SPF和非SPF条件下饲养的普通饲料喂养小鼠作为对照组。两组小鼠在喂食HFD 7周后即出现显著的体重增加。体重差异最早在第4周时显现（P &lt; 0.001），并在后续实验周中持续显著。然而，在喂食HFD 7周后，SPF与非SPF小鼠之间的体重增长未表现出显著差异13。对喂食HFD 7周的雄性小鼠，通过胶原酶消化法分离其腹股沟脂肪组织和肝脏中的基质血管组分及免疫细胞。免疫细胞使用荧光标记的一抗进行染色，并通过流式细胞术分析T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞和粒细胞的比例。在小鼠腹股沟脂肪组织中对T细胞亚群的设门策略，包括双联体排...

本文介绍了一种简单且可靠的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导啮齿类动物模型，通过非SPF级动物饲养环境并给予特定高脂饮食实现。我们描述了在暴露于环境微生物的小鼠中鉴定肝脏和脂肪组织免疫细胞亚群的方法，以模拟人类的免疫学状态。

肥胖与慢性低度炎症及胰岛素抵抗相关，导致慢性代谢性疾病的患病率不断上升，……

该方法有助于解答免疫代谢领域中关于免疫细胞在肥胖诱导的脂肪组织炎症以及肝脏组织脂肪性肝炎中所起作用的问题。这些技术已针对非酒精性脂肪性肝炎饮食诱导模型中的脂肪和肝脏免疫细胞分离进行了优化，该模型采用无特定病原体动物饲养环境实现。这些方法有助于加深我们对参与维持代谢稳态的免疫学机制的理解。通常，初次接触该技术的研究人员在提高功能完整且可分离的细胞得率以及设置流式细胞术的正确门控策略方面会遇到困难。为制备脂肪组织单细胞悬液，先用70%乙醇喷洒已处死小鼠的胸部，然后沿肋骨全长在皮肤和腹壁上小心地做一条5至6厘米长的中线切口，以暴露胸膜腔和心脏。使用26号针头，向左心室心尖部注射至少10毫升0.9%生理盐水溶液，并用剪刀打开腹腔。然后，解剖附睾周围脂肪组织并称重。在4摄氏度下，于培养皿中将脂肪组织机械分离成细小碎片，随后将组织碎片转移至50毫升锥形管中。用1毫升含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS冲洗培养皿，并按每克脂肪组织加入3毫升 freshly prepared 脂肪组织消化液至锥形管中。在37摄氏度、每分钟200转的条件下孵育20分钟后，加入5毫升含0.5% BSA的PBS溶液，将脂肪组织消化液置于冰上。用10毫升血清移液管反复吹打溶液数次，并使用推杆将溶液通过100微米细胞筛网。通过离心分离组织组分，用移液管弃去上层漂浮的脂肪细胞组分。将基质血管组分细胞沉淀重悬于1毫升氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，数秒后加入10毫升含2%胎牛血清（FCS）的PBS终止裂解反应。随后，通过离心收集分离的白细胞，并将细胞沉淀重悬于250微升含2% FCS的PBS中进行计数。将肝脏组织收获至预冷的含有PBS的锥形管中，置于冰上，随后使用注射器柱头在4°C的培养皿中对组织进行机械解离。将解剖得到的肝组织碎片转移至含有10毫升预热肝消化液的50毫升离心管中，并用3毫升新鲜肝消化液冲洗培养皿。在37摄氏度、200转/分钟条件下消化20分钟后，加入20毫升HBSS终止消化反应，再用10毫升血清移液管反复吹打组织悬液多次。使用推杆将组织悬液通过100微米细胞筛网过滤，随后通过离心收集肝细胞。将沉淀重悬于20毫升新鲜HBSS中，通过离心去除肝细胞基质。收集上清液用于离心，并将沉淀重悬于10毫升含33%低黏度密度梯度介质的HBSS溶液中。通过密度梯度离心分离肝免疫细胞，并将白细胞沉淀重悬于1毫升ACK裂解缓冲液中。室温孵育四分钟后，加入 10 毫升 HBSS 终止裂解，并将细胞通过 30 微米孔径滤网过滤至 15 毫升离心管中进行离心。随后，将细胞沉淀重悬于 250 微升含 2% FCS 的 PBS 中进行计数。对于分离的白细胞群体的流式细胞术分析，取来自目标组织的最多 3 × 10⁶ 个细胞，加入含 2% FCS 的 PBS 缓冲液 100 微升，分别加入聚苯乙烯荧光激活细胞分选（FACS）管中。每管中加入 10 µL 抗 CD16/CD32 抗体，冰上孵育 10 分钟以阻断非特异性结合，随后每样本加入适量体积的抗体混合物及 1 µL 活性染料，用于区分活细胞与死细胞。在 4°C 避光孵育 20 分钟后，每管加入 2 mL 含 2% FCS 的 PBS 洗涤两次，每次以 300 × g 离心 5 分钟，4°C 条件下进行。然后将沉淀重悬于新鲜的 PBS 加 FCS 溶液中。通过流式细胞术分析细胞时，使用未染色的阴性对照样本设定前向散射光和侧向散射光，并调节流式细胞仪的电压，以识别活的白细胞群体并排除碎片。接下来，在运行实验样本之前，先运行单染对照样本进行多色补偿，每管至少收集5 × 10⁴个事件。然后，导出FCS数据文件进行分析，并针对CD45阳性白细胞设定设门策略，以便识别后续感兴趣的免疫细胞亚群。此处展示了一种代表性门控策略，用于分析小鼠围生殖腺脂肪组织中T细胞亚群，包括双细胞排除及活率染色。首先对CD45阳性白细胞进行CD4和CD8门控，随后对CD44和CD62配体进行门控，以区分初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和效应T细胞。进一步对CD44阳性细胞通过CD127、杀伤细胞凝集素样受体G1以及程序性死亡受体-1进行表型鉴定。此处展示了分析B细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞的设门策略。在非SPF条件下饲养的高脂饮食小鼠中，可检测到较高比例的效应记忆性CD4阳性及CD8阳性细胞；而在第7周时，这些动物的肝内初始CD4阳性与CD8阳性T细胞则明显低于SPF条件下的高脂饮食小鼠。暴露于高脂饮食的小鼠出现严重脂肪变性，包括大脂滴增多导致的大泡性脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变以及小叶结构破坏；而仅有少数SPF小鼠表现出轻微的肝脏脂肪积聚。此外，高脂饮食暴露小鼠的腹股沟周围脂肪组织中自然杀伤细胞的比例较高，而高脂饮食SPF小鼠的树突状细胞比例更高。在进行该操作时，除非另有说明，应始终将细胞置于冰上并避光。现在，您应该已充分了解如何正确制备单细胞悬液，以及如何分离小鼠脂肪组织和肝组织用于流式细胞术实验。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型

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