非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病的一种先进的小鼠模型

这种方法可以帮助回答免疫代谢领域关于免疫细胞对脂肪和肝组织中脂肪性腺炎的肥胖引起的炎症的影响的问题。这些技术已经优化，在通过非特异性无病原体的啮齿动物外壳获得的非酒精性脂肪性脂肪性肝炎饮食诱导模型中分离脂肪和肝免疫细胞。这些方法可以帮助加深我们对维持代谢平衡的免疫机制的理解。

一般来说，这种技术的新个体将难以最大限度地提高功能上可行的分离细胞的产量，并在流式细胞学中建立适当的浇注。为了产生脂肪组织单细胞悬浮液，用70%乙醇喷洒安乐死小鼠的胸部，并小心地通过肋骨笼的整个长度的内膜和腹壁进行五到六厘米的中央切口，以暴露胸腔和心脏。使用 26 量针，将至少 10 毫升 0.9% 盐水溶液注射到左心室的顶点，然后用剪刀打开腹腔。

然后，解剖表观性脂肪组织，并称量它。在将组织片段转移到50毫升的圆锥管中之前，在4摄氏度的培养皿中机械地将脂肪组织分离成细片。在PBS中用0.5%牛血清白蛋白或BSA的1毫升冲洗培养皿，并在管中加入三毫升新鲜准备的脂肪组织消化液。

在37摄氏度和每分钟200次旋转下20分钟后，在PBS中加入5毫升0.5%BSA，并将脂肪消化池放在冰上。使用 10 毫升血清移液器多次对溶液进行三次三化，并使用柱塞通过 100 微米应变器将溶液传递。通过离心分离组织分数，并使用移液器丢弃浮动的脂肪细胞分数。

将血管小分细胞颗粒重新吸收在一毫升氯化铵-钾或CK，解液缓冲液中，几秒钟后用10毫升2%胎儿小牛血清或FCS停止解解反应。然后，通过离心收集分离的白血球，并在PBS中250微升2%FCS中重新暂停颗粒进行计数。在使用注射器盖章在四摄氏度的培养皿中机械分离组织之前，将肝脏收获成冰上PBS的锥形管。

将解剖的肝脏组织片段转移到含有10毫升热肝消化液的50毫升管中，然后用3毫升新鲜肝脏消化液冲洗培养皿。在37摄氏度和每分钟200次旋转下20分钟后，用20毫升的HSS停止消化，用10毫升血清移液器多次三重奏组织浆。使用柱塞通过100微米过滤器传递组织溶液，并通过离心收集肝细胞。

将颗粒重新在20毫升新鲜HSS中，通过离心去除肝细胞基质。收集离心的上一液，在HSSS中33%的低粘度密度梯度介质溶液的10毫升中重新填充颗粒。通过密度梯度离心分离肝脏免疫细胞，将白细胞颗粒重新在一毫升的CK解菌缓冲液中。

在室温下4分钟后，用10毫升HSS停止解解，并通过30微米孔隙过滤器将细胞过滤到15毫升管中进行离心。然后，在 PBS 中 250 微升 2%FCS 中重新暂停颗粒进行计数。对于分离的白细胞群的流动细胞学分析，将PBS中2%FCS的100微升中6个细胞的3倍10，从感兴趣的组织到单个聚苯乙烯荧光活性细胞分选，或FACS，管。

在每个管子上加入10微升的抗CD16/CD32抗体，在冰上阻断任何非特异性结合10分钟，然后用适当体积的抗体混合物染色，每个样品1微升的活体染料，允许活细胞和死细胞分立。在4摄氏度下20分钟后，用两毫升2%FCS加PBS每次洗涤两次，以300倍g的离心机在4摄氏度下洗涤5分钟。然后，在新鲜的 PBS 加 FCS 中重新暂停颗粒。

要通过流式细胞分析细胞，请使用未污染的负对量样本设置正向和侧散射，并调整流式细胞仪的电压，以检测可行的白细胞群体并排除碎屑。接下来，在运行实验样品之前，运行单色控制样本进行多色补偿，收集每管至少五乘十到四个事件。然后，导出FCS数据文件进行分析，并设置CD45阳性白细胞的浇注策略，以便识别随后感兴趣的免疫细胞群。

在这里，显示了T细胞亚细胞的代表性的浇注策略，包括双核歧视和在穆林性脂肪中的生存能力染色。CD45阳性白细胞首先被封闭为CD4和CD8，随后为CD44和CD62配体，以区分天真、中央记忆、效应器记忆和效应器T细胞。然后CD44阳性细胞进一步特征为CD127，杀手细胞卵素样受体G1，和编程死亡-1。

在这里，显示了分析B细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浇注策略。在非SPF条件下的高脂肪饮食小鼠中，可检测到效应者记忆CD4阳性和CD8阳性细胞的较高百分比，而与第7周的SPF高脂肪饮食小鼠相比，这些动物的肝内天真CD4阳性和CD8阳性T细胞的比例要低得多。严重的性肺病，包括大脂液滴的增加，导致大脂球菌，球状炎症，肝细胞膨胀，和破坏球状结构发现在高脂肪饮食暴露的小鼠，而只有一些SPF小鼠显示轻微的脂肪积累在肝脏。

此外，在高脂肪饮食暴露小鼠的食肉脂肪组织中，自然杀伤细胞的比例较高，而高脂肪饮食SPF小鼠的树突状细胞比例较高。尝试此过程时，除非另有说明，否则保持细胞在冰上和黑暗中非常重要。现在，您应该对如何正确准备单细胞悬浮液以及如何分离粘液和肝组织进行流动细胞学实验有了很好的理解。