一种用于初步检测枪击残留物的新型细菌生物传感器的制备与应用

本方案描述了一种独特生物传感器的制备与分析方法，该传感器旨在检测枪击残留物中的化学成分。将生物传感器应用于法医学领域具有创新性，它为法医实验室通常使用的高度专业化的仪器提供了一种低成本、操作简便的替代方案。

所描述的合成生物学方法可用于任何使用标准合成生物学元件的系统。所描述的化学分析适用于表达红色荧光蛋白的任何生物传感器。本次实验操作将由隆德大学的本科生Andrea Soles和Elle Richardson进行演示。

开始此实验步骤时，将10 µL先前分离的J10060质粒DNA加入一个微量离心管中。加入8 µL水，以及各1 µL的EcoRI和NHEL酶（已预先与1 µL缓冲液混合）。对于启动子DNA，将10 µL退火后的启动子DNA序列加入一个新的微量离心管中。

加入8 µL水，以及各1 µL的EcoRI和NHEL酶（已与1 µL缓冲液预先混合）。用移液器吸取10 µL，轻轻吹打样品数次以混匀。将样品在37°C下孵育30分钟。

然后，在80摄氏度下加热并激活酶反应5分钟。将消化后的DNA保存在冷冻箱中，直至准备进行下一步操作。首先，按照文本方案中表一的说明，在冰上使用先前已消化的质粒和启动子DNA，在微量离心管中设置连接反应体系。

确保最后加入T4 DNA连接酶。轻轻吹打混匀反应液，短暂离心。室温孵育10分钟。

然后，在65摄氏度加热并活化十分钟。按照文中的实验方案进行转化。首先，根据文中实验方案的表二配制PCR反应体系。

轻轻吹打混匀反应液。使用黄色枪头刮取转化后的 E.coli 菌落，将部分菌液划线接种到已分区的新 LB-氨苄青霉素琼脂平板上，然后将该枪头插入 PCR 管中。

轻轻振荡移液枪头，使大肠杆菌与PCR反应液混合。对另外三个菌落重复此操作。然后将PCR管放入PCR仪中，按照文本方案中表三所述条件开始热循环反应。

首先，按照文本方案中表四所述，标记相应数量的无菌培养管。向每根试管中加入 2 毫升制备好的培养液。根据表四所述，向试管中加入安利特储备溶液。

然后，将扣帽松散地盖在培养管上，以允许空气进入管内。涡旋振荡每根培养管。随后，将培养管放入摇床培养箱中，在 37 摄氏度、220 转/分钟的条件下振荡培养至少 24 小时。

首先，使用专为去除铅设计的含乙醇擦拭巾擦拭双手的所有表面，包括指间部位。将擦拭巾保存在贴有适当标签且可密封的袋子中，直至进行分析。使用含酒精的擦拭巾清洁所有需检测的较大表面。

使用经乙醇润湿的棉签擦拭待检测的小面积表面。佩戴洁净手套，使用经酒精清洁过的剪刀，从棉布中心剪取约一平方厘米的样本。然后，将剪下的棉布样本或棉签直接放入含有两毫升感应细菌的培养管中，并确保其完全浸没于液体培养基中。

将光谱仪设置为在适合RFP变体的波长下收集荧光发射信号，激发波长设为500纳米。然后使用涡旋振荡器振荡试管。小心地将每份上清液转移至低体积比色皿中，并测定其发射光强度。

使用涡旋振荡器振荡试管。将 200 微升培养液转移至微孔板的孔中。记录每个样本所对应的微孔板孔位。

设置荧光计以在适合RFP变体的波长下采集发射强度。代表性RFP变体的荧光光谱显示了阴性对照以及添加两种不同浓度anilite时的光谱。本研究中所用RFP变体的最大荧光信号在575纳米处观察到。

对同一组溶液，分别使用便携式光谱仪和荧光计收集代表性数据。随着阿尼立特浓度的增加，荧光强度总体呈上升趋势。值得注意的是，在较高浓度下（对于铅传感器而言，高于约 800 十亿分之一），由于铅在如此高浓度下的毒性作用，响应信号会下降。

对使用过的40口径弹壳内部进行乙醇棉签取样分析，可得到原理性验证结果。三种传感器细菌均呈现阳性结果，表明枪击残留物检测为阳性。本实验方案制备的生物传感器还可单独用于检测食品、水或环境样品中的污染。

该技术为研究人员利用标准的合成生物学方法开发针对多种不同化学分析物的生物传感器铺平了道路。操作时应穿戴个人防护装备，分析人员在接触大肠杆菌（E.coli）后应洗手并消毒实验台面。废弃物应进行高压灭菌处理，含有重金属的废弃物须按照相关规定进行处理。